馮子懿，侯麗萍，鄭 果，梁藝聰，何駿駒

（廣州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510006）

谷甾醇對斑馬魚生長發(fā)育和生殖的影響

馮子懿，侯麗萍，鄭 果，梁藝聰，何駿駒

（廣州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510006）

為了研究谷甾醇（sitosterol）暴露對斑馬魚（Barchydanio rerio var）內(nèi)分泌的干擾效應(yīng)，通過不同濃度的谷甾醇（50、100、150、200 μg/L）對雌性斑馬魚進(jìn)行為期60 d的水浴暴露，同時設(shè)乙醇對照，分別于60 d后測定各組分雌性斑馬魚的生長指標(biāo)，對部分組織進(jìn)行切片觀察，從組織病理學(xué)和毒理學(xué)方面評估谷甾醇暴露的毒性效應(yīng)。結(jié)果表明：在200 μg/L谷甾醇暴露下，斑馬魚全部死亡，其他各濃度處理與對照組相比，除臀鰭數(shù)隨谷甾醇濃度的增加呈現(xiàn)倒“U”型趨勢，以及肝重隨谷甾醇濃度的增加而上升外，其他各生長指標(biāo)均不同程度受到抑制，抑制作用與暴露濃度呈明顯的劑量效應(yīng)。此外，性腺指數(shù)（GSI）呈下降趨勢，肝體指數(shù)（HSI）呈上升趨勢，各組織切片也表現(xiàn)出明顯的毒性反應(yīng)。因此，可初步判斷谷甾醇對斑馬魚的生長發(fā)育和繁殖系統(tǒng)會產(chǎn)生較大影響。

谷甾醇；斑馬魚；暴露；生長繁殖

內(nèi)分泌干擾物（Endocrine disruptors chemicals，EDCs）是指能夠干擾體內(nèi)天然激素合成、分泌、傳輸、鍵合或清除的激素類似物，在環(huán)境中含量很低。谷甾醇（sitosterol）是植物雌激素（Phytoestrogen，PE）類中一種最常見的內(nèi)分泌干擾物，由于在牛皮紙或紙漿中的漂白污水中廣泛檢出而受到人們的關(guān)注[1]。研究表明，多種魚類的發(fā)育異常與污水中的環(huán)境雌激素有關(guān)。環(huán)境中的雌激素通過生物富集作用，造成魚類生長發(fā)育遲緩、生殖器和性腺形態(tài)功能異常等。其中，β-谷甾醇對血液中卵黃蛋白原水平、性別分化以及肝細(xì)胞病變程度均具有明顯干擾效應(yīng)，可使成熟精母細(xì)胞和精子的比例失衡[2-5]。

斑馬魚（Barchydanio rerio var）是輻鰭亞綱（Actinopterygii）鯉形目（Cypriniformes）鯉形科（Cyprinidae）短擔(dān)尼魚屬（Danio）的一種硬骨魚。斑馬魚是環(huán)境毒理學(xué)中常用的標(biāo)準(zhǔn)生物模式種，其基因的保守性與人類基因組相比約為87%[6]，具備雌雄易分辨、易存活、有類似人類的器官系統(tǒng)等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于遺傳學(xué)、環(huán)境毒理學(xué)及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。

活體魚類測試內(nèi)分泌干擾效應(yīng)的敏感指標(biāo)包括肝體指數(shù)（Hepatosomatic index，HSI）、性腺指數(shù)（Gonadosomatic index，GSI）和性腺組織結(jié)構(gòu)等[7]。研究以雌性斑馬魚為研究對象，從形態(tài)學(xué)、生理學(xué)各指標(biāo)以及毒理學(xué)組織切片等方面來評估谷甾醇對雌性斑馬魚內(nèi)分泌系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)的毒性效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選取國際熱點(diǎn)模式動物紅斑馬魚為試驗動物，購買于廣州市翠竹苑花鳥魚市場，體長均在4～5 cm，體重為0.7～0.9 g。挑選雌性斑馬魚單獨(dú)飼養(yǎng)，待生長情況穩(wěn)定后，開始暴露試驗。

