黃 波，徐詠強(qiáng)，梁遠(yuǎn)秋

胸腺瘤(thymoma)是一種呈惰性生長(zhǎng)并且具有潛在惡性的胸腺上皮源性腫瘤，既有非常復(fù)雜的鏡下結(jié)構(gòu)，又存在病理與預(yù)后之間的矛盾，其發(fā)生機(jī)制目前仍不清楚。

上皮細(xì)胞-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)機(jī)制和Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路是目前腫瘤研究的焦點(diǎn)。大量研究顯示在乳腺癌和結(jié)腸癌等多種腫瘤的侵襲過程中均伴有腫瘤細(xì)胞的EMT現(xiàn)象和Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路的改變。胸腺瘤是一種生物學(xué)行為非常復(fù)雜的腫瘤，目前研究認(rèn)為30%～40%的胸腺瘤具有侵襲性。β-catenin基因定位于3q21.3，是Wnt信號(hào)通路中的重要調(diào)節(jié)因子，若其在細(xì)胞中出現(xiàn)異常積聚，則可導(dǎo)致腫瘤具有侵襲性[1-2]。E-cadherin是介導(dǎo)細(xì)胞間黏附的重要細(xì)胞因子，其低表達(dá)或者不表達(dá)被認(rèn)為是EMT過程的標(biāo)志，亦可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲。E-cadherin與β-catenin結(jié)合形成E-cadherin-catenins復(fù)合體，其結(jié)構(gòu)和功能的異常與許多腫瘤的侵襲密切相關(guān)。本組實(shí)驗(yàn)聯(lián)合免疫組化和熒光原位雜交檢測(cè)，旨在探討E-cadherin和β-catenin蛋白及基因的表達(dá)與胸腺瘤侵襲性的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1材料選取2012年～2016年東莞市人民醫(yī)院存檔的胸腺瘤手術(shù)標(biāo)本，即往診斷為A型、AB型、B1型、B2型、B3型及C型胸腺瘤的病例共120例。

1.2方法根據(jù)WHO(2015)胸腺腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)及Masaoka臨床分期方法、組織形態(tài)學(xué)特征、免疫組化標(biāo)記、臨床特點(diǎn)和影像資料，對(duì)120例胸腺瘤按無侵襲性和有侵襲性分組，并對(duì)各組分別行E-cadherin和β-catenin蛋白免疫組化染色(SP法)及E-cadherin和β-catenin基因熒光原位雜交實(shí)驗(yàn)。E-cadherin和β-catenin抗體免疫組化檢測(cè)設(shè)立PBS液代替一抗作陰性對(duì)照，以試劑盒內(nèi)已知的陽性對(duì)照片作陽性對(duì)照。

1.3結(jié)果判定

1.3.1免疫組化染色結(jié)果半定量分析 E-cadherin蛋白主要定位于細(xì)胞膜，即細(xì)胞膜中出現(xiàn)棕黃色顆粒視為E-cadherin蛋白陽性。β-catenin蛋白則以細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒作為陽性標(biāo)志，一般從胞膜、胞質(zhì)和胞核三方面綜合判斷β-catenin蛋白在胞內(nèi)的分布情況：胞膜>70%的細(xì)胞出現(xiàn)陽性則視為正常表達(dá)，反之<70%則視為膜表達(dá)缺失；胞質(zhì)、胞核>10%的細(xì)胞陽性視為胞質(zhì)、胞核陽性表達(dá)，胞質(zhì)、胞核陽性表達(dá)常稱作異位表達(dá)，胞膜表達(dá)缺失及胞質(zhì)、胞核表達(dá)均為異常表達(dá)。一般胞膜正常表達(dá)判為陰性，異常表達(dá)判為陽性。兩者均以陽性細(xì)胞百分比結(jié)合染色強(qiáng)度進(jìn)行綜合計(jì)分。(1)染色強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：無著色為0分；淡黃色為1分；棕黃色為2分；棕褐色為3分。(2)陽性細(xì)胞數(shù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：陽性細(xì)胞數(shù)≤5%為0分；6%～25%為1分；26%～50%為2分；51%～75%為3分，>75%為4分。將兩項(xiàng)得分結(jié)果相乘：0分為陰性(-)，1～4為弱陽性(+)，5～8分為中度陽性(2+)，9～12分為強(qiáng)陽性(3+)。

