楊 榮，尚麗娜，馬 桂，宋麗娟，楊春霞，劉 瑋，何 欣，康雅瓊，羅 雁，熊海科

據(jù)《2012年中國腫瘤登記年報》數(shù)據(jù)資料，我國食管癌總發(fā)病率為22.14/10萬，病死率為16.77/10萬，居癌癥死因的第2位。食管癌地域性發(fā)布特征明顯，甘肅省是上消化道腫瘤高發(fā)區(qū)，現(xiàn)階段我國還不能做到從病因進行一級預防，早診早治是降低食管癌發(fā)病率及病死率的最根本手段。本項目從前期實驗中篩選出的11個與早期食管鱗狀細胞癌密切相關(guān)的基因中選取備選基因CHMP4A及TSPYL-2基因進行臨床驗證，探討CHMP4A、TSPYL-2基因在食管早期癌變過程中發(fā)揮的作用及其初步機制，并探究其表達與食管癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系，揭示兩者在食管癌變中的意義，為實現(xiàn)食管癌早診早治提供新思路及途徑。

1 材料與方法

1.1材料收取甘肅省腫瘤醫(yī)院2013年1月～2014年12月經(jīng)病理確診的食管鱗狀細胞癌手術(shù)切除標本，選擇既往無其他惡性腫瘤病史、未行放療或化療患者標本、以及癌組織距上切緣≥5 cm標本，排除上切緣陽性、合并或其他病理類型標本、患者或家屬拒絕標本收集者。納入符合上述要求患者共100例，進行Lugol液染色。標本離體后15 min內(nèi)進行取材。剖開食管腔，用生理鹽水噴灑洗凈食管，然后均勻噴灑Lugol液，5 min后再用生理鹽水洗去食管黏膜表面Lugol液，觀察染色結(jié)果。分別收集主癌灶、主癌灶以外Lugol液染色陽性區(qū)、正常食管黏膜染色區(qū)的小片狀食管黏膜，將所取標本分3份，第一份用于病理診斷：取10%中性福爾馬林適量，固定組織，石蠟包埋后4 μm厚切片，HE染色；第2份和第3份立即液氮保存，后轉(zhuǎn)入-80 ℃凍存。通過對100例患者進行Lugol液染色，將25例存在主癌灶以外Lugol液染色陽性區(qū)，且病理表型正常者納入研究。

1.2方法選取配對的食管癌新鮮組織及癌旁組織，采用RT-PCR法檢測食管癌早期基因CHMP4A、TSPYL-2的表達，分析CHMP4A、TSPYL-2在食管癌變中的作用及意義。應用免疫組化法檢測不同患者的正常食管黏膜組織、癌化區(qū)域組織以及食管鱗狀細胞癌組織中CHMP4A及TSPYL-2的表達以驗證第一步得出的結(jié)論。免疫組化采用SP法，試劑購自武漢博士德公司。

2 結(jié)果

2.1食管鱗狀細胞癌組織與癌化區(qū)域組織、正常食管黏膜組織中CHMP4A及TSPYL-2mRNA表達

2.1.1RNA的提取 所提取的RNA完整性高、質(zhì)量較好，沒有蛋白質(zhì)等污染，無降解(表1)。

表1 RNA濃度及純度

2.1.2CHMP4A和TSPYL-2 mRNA的表達 以CHMP4A、TSPYL-2 mRNA在正常食管黏膜組織為對照，得到癌化區(qū)域組織、食管鱗狀細胞癌組織中的相對表達量，統(tǒng)計結(jié)果顯示CHMP4A及TSPYL-2基因在食管鱗狀細胞癌組織與正常食管黏膜組織中的相對表達量差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，在癌化區(qū)域組織和正常食管黏膜組織中的相對表達量差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且CHMP4A基因在正常食管黏膜、癌化區(qū)域組織、食管鱗狀細胞癌組織中的表達依次增高，而TSPYL-2基因在正常食管黏膜、癌化區(qū)域組織、食管鱗狀細胞癌組織中的表達依次降低(表2，圖1)。

2.2CHMP4A和TSPYL-2蛋白在不同食管組織中的表達免疫組化檢測結(jié)果顯示，CHMP4A陽性定位于鱗狀上皮細胞胞核，陽性率為64.58%，在正常食管黏膜組織中幾乎不表達，在癌化區(qū)域組織中低表達，在食管鱗狀細胞癌組織中高表達，差異有顯著性(P<0.05，表3，圖2)。TSPYL-2陽性定位于鱗狀上皮細胞胞核，陽性率為84%，在正常食管黏膜組織中表達，在癌化區(qū)域組織中低表達，在食管鱗狀細胞癌組織中極低表達或不表達，差異有顯著性(P<0.05，表4，圖3)。

