劉 燕，趙 鵬，于文娟，王 強(qiáng)，陳云慶，鄒玉偉，李玉軍，張 偉

不同組織類型的腎腫瘤形態(tài)學(xué)上有重疊，彼此之間易混淆。研究表明，腎腫瘤的病理組織分型具有重要的預(yù)后意義[1-2]，因此準(zhǔn)確的病理診斷及鑒別診斷非常重要。目前用于輔助診斷和鑒別診斷腎腫瘤的免疫組化抗體種類繁多，但特異性和敏感性報(bào)道不一，為進(jìn)一步豐富腎腫瘤的免疫組化診斷譜，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用組織芯片及免疫組化技術(shù)檢測常見不同組織類型腎腫瘤中Cyclin D1和claudin7的表達(dá)，探討兩種抗體對(duì)腎腫瘤鑒別診斷的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1病例來源收集青島大學(xué)附屬醫(yī)院和解放軍第401醫(yī)院2010年1月～2015年12月連續(xù)性腎腫瘤358例，所有病例均由兩名以上經(jīng)驗(yàn)豐富的病理?？漆t(yī)師重新閱片，最終明確診斷、無異議的腎腫瘤326例，包括腎嗜酸細(xì)胞瘤(renal oncocytoma, RO)62例、透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌(clear cell renal cell carcinoma, CCRCC)147例、嫌色細(xì)胞癌(chromophobe renal cell carcinoma, ChRCC)51例、乳頭狀腎癌(papillary renal cell carcinoma, PRCC)35例、透明細(xì)胞管狀乳頭狀腎癌(clear cell tubulopapillary renal cell carcinoma, CCTPRCC)16例和Xp11.2易位/TFE3基因融合相關(guān)性腎癌15例。另選取20例腫瘤旁腎組織作為對(duì)照，分析正常腎組織中兩種抗體的表達(dá)。

1.2方法對(duì)所有病例的HE切片進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，鏡下將所需的典型病變區(qū)域用油性筆標(biāo)記，然后將該切片和石蠟組織塊進(jìn)行比較，依靠HE切片上的標(biāo)記在石蠟組織塊上的同一部位也做一標(biāo)記；利用組織芯片制作儀(Tissue Arrayer，Beecher Instrument, USA)的鉆孔芯針在供體蠟塊穿取直徑為1.5 mm的組織芯，依次插入到受體蠟塊中，制成組織芯片蠟塊。用切片機(jī)對(duì)組織芯片蠟塊3 μm厚連續(xù)切片，對(duì)組織微陣列中的每個(gè)組織片逐一在顯微鏡下進(jìn)行仔細(xì)觀察與比對(duì)，結(jié)果成功構(gòu)建309例，17例不合格標(biāo)本被除外。空位Maker選用扁桃體組織，位于芯片的一角。

1.3免疫組化染色各組病例均行Cyclin D1(鼠抗人單克隆，SP4，1 ∶100，Spring公司)和claudin7(兔抗人多克隆，1 ∶200，Abcam公司)免疫組化染色，同批次設(shè)陽性對(duì)照和陰性對(duì)照。免疫組化染色采用EnVision兩步法，在Roche BenchMark XT全自動(dòng)免疫組化機(jī)上進(jìn)行。

1.4結(jié)果判定Cyclin D1陽性表達(dá)于腫瘤細(xì)胞核，而claudin7表達(dá)于細(xì)胞膜和(或)胞質(zhì)，呈棕黃色細(xì)顆粒狀。按陽性細(xì)胞所占百分比并參考著色強(qiáng)度確定分級(jí)如下：無明顯陽性細(xì)胞為陰性(-)，陽性細(xì)胞數(shù)<25%為弱陽性(1+)，25%～50%為中度陽性(2+)，>50%為強(qiáng)陽性(3+)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，應(yīng)用χ2檢驗(yàn)及Fisher檢驗(yàn)分析比較Cyclin D1和claudin7在不同類型腎腫瘤中的表達(dá)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1CyclinD1和claudin7在腫瘤旁腎組織中的表達(dá)20例腫瘤旁腎組織中，僅2例顯示Cyclin D1在腎小管及腎小球毛細(xì)血管散在陽性；而claudin7在腎遠(yuǎn)端小管和集合管恒定細(xì)胞膜陽性，6例同時(shí)伴有近端小管胞質(zhì)陽性。