供試谷甾醇（sitosterol），以乙醇（70%）為助溶劑，配制成1 g/L的母液，稀釋到相應(yīng)濃度，4℃避光保存，待用。

試驗用水為充分曝氣的自來水，餌料為商業(yè)購買的紅蟲。監(jiān)測水質(zhì)用Thermo多道水質(zhì)監(jiān)測儀（Thermo Orion，520M-01，廣州）。

1.2 暴露處理

暴露容器為25 cm×20 cm×20 cm 的方形玻璃缸，正式暴露試驗前，使魚群處于試驗環(huán)境條件下，直至雌斑馬魚持續(xù)保持零死亡率。挑選大小基本相同的雌斑馬魚180尾，每組試驗魚30尾，谷甾醇溶液暴露濃度分別為50、100、150、200 μg/L，另以等體積乙醇作對照，共5個處理。用15 L的水進(jìn)行養(yǎng)殖，暴露周期持續(xù)60 d。每個處理設(shè)3個平行組，采用半靜態(tài)暴露裝置，試驗期間將水溫保持在25℃左右，用充氣機(jī)供氧，調(diào)節(jié)充氣量以保證不同濃度廢水中的溶解氧含量一致，溶解氧大于4 mg/L，pH值在6～8之間。每日早晨、中午、晚上各喂食1次，2 d換1次水并清理排泄物，每次換總體積的1/3，若水質(zhì)出現(xiàn)異常波動，則立即換水[8]。光周期為12 h光照12 h黑暗。

1.3 測定指標(biāo)及方法從形態(tài)學(xué)觀測記錄斑馬魚各生長指標(biāo)，從毒理學(xué)方面觀測各組織切片中細(xì)胞和結(jié)構(gòu)的變化。

1.3.1 形態(tài)學(xué)和生理學(xué)測定 暴露結(jié)束后，將斑馬魚埋入冰中致死。從低濃度開始測量觀察，測量每條斑馬魚的體長、體重和臀鰭數(shù)。對斑馬魚進(jìn)行解剖，迅速取出魚肝、魚鰓及性腺，用濾紙吸取血漬，稱重記錄。

1.3.2 組織切片制作 配置Bouin氏液：稱取2.25 g苦味酸固體溶解于150 mL蒸餾水中，福爾馬林50 mL，冰醋酸10 mL，攪拌均勻。用Bouin氏液迅速固定稱重之后的魚肝、魚鰓及性腺，封蓋并貼標(biāo)簽。用濃度梯度遞增的乙醇溶液脫水，至100%乙醇，使脫水硬化，選用二甲苯（xylene）為透明劑。用石蠟作為支持介質(zhì)并對組織進(jìn)行石蠟包埋，用切片機(jī)切片后，采用蘇木素伊紅染色法（EH染色法）進(jìn)行染色，后用樹膠和蓋玻片封固。

1.3.3 肝體指數(shù)（HSI）和性體指數(shù)（GSI） HIS=肝重/體重，GSI=性腺重/體重

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗所得的數(shù)據(jù)均用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析，采用單因素方差分析（ ANOVA） 法來檢驗不同處理下斑馬魚各生理指標(biāo)的差異，并用LSD對結(jié)果進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 水體中谷甾醇暴露對雌斑馬魚形態(tài)生理特征的影響

2.1.1 體 長 由圖1可知，在100 μg/L谷甾醇處理下，雌斑馬魚體長就受到顯著抑制，而當(dāng)谷甾醇濃度增加至150和200 μg/L時，雌斑馬魚的體長極顯著短于對照；50 μg/L谷甾醇處理的雌斑馬魚體長稍長于對照，但差異不顯著。

