林麗華 謝劍鋒 翁育偉 張炎華 趙琳 鄭奎城

350001 福州, 福建省人獸共患病研究重點實驗室 福建省疾病預(yù)防控制中心

·論著·

2010-2015年福建省乙型流感病毒血凝素基因特征分析

林麗華 謝劍鋒 翁育偉 張炎華 趙琳 鄭奎城

350001 福州, 福建省人獸共患病研究重點實驗室 福建省疾病預(yù)防控制中心

林麗華、謝劍鋒為共同第一作者

目的 了解2010-2015年福建省乙型流感病毒血凝素(HA)基因特征，明確流行株對疫苗的匹配情況。方法 從2010-2015年福建省流感網(wǎng)絡(luò)實驗室保存的乙型流感毒株中隨機抽取B Victoria系和Yamagata系流感病毒，通過RT-PCR方法擴增HA基因，測序獲得其全長序列，然后利用生物信息學(xué)軟件分析HA基因特性。結(jié)果 與疫苗株相比，2010-2015年B Yamagata系流感病毒HA基因變異程度較大，主要有116、150、165、196和202這5個涉及抗原決定簇的氨基酸位點變異，且隨時間的推移變異位點逐漸增多，尤以2010年、2014年和2015年變異較為明顯；然而，Victoria系流感病毒HA基因的變異較小，且沒有明顯隨時間累積的趨勢。2010年和2015年兩個年份WHO推薦的Yamagata系疫苗株對福建省的乙型流感保護效果不佳，其余年份的Yamagata系疫苗株對人群保護作用尚可，而Victoria系疫苗株仍具有較好的保護效果。結(jié)論 隨著時間的推移，乙型流感病毒已經(jīng)逐漸發(fā)生變異，部分年份的Yamagata系毒株與疫苗株的匹配效果不佳，且出現(xiàn)了抗原漂移現(xiàn)象。今后需進一步加強流感病毒基因監(jiān)測，以及時發(fā)現(xiàn)新的變異株，為流感防控提供依據(jù)。

Fund programs: Natural Science Foundation of Fujian Province of China(2015J01294);Medical Innovation Foundation of Fujian Province (2014-CX-9);Youth Backbone Talents Cultivation Program of Health System in Fujian Province (2015-ZGN-ZD-10)

流行性感冒簡稱流感，是由流感病毒引起的急性呼吸道傳染病，是一種發(fā)病率高、傳染性強、傳播速度快的疾病。流感病毒屬于正黏病毒科(Orthomyxoviridae)的流感病毒屬，根據(jù)內(nèi)部核蛋白(NP)和基質(zhì)蛋白(MP)的抗原性差異，可被分為甲(A)、乙(B)和丙(C)三個型別。乙型流感病毒是人類主要的流感病毒之一，常引起地區(qū)和季節(jié)性流行，根據(jù)抗原性和HA1區(qū)基因特性分為兩大譜系，代表株分別為 B/Yamagata/16/88和B/Victoria/2/87，稱為Yamagata系和Victoria系[1，2]。甲型流感常常會引起暴發(fā)流行，甚至導(dǎo)致世界大流行，所以甲型流感更引起人們的關(guān)注，也被更多的研究分析報道。然而，乙型流感病毒雖然未造成世界性的大流行，但常常在全球范圍內(nèi)引起局部暴發(fā)，一些監(jiān)測和流行病學(xué)數(shù)據(jù)還顯示乙型流感也能帶來嚴(yán)重的疾病和經(jīng)濟負(fù)擔(dān)，如2004年以來，乙型流感病毒占所有流行的流感病毒的1%-56%，并且導(dǎo)致1%-52%的流感相關(guān)的兒童死亡率[3]。

流感病毒的快速變異是流感在人群中不斷流行和傳播的重要原因，而表面抗原血凝素(HA)是抗原變異的分子基礎(chǔ)。為了從分子水平上了解福建省乙型流感毒株HA基因的變異情況及與疫苗株的匹配性，本研究隨機選取福建省2010-2015年的乙型流感毒株，對HA基因進行序列測定和分子特征分析，了解其變異特點及規(guī)律。通過與WHO推薦的疫苗株進行比較，分析福建省當(dāng)前乙型流感流行株與疫苗株的匹配效果，為乙型流感的防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 毒株來源 本次研究以2010-2015年福建省乙型流感毒株作為研究對象，按隨機抽樣抽取乙型流感兩個種系(BV和BY)的毒株進行HA基因序列測定和分析。共計選取99株乙型流感病毒，其中2010年20株(BV11株、BY9株)、2011年19株(BV13株、BY6株)、2012年12株(BV6株、BY6株)、2013年12株(BV0株、BY12株)、2014年19株(BV5株、BY14株)、2015年17株(BV5株、BY12株)。