2.2CyclinD1在不同類型腎腫瘤中的表達(dá)Cyclin D1在RO和ChRCC中的陽性率分別為86.2%(50/58)和8.2%(4/49)，前者均為中等以上陽性(22例2+，28例3+)；CCRCC(70.0%，98/140)、CCTPRCC(71.4%，10/14)和Xp11.2易位性腎細(xì)胞癌(42.9%，6/14)中均有不同程度表達(dá)；34例PRCC中僅有3例陽性，均表現(xiàn)為散在或灶狀陽性。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，Cyclin D1在RO與ChRCC、RO與PRCC、CCRCC與ChRCC、PRCC與Xp11.2易位性腎細(xì)胞癌中的表達(dá)相比，組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1，圖1)。

2.3claudin7在不同類型腎腫瘤中的表達(dá)49例ChRCC中43例細(xì)胞膜陽性(87.8%)，其中35例中等以上陽性(17例2+，18例3+)；58例RO中12例陽性(20.7%，10例2+，2例3+)，但均定位于胞質(zhì)；34例PRCC中17例陽性(50.0%，14例定位于胞膜，3例定位于胞質(zhì))，其中15例表現(xiàn)為中等以上陽性；14例CCTPRCC中8例(57.1%)陽性，均定位于細(xì)胞膜；而在CCRCC和Xp11.2易位性腎細(xì)胞癌中很少表達(dá)，陽性率分別為8.6%(12/140)和14.3%(2/14)。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，ChRCC與RO，CCRCC與ChRCC、CCTPRCC，PRCC與Xp11.2易位性腎細(xì)胞癌相比，各組間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05，表2，圖2)。

表1 Cyclin D1在常見腎腫瘤中的表達(dá)

RO.腎嗜酸細(xì)胞瘤；ChRCC.嫌色細(xì)胞癌；CCRCC.透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌；PRCC.乳頭狀腎癌；Xp11.2.Xp11.2易位性腎細(xì)胞癌；CCTPRCC.透明細(xì)胞管狀乳頭狀腎癌; RO與ChRCC相比，χ2=64.72，P<0.000 1；RO與PRCC相比，χ2=52.56,P<0.000 1; CCRCC與ChRCC相比，χ2=55.87，P<0.000 1；PRCC與Xp11.2易位性腎細(xì)胞癌相比，χ2=4.28，P<0.05

表2 claudin7在常見腎腫瘤中的表達(dá)

RO.腎嗜酸細(xì)胞瘤；ChRCC.嫌色細(xì)胞癌；CCRCC.透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌；PRCC.乳頭狀腎癌；Xp11.2.Xp11.2基因易位性腎細(xì)胞癌；CCTPRCC.透明細(xì)胞管狀乳頭狀腎癌；RO與ChRCC相比，χ2=47.82，P<0.000 1；CCRCC與ChRCC相比，χ2=11.30，P<0.000 1；CCRCC與CCTPRCC相比，χ2=26.57，P<0.000 1；PRCC與Xp11.2易位性腎細(xì)胞癌相比，χ2=45.29，P<0.05