圖1 不同濃度谷甾醇暴露60 d對雌斑馬魚體長的影響

2.1.2 體 重 由圖2可知，隨著谷甾醇濃度的增加，雌斑馬魚的體重呈下降趨勢，各處理間差異均達(dá)顯著水平。

圖2 不同濃度谷甾醇暴露60 d對雌斑馬魚體重的影響

2.1.3 臀鰭數(shù) 由圖3可知，在谷甾醇暴露下，各處理雌斑馬魚臀鰭數(shù)呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢（倒“U”型趨勢），在100 μg/L谷甾醇處理下，雌性斑馬魚臀鰭數(shù)最多，而150和200 μg/L谷甾醇處理的雌斑馬魚臀鰭數(shù)與對照組相比則顯著下降。

圖3 不同濃度谷甾醇暴露60 d對雌斑馬魚臀鰭數(shù)的影響

2.1.4 鰓 重 由圖4可知，隨著谷甾醇濃度的增加，雌斑馬魚的鰓重隨之減少，具有明顯的劑量效應(yīng)。在200 μg/L谷甾醇處理下，雌斑馬魚的平均魚鰓重下降至對照組的60.2%，差異達(dá)極顯著水平。

2.1.5 肝 重 由圖5可知，隨著谷甾醇濃度的增加，雌斑馬魚的肝重隨之增加，且150和200 μg/L谷甾醇處理的雌斑馬魚肝重量分別比對照增加39.6%和61.7%，且差異分別達(dá)顯著和極顯著水平。

圖4 不同濃度谷甾醇暴露60 d對雌斑馬魚腮重的影響

圖5 不同濃度谷甾醇暴露60 d對雌斑馬魚肝重的影響

2.1.6 性腺重 由圖6可知，隨著谷甾醇濃度的增加，雌斑馬魚性腺重量隨之下降，且下降趨勢越來越明顯，具有明顯的劑量效應(yīng)。150和200 μg/L谷甾醇處理的雌斑馬魚性腺重量分別比對照降低25.8%和61.7%，且差異分別達(dá)顯著和極顯著水平。

圖6 不同濃度谷甾醇暴露60 d對雌斑馬魚性腺重的影響

2.2 水體中谷甾醇暴露對雌斑馬魚生長與生殖相互關(guān)系的影響

由試驗數(shù)據(jù)分析可得：體長指標(biāo)與體重、鰓重和肝重在0.01水平上極顯著相關(guān)，與性腺重在0.05水平上顯著相關(guān)；體重指標(biāo)與臀鰭數(shù)在0.05水平上顯著相關(guān)，與其他指標(biāo)在0.01水平上極顯著相關(guān)；臀鰭數(shù)指標(biāo)與性腺重在0.01水平上極顯著相關(guān)，與體重、鰓重和肝重在0.05水平上顯著相關(guān)；鰓重指標(biāo)與體長、體重和肝重在0.01水平上極顯著相關(guān)，與臀鰭數(shù)和性腺重在0.05水平上顯著相關(guān)；肝重指標(biāo)與體長、體重和鰓重在0.01水平上極顯著相關(guān)，與臀鰭數(shù)和性腺重在0.05水平上顯著相關(guān)；性腺重與體重和臀鰭數(shù)在0.01水平上極顯著相關(guān)，與其他指標(biāo)在0.05水平上顯著相關(guān)。由此可得到，體重與肝重及性腺重有明顯的相關(guān)性，進(jìn)而可分析其肝體指數(shù)（HSI）和生殖腺指數(shù)（GSI）。

圖7顯示了不同濃度谷甾醇暴露對雌斑馬魚肝體指數(shù)（HSI）的影響。與對照組相比，50 μg/L谷甾醇處理下雌斑馬魚的HSI略微降低，當(dāng)谷甾醇濃度增加至100 μg/L及以上時，雌斑馬魚肝體指數(shù)有所上升，其中在200 μg/L谷甾醇處理下，雌斑馬魚的肝體指數(shù)較對照組增加了127.3%。總體上谷甾醇的暴露對雌斑馬魚的肝體指數(shù)有明顯的上升誘導(dǎo)作用。