1.2 病毒RNA提取 采用德國Qiagen公司的RNA提取試劑盒，按照操作說明書提取病毒RNA，具體步驟參考產(chǎn)品說明書。

1.3 引物 RT-PCR擴增引物來自http://gsc.jcvi.org/projects/msc/influenza/網(wǎng)站，引物序列由上海生工生物工程有限公司合成。

1.4 RT-PCR擴增與測序 RT-PCR采用TaKaRa(大連寶生物有限公司)的PrimeScript One Step RT-PCR Kit試劑盒，反應(yīng)體系參照試劑盒說明配置。一步法RT-PCR條件為：50℃ 30 min,94℃ 2 min,(94℃ 30 s、60℃ 30 s、72℃ 1 min 50 s) 30 cycles,72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳觀察，產(chǎn)物量達50 ng/μl后，送至福州尚辰生物技術(shù)有限公司進行產(chǎn)物純化和測序。

1.5 序列分析 測序產(chǎn)物采用DNAStar7.1和MEGA5.0對HA基因的序列進行拼接、比對，分析毒株序列之間、毒株序列與疫苗株序列之間氨基酸同源性及氨基酸位點變異情況。構(gòu)建HA基因進化樹采用鄰位相臨法(Neighbor-Joining)，重復(fù)值為1 000。利用N-糖基化位點在線預(yù)測軟件NetNGlyc 1.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)進行糖基化位點分析。

1.6 參考疫苗株 WHO推薦北半球乙型流感歷年疫苗株：B/Florida/4/2006(2008-2011 Yamagata)，B/Wisconsin/01/2010(2012-2013 Yamagata)，B/Massachusetts/2/2012(2013-2015 Yamagata)，B/Brisbane/60/2008(2009-2015 Victoria)[4]。

2 結(jié)果

2.1 乙型流感病毒HA基因同源性分析 乙型流感Yamagata系和Victoria系病毒HA基因分別編碼584個和585個氨基酸。WHO推薦了3株Yamagata系疫苗株和1株Victoria系疫苗株作為2008-2015年的乙型流感北半球疫苗株，本次研究分析的福建省乙型流感兩個種系毒株與同期相應(yīng)疫苗株HA基因相比，氨基酸同源性均≥96.1%(見表1)。

表1 2010-2015年福建省乙型流感毒株與同期 疫苗株HA基因氨基酸同源性比較

表2 2010-2015年福建省B Yamagata系流感病毒HA基因涉及抗原決定簇主要氨基酸位點變異情況

注：a、b、c和d分別表示抗原決定簇120環(huán)、150環(huán)、160環(huán)和190螺旋；★受體結(jié)合位點；﹟毒株數(shù)

Note: a, 120-loop; b, 150-loop; c, 160-loop; d, 190-helix; ★, the receptor binding sites (RBS); ﹟, the number of viral strains

2.2 乙型流感病毒HA基因進化分析 HA基因核苷酸進化分析顯示，兩個種系毒株在進化樹上各形成兩個主要分支(圖1)。Yamagata系分為Y1和Y2兩個分枝，Y1分枝的毒株與B/Wisconsin/01/2010疫苗株的親緣關(guān)系更近，Y2分支的毒株與疫苗株B/Massachusetts/2/2012和B/Florida/4/2006的親緣關(guān)系更近。其中，福建省2010年和2015年的全部毒株屬于Y1分枝，2011-2012年的毒株主要分布在Y2分枝，2013-2014年的毒株則分散在Y1和Y2分枝中。Victoria系分成2010-2012年、2014-2015年兩個主要分支，2010-2012年分支與疫苗株B/Brisbane/60/2008親緣關(guān)系較近。

2.3 基因抗原性分析 在B Yamagata系流感毒株中， 相對于B/Florida/4/2006疫苗株，福建省2010年所有9個毒株和2011年的2個毒株(B/Fujian-yanping/2229/2011和B/Fujian-gulou/1553/2011)HA基因均出現(xiàn)S150I、N165Y、D196N和N202S的變異，并涉及3個抗原決定簇，抗原出現(xiàn)漂移現(xiàn)象。自2011年起，福建省B Yamagata系流感病毒均出現(xiàn)D196N變異，且同時具備N116K、S150I、N165Y、N202S氨基酸位點的逐漸累積變異，其涉及抗原決定簇的120環(huán)、150環(huán)、160環(huán)和190螺旋。直至2015年所有分析的毒株均發(fā)生上述位點變異，抗原出現(xiàn)漂移，致使B/Massachusetts/2/2012疫苗株已無法很好與當(dāng)前流行株進行匹配。值得注意的是在2010-2015年中，毒株還出現(xiàn)150、165和202氨基酸位點回復(fù)突變情況。詳見表2。