2.4CyclinD1和claudin7聯(lián)合應(yīng)用在不同類型腎腫瘤中的表達(dá)58例RO中40例(69.0%)表現(xiàn)為Cyclin D1陽性/claudin7陰性，而Cyclin D1陰性/claudin7陽性僅2例(3.4%)；49例ChRCC中41例(83.7%)表現(xiàn)為Cyclin D1陰性/claudin7陽性，而Cyclin D1陽性/claudin7陰性僅2例(4.9%)，在RO和ChRCC的鑒別中，Cyclin D1陽性/claudin7陰性此種免疫表型對(duì)于RO的敏感性和特異性分別為69.0%和95.9%，而Cyclin D1陰性/claudin7陽性對(duì)ChRCC診斷的敏感性和特異性分別為83.7%和96.6%；CCRCC主要表現(xiàn)為Cyclin D1陽性/claudin7陰性(92/140，65.7%)，其次為Cyclin D1陰性/claudin7陰性(36/140，25.7%)；14例CCTPRCC中有6例Cyclin D1陽性/claudin7陽性、4例Cyclin D1陽性/claudin7陰性，在CCRCC和CCTPRCC的鑒別中，Cyclin D1陽性/claudin7陰性此種免疫表型對(duì)于CCRCC的敏感性和特異性分別為65.7%和71.4%，而Cyclin D1陽性/claudin7陽性對(duì)CCTPRCC診斷的敏感性和特異性分別為42.9%和95%。PRCC中有17例表現(xiàn)為Cyclin D1陰性/claudin7陰性，其次14例為Cyclin D1陰性/claudin7陽性；14例Xp11.2易位性腎細(xì)胞癌中有8例Cyclin D1陰性/claudin7陰性、4例Cyclin D1陽性/claudin7陽性(表3)。

①A①B①C①D②A②B②C②D

圖1A.Cyclin D1在嗜酸細(xì)胞瘤中彌漫強(qiáng)陽性；B.Cyclin D1在嫌色細(xì)胞癌中陰性；C.Cyclin D1在透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌中彌漫強(qiáng)陽性；D.Cyclin D1在透明乳頭狀腎細(xì)胞癌中彌漫強(qiáng)陽性，EnVision兩步法圖2A.claudin7在腎嗜酸細(xì)胞瘤中陰性；B.claudin7在腎嫌色細(xì)胞癌中彌漫強(qiáng)陽性膜表達(dá)；C.claudin7在乳頭狀腎癌中彌漫強(qiáng)陽性膜表達(dá)；D.claudin7在透明細(xì)胞乳頭狀腎癌中彌漫強(qiáng)陽性膜表達(dá)，EnVision兩步法

3 討論

腎腫瘤是一類異質(zhì)性很高的腫瘤，不同腫瘤之間細(xì)胞形態(tài)可非常相似，如諸多腫瘤均可以表現(xiàn)為透明細(xì)胞或嗜酸細(xì)胞等，單純依靠形態(tài)學(xué)有時(shí)很難鑒別，免疫組化染色具有重要的輔助作用。有關(guān)Cyclin D1和claudin7聯(lián)合檢測在大宗腎腫瘤病例中的研究報(bào)道較少，現(xiàn)就兩者在常見腎腫瘤中的表達(dá)以及應(yīng)用價(jià)值進(jìn)行討論。

表3 Cyclin D1和claudin7聯(lián)合檢測在不同腎腫瘤中的表達(dá)

RO.腎嗜酸細(xì)胞瘤；ChRCC.嫌色細(xì)胞癌；CCRCC.透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌；PRCC.乳頭狀腎癌；Xp11.2.Xp11.2基因易位性腎細(xì)胞癌；CCTPRCC.透明細(xì)胞管狀乳頭狀腎癌