圖7 不同濃度谷甾醇暴露60 d對雌斑馬魚HSI的影響

圖8顯示了不同濃度谷甾醇暴露對雌斑馬魚生殖腺指數(shù)（GSI）的影響。與對照組相比，隨谷甾醇濃度的增加，雌斑馬魚的性腺指數(shù)呈下降趨勢，且在200 μg/L谷甾醇處理下，GSI下降率達(dá)60.2%?？傮w上谷甾醇的暴露對雌斑馬魚的生殖腺指數(shù)有明顯的下降誘導(dǎo)作用。

圖8 不同濃度谷甾醇暴露60 d對雌斑馬魚GSI的影響

2.3 水體中谷甾醇暴露對雌斑馬魚各組織結(jié)構(gòu)的影響

2.3.1 鰓 從圖9可看出，對照組雌斑馬魚鰓組織中細(xì)胞大小相近，分布整齊均勻，而在谷甾醇暴露下的各處理鰓組織細(xì)胞開始出現(xiàn)退化、長短不一，不規(guī)則現(xiàn)象，200 μg/L谷甾醇處理下鰓組織已經(jīng)嚴(yán)重扭曲發(fā)生破裂現(xiàn)象。

2.3.2 肝 由圖10可知，對照組肝細(xì)胞排列緊密，結(jié)構(gòu)清晰，大小一致，細(xì)胞核明顯；而谷甾醇處理下的試驗組肝細(xì)胞開始裂解、扭曲、分散，幾乎看不到細(xì)胞核，細(xì)胞空泡化，成絮狀。隨著谷甾醇的濃度增加，肝細(xì)胞的損壞程度更加嚴(yán)重。

圖9 不同濃度谷甾醇暴露60 d后雌斑馬魚鰓組織的變化

圖10 不同濃度谷甾醇暴露60 d后雌斑馬魚肝組織的變化

2.3.3 性 腺 如圖11所示，對照組雌斑馬魚的卵細(xì)胞均比較完整，含有I期卵原細(xì)胞時相、II時期初級卵母細(xì)胞、III時期卵黃泡出現(xiàn)時期、IV期卵黃充滿時期、V期成熟卵細(xì)胞時期，VI期退化吸收時期（圖11A和B）；試驗組與對照組相比，幾乎沒有成熟卵細(xì)胞，細(xì)胞分化開始受抑制，圖11D中卵黃充滿時期的卵細(xì)胞開始裂解，表現(xiàn)出毒性反應(yīng)；圖11E中卵細(xì)胞嚴(yán)重裂解，細(xì)胞嚴(yán)重退化，毒理效應(yīng)十分明顯。

3 結(jié)論與討論

3.1 谷甾醇暴露對雌斑馬魚形態(tài)生理特征的影響

試驗結(jié)果顯示，在200 μg/L谷甾醇暴露下，斑馬魚全部死亡，隨谷甾醇暴露濃度的增加，雌斑馬魚的體長和體重均呈下降趨勢，且均具有顯著性影響，說明這兩個指標(biāo)可作為水質(zhì)監(jiān)測的形態(tài)學(xué)指標(biāo)；對臀鰭數(shù)的影響則表現(xiàn)出谷甾醇具雌激素效應(yīng)和抗雌激素效應(yīng)的雙重效應(yīng)。

研究表明，植物雌激素可能通過雌激素受體介導(dǎo)途徑或者非受體介導(dǎo)途徑發(fā)揮雌激素效應(yīng)或抗雌激素效應(yīng)的雙重效應(yīng)，引發(fā)相應(yīng)的反應(yīng)級聯(lián)，干擾魚體內(nèi)性激素的合成、分泌與代謝，進(jìn)一步導(dǎo)致性別分化、性腺發(fā)育、等的紊亂。Aldercreutz等[9]通過試驗證實(shí)這種雙重效應(yīng)可能是由植物雌激素與內(nèi)源雌激素的比例決定的。