1.3.2FISH實(shí)驗(yàn)結(jié)果判讀 E-cadherin基因結(jié)果判定：(1)閾值設(shè)定：隨機(jī)選取10例以上陰性對(duì)照樣本作為陰性質(zhì)控片，每張陰性質(zhì)控片隨機(jī)計(jì)數(shù)至少100個(gè)細(xì)胞，分別計(jì)算出各類型FISH陽性細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)目及百分比，同時(shí)統(tǒng)計(jì)出百分比的標(biāo)準(zhǔn)差和平均值，陰性閾值則設(shè)為平均值+3倍的標(biāo)準(zhǔn)差。(2)計(jì)數(shù)方法：計(jì)數(shù)至少100個(gè)細(xì)胞，出現(xiàn)2R2G信號(hào)類型的細(xì)胞記為FISH陰性細(xì)胞；出現(xiàn)nR2G(n≤1)信號(hào)類型的細(xì)胞記為FISH陽性細(xì)胞。①若出現(xiàn)FISH陽性細(xì)胞的比例大于陰性閾值時(shí)，判斷為FISH陽性；②若出現(xiàn)FISH陽性細(xì)胞的比例小于陰性閾值時(shí)，判斷為FISH陰性；③如果FISH陽性的細(xì)胞比例與陰性閾值相等，則需加大計(jì)數(shù)的數(shù)目或者分析整張切片，如果仍然比陰性閾值小，則判為FISH陰性；否則視為FISH陽性。

β-catenin基因結(jié)果判定：β-catenin基因的探針采用綠色標(biāo)記，正常細(xì)胞胞核中綠色的點(diǎn)為2個(gè)，當(dāng)綠色點(diǎn)>2個(gè)時(shí)，說明該基因有擴(kuò)增。高倍鏡下計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞核，其中標(biāo)記基因信號(hào)數(shù)≥3的細(xì)胞核數(shù)目>40個(gè)，記為該病例擴(kuò)增；11～40個(gè)之間記為臨界擴(kuò)增；0～10個(gè)之間則記為無擴(kuò)增。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。對(duì)組織中E-cadherin和β-catenin蛋白和基因的表達(dá)水平在無侵襲性和有侵襲性胸腺瘤中行χ2檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1鏡檢無侵襲性胸腺瘤大多為A、AB和B1型(圖1)。A型胸腺瘤幾乎無淋巴細(xì)胞，瘤細(xì)胞表現(xiàn)為卵圓形或梭形，且細(xì)胞核仁不明顯，腫瘤細(xì)胞呈實(shí)性片塊狀或車輻狀排列。AB型胸腺瘤組織學(xué)上呈彌散分布的結(jié)節(jié)狀，通常由淋巴細(xì)胞少的A型以及富含淋巴細(xì)胞的B型胸腺瘤混合而成。在A型成分區(qū)可見到所有A型胸腺瘤的特征，而B型成分區(qū)則是獨(dú)特的。B型成分區(qū)瘤細(xì)胞通常由小多角形上皮細(xì)胞組成，核小而圓。B1型胸腺瘤上皮細(xì)胞小且少，異型性通常不明顯，周圍可見非腫瘤性的T淋巴細(xì)胞環(huán)繞，可見胸腺小體。侵襲性胸腺瘤大多為B2、B3及C型(圖2)。B2胸腺瘤呈纖細(xì)分隔的粗大小葉，部分類似于正常胸腺皮質(zhì)小葉結(jié)構(gòu)，呈多角形，胞核大，染色質(zhì)較稀疏，可見明顯的中位核仁。B3及C型胸腺瘤在組織學(xué)上腫瘤細(xì)胞呈小葉狀，通常由較厚的纖維及透明樣變的間隔分隔開，上皮內(nèi)的淋巴細(xì)胞稀少，瘤細(xì)胞形成表皮樣結(jié)構(gòu)或者呈模糊的實(shí)性片狀。

2.2E-cadherin和β-catenin蛋白在胸腺瘤中的表達(dá)E-cadherin蛋白在無侵襲性和有侵襲性胸腺瘤中的陽性率分別為87.69%(57/65)和58.18%(32/55)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。β-catenin蛋白在無侵襲性和有侵襲性胸腺瘤中的陽性率分別為12.31%(8/65)和43.64%(24/55)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表1，圖3～6)。

表1 E-cadherin、β-catenin蛋白在有侵襲性和無侵襲性胸腺瘤中的表達(dá)

2.3E-cadherin及β-catenin基因表達(dá)E-cadherin基因在無侵襲性和有侵襲性胸腺瘤中表達(dá)下調(diào)或缺失分別為15.38%(10/65)和56.36%(31/55)，統(tǒng)計(jì)分析顯示，E-cadherin基因在無侵襲性和有侵襲性胸腺瘤中的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。β-catenin基因在無侵襲性和有侵襲性胸腺瘤中的表達(dá)擴(kuò)增率分別為26.15%(17/65)和58.18%(32/55)，統(tǒng)計(jì)分析顯示，β-catenin基因在無侵襲性和有侵襲性胸腺瘤中的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表2，圖7、8)。