Cyclin D1為細(xì)胞周期蛋白家族中的重要成員之一，在細(xì)胞周期G1/S轉(zhuǎn)換中發(fā)揮重要的正性調(diào)控作用，其含量隨細(xì)胞周期而呈周期性變化。正常組織中Cyclin D1表達(dá)量很少甚至不表達(dá)，而在乳腺癌[3]、非小細(xì)胞肺癌[4]、甲狀腺乳頭狀癌[5]等許多惡性腫瘤中存在蛋白過表達(dá)現(xiàn)象。Cyclin D1高表達(dá)可能與基因改變(包括染色體易位、基因擴(kuò)增和基因組多態(tài)性)、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、翻譯后蛋白穩(wěn)定等多種機(jī)制有關(guān)[6]。claudin7是claudins家族成員之一，claudin蛋白屬于緊密連接蛋白家族，是上皮細(xì)胞間緊密連接的主要結(jié)構(gòu)之一，迄今已發(fā)現(xiàn)有24個(gè)亞型[7]。Cyclin D1在腫瘤旁腎組織中很少表達(dá)，本組20例中僅2例見腎小管上皮細(xì)胞及腎小球的毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞散在陽性。而claudin7主要在腎遠(yuǎn)端腎小管和集合管中表達(dá)，不同節(jié)段的腎小管claudin7陽性表達(dá)定位不同(胞膜或胞質(zhì))，推測可能與腎小管的滲透功能狀態(tài)有關(guān)。

本組實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Cyclin D1和claudin7在RO和ChRCC中的表達(dá)差異有顯著性。Cyclin D1在86.2%的RO中陽性(50/58，均為中等以上陽性)，而ChRCC中僅有8.2%(4/49)陽性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。相反，claudin7在RO中很少表達(dá)(20.7%，12/58)，且均表現(xiàn)為胞質(zhì)陽性，而ChRCC中的陽性率為87.8%(43/49)，均為中到強(qiáng)的細(xì)胞膜著色，兩者之間相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.000 1)。統(tǒng)計(jì)分析顯示，Cyclin D1陽性/claudin7陰性對(duì)于RO的敏感性和特異性分別為69.0%和95.9%，而Cyclin D1陰性/claudin7陽性對(duì)ChRCC的敏感性和特異性分別為83.7%和96.6%。Sukov等[8]應(yīng)用免疫組化及FISH技術(shù)檢測63例RO和36例ChRCC中Cyclin D1蛋白的表達(dá)及CCND1基因重排，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所有ChRCC(0/36)均無Cyclin D1過表達(dá)及CCND1基因異常，然而33%(21/63)的RO存在Cyclin D1過表達(dá)，其中13例(62%)出現(xiàn)CCND1分離信號(hào)，42例無Cyclin D1過表達(dá)的病例中僅1例出現(xiàn)CCND1分離信號(hào)。關(guān)于Cyclin D1在RO中過表達(dá)的機(jī)制目前尚不清楚，一些個(gè)案報(bào)道和小宗病例研究發(fā)現(xiàn)部分RO出現(xiàn)染色體11q13上的CCND1基因易位，推測是導(dǎo)致Cyclin D1過表達(dá)的原因[9-10]。然而，部分RO免疫組化Cyclin D1過表達(dá)的病例，經(jīng)FISH證實(shí)并無CCND1基因重排，表明Cyclin D1在RO中過表達(dá)除與CCND1基因易位或倒置外，可能還有其他機(jī)制。諸多文獻(xiàn)報(bào)道，claudin7在ChRCC中有較高的陽性率，如Lechpammer等[11]發(fā)現(xiàn)94%的ChRCC呈claudin7中等和強(qiáng)陽性，而RO僅55%陽性(P=0.041)；Osunkoya等[12]報(bào)道，7/11例ChRCC出現(xiàn)claudin7細(xì)胞膜表達(dá)和claudin8陰性的免疫組化模式，而17例RO僅1例出現(xiàn)此種表達(dá)模式(對(duì)ChRCC的敏感性為63%，特異性為84%，陽性預(yù)測值為88%)；claudin7陰性和claudin8細(xì)胞質(zhì)陽性的免疫組化表達(dá)模式在10/17例RO中出現(xiàn)，而所有ChRCC(0/11)均無此種表達(dá)模式(對(duì)RO的敏感性為59%，特異性為100%，陽性預(yù)測值為100%)。國內(nèi)楊敬等[13]報(bào)道claudin7在ChRCC和RO的陽性率分別為95.83%(23/24)和41.18%(7/17)。因此，Cyclin D1和claudin7聯(lián)合檢測以及后者的表達(dá)定位模式對(duì)于RO和ChRCC的鑒別具有重要意義。