圖11 不同濃度谷甾醇暴露60 d后雌斑馬魚卵巢組織的變化

鰓是魚類特有的器官，也是魚類重要的呼吸器官，是魚類與水體接觸的第一系統(tǒng)，因此極易受到水環(huán)境中有毒物質(zhì)的影響，鰓重的下降反映出谷甾醇對斑馬魚的毒性效應(yīng)。

肝臟是魚類重要的腺體，與物質(zhì)代謝有緊密的關(guān)系，外源物質(zhì)進(jìn)入魚體后主要在肝臟中進(jìn)行分泌和代謝。因此，肝臟是環(huán)境監(jiān)測和毒理學(xué)研究的重要器官。試驗結(jié)果顯示，雌斑馬魚的肝重隨谷甾醇濃度的增加而增加，這可能是由于毒物的累積效應(yīng)影響了魚體的正常代謝導(dǎo)致的。

性腺是毒理學(xué)研究中的重要器官，與性別分化有關(guān)，雌性斑馬魚的卵巢重量在谷甾醇暴露下呈現(xiàn)出下降趨勢，這說明谷甾醇對性腺具有干擾效應(yīng)。以上均說明谷甾醇會對魚類的生長發(fā)育產(chǎn)生干擾，組織器官和繁殖系統(tǒng)也會受到影響。

3.2 谷甾醇暴露對雌斑馬魚生長和生殖相互關(guān)系的影響

魚類的生長包括營養(yǎng)生長和生殖生長，HSI和GSI的變化可以反映出生長與生殖的相互關(guān)系，也反映了卵黃的發(fā)生和積累過程。魚類卵黃的發(fā)生主要通過兩種形式：一是由卵母細(xì)胞自身合成，稱為內(nèi)源性卵黃合成或自動合成；二是自卵母細(xì)胞以外的地方合成，然后進(jìn)入卵母細(xì)胞，稱為外源性卵黃合成[10-11]。外源性卵黃的形成是在雌激素作用下，肝細(xì)胞中首先合成卵黃前體物質(zhì)（卵黃蛋白原），然后經(jīng)血液循環(huán)輸送到卵巢，再通過微胞飲作用被卵母細(xì)胞吸收，最終在卵母細(xì)胞中裂解為卵黃擔(dān)保，稱為卵母細(xì)胞發(fā)育與成熟的物質(zhì)基礎(chǔ)[12]。因而，由圖7和圖8可明顯看出，HSI與GSI變化趨勢相反，肝體指數(shù)不斷增加，生殖腺指數(shù)不斷下降。這說明在低濃度谷甾醇溶液處理下，肝細(xì)胞仍發(fā)揮其合成卵黃前體物質(zhì)的作用并向卵巢輸送，隨谷甾醇濃度的增大，雌斑馬魚卵巢的生理功能受到抑制而無法吸收或無法分解卵黃蛋白原，或卵黃蛋白原的輸送受到抑制，而使肝內(nèi)合成的卵黃蛋白原大量積累，肝內(nèi)貯存的能量物質(zhì)無法轉(zhuǎn)化為性產(chǎn)物，因而HSI明顯上升。端正花等[6]的研究表明，低劑量外源化合物會導(dǎo)致肝臟尺寸膨大，肝組織發(fā)生炎癥從而充血、水腫，高劑量下會導(dǎo)致肝臟尺寸減小，具有抑制肝臟發(fā)育和肝臟細(xì)胞損傷毒性，從這方面可判斷出谷甾醇對營養(yǎng)生長的毒性相對較弱。綜上所述，在谷甾醇作用下，雌斑馬魚的肝體指數(shù)與生殖腺指數(shù)具有此增彼減的效應(yīng)，生殖生長受到明顯抑制，對營養(yǎng)生長的毒性較小。

3.3 谷甾醇暴露對雌斑馬魚各組織結(jié)構(gòu)的影響

張鳳君等[13]試驗觀察顯示，暴露在50 μg/L 多氯聯(lián)苯（PCBs，一種油狀化學(xué)物質(zhì)）水中，試驗斑馬魚鰓的結(jié)構(gòu)和功能呈顯著受損傷狀態(tài)。魚鰓與水體直接接觸，直接暴露于毒物下，魚鰓的損壞會影響魚體整個呼吸系統(tǒng)的正常功能，嚴(yán)重時導(dǎo)致魚體死亡。