表2 E-cadherin、β-catenin基因在有侵襲性和無侵襲性胸腺瘤中的表達(dá)

3 討論

本組120例胸腺瘤，按照WHO(2015)胸腺腫瘤新分類標(biāo)準(zhǔn)，綜合胸腺瘤鏡下特點(diǎn)、免疫標(biāo)記、Masaoka臨床分期標(biāo)準(zhǔn)、臨床表現(xiàn)、影像資料以及相關(guān)文獻(xiàn)將其分類，其中侵襲性胸腺瘤55例，無侵襲性胸腺瘤65例。胸腺瘤患者的預(yù)后水平與腫瘤是否發(fā)生侵襲關(guān)系密切，大量研究表明，有侵襲性的胸腺瘤患者預(yù)后水平明顯比無侵襲性的胸腺瘤患者差，無侵襲性的胸腺瘤患者5年和10年生存率分別為75%和63%，而有侵襲性胸腺瘤患者的5年和10年生存率分別為50%和30%[3-5]。本實(shí)驗(yàn)聯(lián)合免疫組化及熒光原位雜交技術(shù)分別檢測(cè)E-cadherin、β-catenin蛋白和基因的表達(dá)，以期為有侵襲性和無侵襲性胸腺瘤的診斷和鑒別診斷提供有效的生物學(xué)指標(biāo)。本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，E-cadherin、β-catenin蛋白和基因的表達(dá)與胸腺瘤的侵襲性有顯著相關(guān)性。

①②③④⑤⑥⑦⑧

圖1無侵襲性胸腺瘤(AB型)：腫物由淋巴細(xì)胞較少的A型成分及富于淋巴細(xì)胞的B型成分構(gòu)成，A型成分細(xì)胞呈梭形，B型成分細(xì)胞呈小多角形，核較小，圓形或卵圓形，核仁不明顯圖2有侵襲性胸腺瘤(B3型)：由呈巢片狀生長(zhǎng)的上皮樣細(xì)胞和淋巴樣細(xì)胞混合增生構(gòu)成，上皮樣細(xì)胞核呈空泡狀，核仁明顯圖3無侵襲性胸腺瘤中E-cadherin蛋白陽性，SP法圖4有侵襲性胸腺瘤中E-cadherin蛋白陽性，SP法圖5無侵襲性胸腺瘤中β-catenin蛋白陽性，SP法圖6有侵襲性胸腺瘤中β-catenin蛋白陽性，SP法圖7有侵襲性胸腺瘤組織中E-cadherin基因陽性，F(xiàn)ISH圖8有侵襲性胸腺瘤組織β-catenin基因擴(kuò)增，F(xiàn)ISH

近年隨著分子遺傳學(xué)研究在胸腺瘤分類和鑒別診斷方面的不斷應(yīng)用，使得分子生物學(xué)在胸腺瘤的診斷及鑒別診斷方面的地位日益突顯[6]。相關(guān)研究證實(shí)，E-cadherin基因低表達(dá)或不表達(dá)及β-catenin基因高拷貝數(shù)擴(kuò)增表達(dá)可促進(jìn)多種腫瘤的侵襲。E-cadherin和β-catenin兩種蛋白在胸腺瘤中的表達(dá)已有相關(guān)報(bào)道，然而這兩種基因在胸腺瘤中的表達(dá)情況則尚未見相關(guān)報(bào)道。

E-cadherin作為一種鈣依賴性細(xì)胞跨膜糖蛋白，近年來隨著研究的不斷深入，E-cadherin已成為探討瘤細(xì)胞侵襲性的熱點(diǎn)。E-cadherin是一種抑癌基因，位于人類16號(hào)染色體長(zhǎng)臂16q22.1，其編碼的氨基酸有723～748個(gè)[7]。E-cadherin幾乎在所有上皮組織中呈不同程度的表達(dá)，在細(xì)胞之間的連接中起關(guān)鍵性作用，其能夠影響腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞之間的黏附，因此其表達(dá)水平下降將導(dǎo)致腫瘤的侵襲，從而影響患者預(yù)后[8-9]。如今，E-cadherin抑制癌細(xì)胞侵襲這一觀點(diǎn)已經(jīng)得到廣泛認(rèn)可[10-11]。E-cadherin表達(dá)異常可通過多種機(jī)制來促使腫瘤發(fā)生侵襲[12-13]：(1)E-cadherin表達(dá)異常將降低瘤細(xì)胞之間的黏附能力，使得腫瘤細(xì)胞脫離瘤體而發(fā)生侵襲；(2)E-cadherin表達(dá)異常可以促進(jìn)人體基質(zhì)金屬蛋白酶的分泌和基質(zhì)降解，加快細(xì)胞的侵襲；(3)脫離瘤體的細(xì)胞無接觸抑制作用，將不再與相鄰細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)生長(zhǎng)因子，因此得到的生長(zhǎng)刺激信號(hào)將會(huì)更多；(4)瘤細(xì)胞與瘤體分離后發(fā)生侵襲能夠得到更多營(yíng)養(yǎng)。