表2 CHMP4A及TSPYL-2 mRNA在不同食管組織中的表達

與正常食管黏膜組相比，*P<0.05

表3 CHMP4A蛋白在不同食管組織中的表達

表4 TSPYL-2蛋白在不同食管組織中的表達

圖1 A.CHMP4A溶解曲線；B.CHMP4A擴增曲線；C.TSPYL-2溶解曲線；D.TSPYL-2擴增曲線

②A②B②C③A③B③C

圖2CHMP4A蛋白的表達：A.正常食管組織；B.癌化區(qū)域組織；C.食管鱗狀細胞癌組織，SP法圖3TSPYL-2蛋白的表達：A.正常食管組織；B.癌化區(qū)域組織；C.食管鱗狀細胞癌組織，SP法

3 討論

本實驗為國家自然科學基金資助項目《食管鱗狀細胞癌的早期基因克隆與鑒定》的后續(xù)研究，根據(jù)“癌化區(qū)域”理論，病理學形態(tài)結(jié)構(gòu)正常而碘染色異常的食管上皮就是食管上皮中癌化區(qū)域，尋找食管鱗狀細胞癌早期的基因改變。本組前期實驗已經(jīng)利用抑制消減雜交技術(shù)，以Lugol液染色陰性的正常食管黏膜上皮組織為對照，建立了Lugol液染色陽性的“癌化區(qū)域”食管上皮組織高/低表達基因文庫以及“食管癌高/低表達文庫”，經(jīng)過測序及差異片段的同源性檢索后，從兩對文庫中篩選出523個已知基因和137個未知基因或EST片段。本組從前期實驗中篩選出的11個與早期食管鱗狀細胞癌密切相關(guān)的基因中選取備選基因CHMP4A及TSPYL-2基因進行臨床驗證。

CHMP4A位于染色體14q11.2區(qū)段，有6個外顯子，編碼265個氨基酸，是染色質(zhì)修飾蛋白家族成員，屬于內(nèi)吞體分選轉(zhuǎn)運復合體-Ⅲ(ESCRT-Ⅲ)，在表面受體蛋白降解和多泡體(MVBs)形成中起關(guān)鍵作用。在人類淋巴瘤和咽組織中高度表達。PSORTⅡ蛋白定位分析表明CHMP4A主要位于細胞核。Shi等[1]研究顯示CHPM4A可以提高低氧誘導因子-1α(HIF-1α)在正常和缺氧條件下的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄活性，從而促進腫瘤的生長、血管生成、侵襲，并與腫瘤耐藥密切相關(guān)[2]。

TSPYL-2位于染色體Xp11.2區(qū)段，有7個外顯子，編碼388個氨基酸，其功能主要是染色質(zhì)重塑和抑制劑細胞周期的進展，抑制Cyclin B1表達和DNA合成[3]，而發(fā)揮抑制腫瘤生長的作用。TSPYL-2在TGF-b1信號通路及突觸功能中發(fā)揮重要作用[4-5]。TSPYL-2與肺癌[6]密切相關(guān)，結(jié)果顯示過表達TSPYL-2對肺腺癌細胞具有明顯的抑制作用，這可能還與其調(diào)節(jié)p21表達有關(guān)[7]。其他方面，Sato等[8]實驗結(jié)果顯示，TSPYL-2在子宮肌瘤組織X基因甲基化后顯示出高表達，可能與子宮平滑肌瘤相關(guān)。Le Gallo等[9]對子宮漿液性癌組織進行全外顯子測序研究顯示，TSPYL-2突變率為6%，其染色質(zhì)重塑功能被破壞，可能是導致子宮漿液性癌發(fā)生的分子機制。

采用RT-PCR、免疫組化法分別從RNA及蛋白水平檢測CHMP4A在食管鱗狀細胞癌組織、癌化區(qū)域組織及正常食管黏膜組織中的表達，結(jié)果顯示CHMP4A基因在食管鱗狀細胞癌組織與正常食管黏膜組織中的表達差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，在癌化區(qū)域組織與正常食管黏膜組織中表達差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且CHMP4A基因在正常食管黏膜、癌化區(qū)域組織、食管鱗狀細胞癌組織中的表達依次增強，而CHMP4A蛋白表達的變化趨勢與CHMP4A基因是一致的。而TSPYL-2基因在正常食管黏膜、區(qū)域組織、食管鱗狀細胞癌組織中的表達依次降低，其蛋白的表達趨勢與基因的變化趨勢亦一致。

本實驗首次發(fā)現(xiàn)CHMP4A與TSPYL-2基因在癌化區(qū)域與食管鱗狀細胞癌、正常食管黏膜組織之間差異表達現(xiàn)象的存在，且CHMP4A在正常食管黏膜、癌化區(qū)域組織、食管鱗狀細胞癌組織中的表達依次增強。而TSPYL-2基因在正常食管黏膜、癌化區(qū)域組織、食管鱗狀細胞癌組織中的表達依次降低。CHMP4A基因為Lugol液染色陽性的“癌化區(qū)域”高表達基因，即真正意義上的早期癌基因，可作為食管鱗狀細胞癌早期基因備選基因進行生物學研究。TSPYL-2基因作為食道癌的抑癌基因，對食道鱗狀細胞癌細胞有明顯的抑制作用。CHMP4A與TSPYL-2基因及其表達蛋白在各組組織中表達的變化趨勢與抑制消減雜交結(jié)果一致，同時也驗證了癌化區(qū)域理論。

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