甘海燕等[5]發(fā)現(xiàn)隨著污水濃度的增大以及污染時間的延長，肝細(xì)胞病變程度加重，肝竇隙擴(kuò)張，細(xì)胞核腫大甚至裂解消失，胞質(zhì)疏松，空泡明顯增加。由此表明，內(nèi)分泌干擾物谷甾醇對雌斑馬魚肝臟有毒害作用。

促性腺激素釋放激素（GnRH）是由下丘腦分泌，刺激或抑制垂體促性腺激素的分泌，具有相當(dāng)?shù)幕钚詽撃?。正常生存的魚類通過下丘腦分泌GnRH，刺激促性腺激素的分泌，然后促性腺激素促進(jìn)雌激素的分泌，從而促進(jìn)性腺發(fā)育。該試驗中雌斑馬魚的性腺發(fā)育受到明顯抑制，表明雌激素的分泌或者與性腺發(fā)育有關(guān)的激素分泌也會受到抑制，進(jìn)而阻礙雌激素的正常分泌，影響性腺發(fā)育[14]。

綜上所述，雌斑馬魚經(jīng)不同濃度谷甾醇暴露60 d后，其體長、體重、鰓重和性腺重均有明顯的抑制效應(yīng)，肝重量則隨谷甾醇濃度增加而增加；臀鰭數(shù)倒“U”的趨勢變化反應(yīng)了谷甾醇作為雌激素的雙重效應(yīng)，即在內(nèi)源性雌激素水平較低時，低濃度谷甾醇可充當(dāng)雌激素促效劑，而高濃度谷甾醇則會競爭性與雌激素受體結(jié)合而減弱雌激素對靶細(xì)胞的應(yīng)答，表現(xiàn)為拮抗作用。這些生理指標(biāo)均可作為評估谷甾醇毒性效應(yīng)的參考指標(biāo)。在試驗組谷甾醇的暴露下，雌斑馬魚表現(xiàn)為HSI上升，GSI下降，且HSI和GSI表現(xiàn)出此增彼漲的趨勢，說明肝臟與雌斑馬魚的卵巢間存在著某種緊密的聯(lián)系，可能與卵黃蛋白原的輸送和吸收有關(guān)，仍有較大的研究空間。從各組織切片圖可直觀看到谷甾醇對各組織的損傷及影響情況，組織受損傷程度亦可成為評估谷甾醇毒性大小的直觀指標(biāo)。

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（責(zé)任編輯：成 平）

Effects of Sitosterol on the Growth and Reproduction of Barchydanio rerio var

FENG Zi-yi，HOU Li-ping，ZHENG Guo，LIANG Yi-cong，HE Jun-ju
（School of life science, Guangzhou University, Guangzhou 510006, PRC）

The effect of sitosterol on physiological indexes, HSI and GSI in the liver of Barchydanio rerio var were investigated. The female were selected and exposed to 50, 100, 150 μg/L and 200 μg/L sitosterol for 60 d by using the hydrostatic bath method. The results showed that except for all death of the Barchydanio rerio var in the solution under concentration of 200 μg/L, there was dose effect relationship between physiological indexes and sitosterol concentration within a certain concentration range. The paper also indicated that GSI presents a trend of increasing and the HSI presents opposite, and obvious toxic effects were presented in the tissue section figures. It is concluded that sitosterol effects the growth and reproductive system of Barchydanio rerio var.

sitosterol; Barchydanio rerio var; exposure; growth and reproduction

S949

：A

：1006-060X（2017）02-0074-06

10.16498/j.cnki.hnnykx.2017.002.020

2016-08-11

廣東省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)試驗室開放基金（GPKLMB201603）

馮子懿（1994-），女，河南安陽市人，本科生，專業(yè)：生態(tài)毒理。

侯麗萍