Cyclin D1在其他不同組織類型的腎細(xì)胞癌中表達(dá)不一。Hedberg等[14]報(bào)道，53%(74/192)的CCRCC存在Cyclin D1高表達(dá)，其高表達(dá)與腫瘤具有較低的核分級(jí)、體積較小相關(guān)，并且陽性患者比陰性患者具有更長的生存期，但PRCC(10%，3/28)和ChRCC(21%，3/14)卻很少表達(dá)。Calderaro等[15]報(bào)道所有的腎髓質(zhì)癌均呈Cyclin D1陽性(6/6)。Leroy等[16]報(bào)道Cyclin D1在所有的CCTPRCC中均呈陽性，42例中有35例表現(xiàn)為彌漫強(qiáng)陽性(83%，35/42)，7例表現(xiàn)為灶狀陽性。本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Cyclin D1在70%的CCRCC(98/140)、57%的CCTPRCC(8/14)和43%的Xp11.2易位性腎細(xì)胞癌(6/14)中均有表達(dá)，但PRCC中卻很少表達(dá)(3/34，均為灶狀陽性)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，CCRCC與ChRCC、Xp11.2易位性腎細(xì)胞癌(P均<0.01)，PRCC與Xp11.2易位性腎細(xì)胞癌(χ2=4.28，P=0.039)，組間相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；但Cyclin D1在CCRCC與CCTPRCC的表達(dá)相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Choi等[17]應(yīng)用免疫組化技術(shù)檢測239例腎腫瘤中claudin7的表達(dá)，結(jié)果顯示其在ChRCC、RO、PRCC和CCRCC中的陽性率分別為95%、72.7%、34.5%和3.4%，其對(duì)ChRCC診斷的敏感性和特異性分別為95.0%和92.3%。Hornsby等[18]發(fā)現(xiàn)，claudin7在67%(24/36)的ChRCC胞膜陽性，與CCRCC(0，0/42)、PRCC(28%，8/29)和RO(26%，10/43)相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，提出claudin7膜染色可作為嫌色細(xì)胞癌和其他腎腫瘤，包括形態(tài)學(xué)相似的嗜酸細(xì)胞瘤鑒別的候選免疫指標(biāo)之一。本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，claudin7除在ChRCC中有較高的陽性率外，在PRCC(50%，17/34)和CCTPRCC(57%，8/14)中也常有表達(dá)，而CCRCC(12/140，8.6%)和Xp11.2易位性腎細(xì)胞癌(2/14，14.3%)中卻很少表達(dá)。統(tǒng)計(jì)分析顯示，claudin7在CCRCC與ChRCC、CCTPRCC(χ2=110.3、26.57，P均<0.000 1)，PRCC與Xp11.2易位性腎細(xì)胞癌(χ2=5.29，P<0.05)，各組間相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。聯(lián)合檢測Cyclin D1和claudin7發(fā)現(xiàn)，RO主要表現(xiàn)Cyclin D1陽性/claudin7陰性，相反，ChRCC為Cyclin D1陰性/claudin7陽性；CCRCC、CCTPRCCC、Xp11.2易位性腎癌分別表現(xiàn)為Cyclin D1陽性/claudin7陰性、Cyclin D1陽性/claudin7陽性和Cyclin D1陰性/claudin7陰性。

綜上所述，Cyclin D1和claudin7在不同類型腎腫瘤中的表達(dá)，差異有顯著性，聯(lián)合應(yīng)用對(duì)于某些形態(tài)學(xué)容易混淆的腎腫瘤組織學(xué)分型具有重要作用。

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