胸腺瘤的發(fā)生、發(fā)展是多因素參與的復(fù)雜過程。近年來，隨著分子遺傳學(xué)及分子生物學(xué)等學(xué)科的飛速發(fā)展以及檢測(cè)方法的日新月異，發(fā)現(xiàn)很多與胸腺瘤發(fā)病相關(guān)的基因，這對(duì)于我們更進(jìn)一步認(rèn)識(shí)胸腺瘤的發(fā)病機(jī)制、界定胸腺瘤的組織分型和分級(jí)、對(duì)患者進(jìn)行生物治療以及判斷患者預(yù)后提供新方向。本組實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，E-cadherin基因在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)強(qiáng)度比在正常細(xì)胞中低，并且E-cadherin基因的表達(dá)強(qiáng)度與腫瘤的侵襲性密切相關(guān)。實(shí)驗(yàn)過程中采用熒光原位雜交技術(shù)檢測(cè)E-cadherin基因時(shí)采取了紅綠雙探針，以此來做內(nèi)對(duì)照，即紅色探針是本組的目的基因，綠色探針是對(duì)照基因，且綠色對(duì)照基因位于紅色目的基因的隔壁。當(dāng)綠色信號(hào)正常而紅色信號(hào)減少時(shí)，認(rèn)為基因表達(dá)下調(diào)或缺失，當(dāng)然要排除假陰性；而當(dāng)綠色信號(hào)不足2個(gè)時(shí)，則該細(xì)胞不納入計(jì)數(shù)范圍。這些發(fā)現(xiàn)提示：E-cadherin參與的EMT機(jī)制在胸腺瘤的侵襲過程中有著非常重要的作用。綜合分析，作者認(rèn)為E-cadherin參與胸腺瘤的侵襲進(jìn)程，其在有侵襲性和無侵襲性胸腺瘤的鑒別診斷中有一定的輔助意義。

β-catenin是由原癌基因編碼的一種細(xì)胞骨架蛋白，位于染色體3q21.3，全長(zhǎng)23.2 KB，含16個(gè)外顯子，其相對(duì)分子質(zhì)量為9.3×104。β-catenin是一種多功能蛋白質(zhì)，參與細(xì)胞間的黏附和WNT信號(hào)的傳導(dǎo)。β-catenin可以與E-cadherin的胞內(nèi)區(qū)相互作用并參與E-cadherin黏附功能的調(diào)節(jié)，因此β-catenin發(fā)生故障會(huì)使E-cadherin參與細(xì)胞黏附失去穩(wěn)定性。此外，其還可以與E-cadherin胞內(nèi)區(qū)組成E-cadherin/cat復(fù)合體，這也是其發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的前提條件。Wnt信號(hào)通路包括包膜卷曲蛋白、Wnt蛋白、E-cadherin、β-catenin、GSK-3p、Axin、APC、TCf以及松散蛋白等，β-catenin在此通路中有著重要的地位，其不但參與信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，還參與細(xì)胞間的黏附。此外，β-catenin還可激活EMT過程中的某些相關(guān)基因，如Fibronectin和Slug等，加速瘤細(xì)胞的EMT進(jìn)程。多項(xiàng)研究結(jié)果顯示，在結(jié)腸癌、肝癌、肺癌等多種腫瘤的侵襲過程中均可見到β-catenin在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中的異常蓄積[14-15]。

本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化法檢測(cè)β-catenin蛋白和熒光原位雜交技術(shù)檢測(cè)β-catenin基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)β-catenin蛋白和基因在有侵襲性和無侵襲性胸腺瘤中表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，作者認(rèn)為β-catenin對(duì)有侵襲性和無侵襲性胸腺瘤的鑒別診斷有一定的輔助意義。

綜上所述，本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，免疫組化法檢測(cè)E-cadherin和β-catenin蛋白及熒光原位雜交技術(shù)檢測(cè)E-cadherin和β-catenin基因，有助于無侵襲性和有侵襲性胸腺瘤的鑒別診斷。

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