與Yamagata系流感毒株相比，Victoria系毒株HA基因的變異較小。相對于B/Brisbane/60/2008疫苗株，福建省2010-2015年B Victoria系流感毒株在HA基因抗原決定簇中均出現(xiàn)I146V變異，2011-2012年毒株主要出現(xiàn)N129S和N171D變異，2014-2015年毒株主要出現(xiàn)K209N的變異，余年份未見明顯變異，未出現(xiàn)抗原漂移現(xiàn)象。

2.4 疫苗匹配性分析 從疫苗匹配效果來看，福建省2010年和2015年的B Yamagata系流感病毒相對疫苗株均出現(xiàn)≥4氨基酸位點變異，且涉及3個抗原決定簇。進一步分析比較毒株與下輪疫苗株氨基酸差異情況(見表3)，Yamagata系毒株與當(dāng)前疫苗株在抗原決定區(qū)的氨基酸差異平均為3.1個，涉及的抗原決定簇數(shù)平均為2.9個；而與下輪疫苗株相比，抗原決定區(qū)的氨基酸差異平均為2.2個，涉及的抗原決定簇數(shù)平均為1.9個；除了2011年毒株與當(dāng)前疫苗株匹配性較好外，其余年份的毒株均與下輪疫苗株的匹配性更好，且與下輪疫苗株相比毒株均未出現(xiàn)抗原漂移的現(xiàn)象，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.033，P<0.05)。

表3 B Yamagata毒株與疫苗株在抗原決定簇上的氨基酸差異(平均值)

注：①B/Florida/4/2006；②B/Wisconsin/01/2010；③B/Massachusetts/2/2012；④B/Phuket/3073/2013?！皌”表示對“毒株與當(dāng)前疫苗株”和“毒株與下輪疫苗株”在抗原決定區(qū)的差異進行t檢驗；“P<0.05”表示“毒株與當(dāng)前疫苗株”和“毒株與下輪疫苗株”在抗原決定區(qū)的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義

Note: ①B/Florida/4/200；②B/Wisconsin/01/2010；③B/Massachusetts/2/2012； ④B/Phuket/3073/2013. t, t-test of the different in antigenic sites between viral strains and current vaccines and next vaccines.P<0.05, indicating that the difference is statistically significant

Victoria系毒株與B/Brisbane/60/2008疫苗株在抗原決定簇上的氨基酸差異平均為1.8個，涉及的抗原決定簇平均數(shù)為1.7個，福建省近年來的Victoria系流感流行株與疫苗株匹配良好，表明該疫苗株對人群仍具有一定的保護效果。

圖1 2010-2015年福建省乙型流感毒株Yamagata(A) and Victoria(B)HA基因核苷酸進化樹Note：▲：Vaccine strainsFig.1 Phylogenetic tree of the HA gene of influenza B viruses Yamagata(A) and Victoria(B) in Fujian, 2010-2015

2.5 糖基化位點分析 與早期疫苗株B/Florida/4/2006相比，所有Yamagata系毒株均在HA蛋白196位上增加一個糖基化位點。同時，除B/Fujian-cangshan/1358/2010缺失530位外，其余毒株的HA蛋白上都有11個糖基化位點(25、59、145、167、196、303、332、491、517、530、562)；與疫苗株B/Brisbane/60/2008相比，Victoria系毒株中除B/Fujian-siming/1209/2010缺失563位、B/Fujian-xianyou/193/2010缺失197位、B/Fujian-gulou/1458/2010缺失197位、B/Fujian-meilie/1180/2011等7株毒株缺失531位外，其余毒株的HA蛋白上都有12個糖基化位點(25、59、145、166、197、233、304、333、492、518、531、563)。

3 討論

隨著時間的推移，近6年來福建省B Yamagata系毒株變異位點逐漸增多，相對當(dāng)前疫苗株尤以2010年、2014年和2015年變異較為明顯。在所有的突變位點中，部分位點的突變得以延續(xù)，而部分位點經(jīng)過若干年后發(fā)生回復(fù)突變。延續(xù)下來的突變能使病毒獲得較強的適應(yīng)性利于病毒的存活，未延續(xù)下來的突變屬于非適應(yīng)性突變，無法承受自然選擇的壓力不利于病毒存活而被淘汰。而Victoria系毒株在HA基因上的變異較小，且沒有隨時間變化逐漸累積的趨勢，體現(xiàn)了病毒在自然選擇的壓力下通過不斷調(diào)整自身以獲得更強的適應(yīng)性。

流感疫苗對人群的保護效果取決于流行株與疫苗株的匹配狀況。研究表明，HA基因的變異速度最快，是引起病毒抗原變異最主要的原因[5]。已知乙型流病毒HA1上有4個抗原表位：120環(huán)(116-137)、150環(huán)(141-150)、160環(huán)(162-167)和190螺旋(194-202)，Victoria系的120環(huán)還包含75和77兩個位點[6]。這些位點的氨基酸突變，往往引起病毒抗原性的改變。流感病毒出現(xiàn)新的變異種被定義為在抗原決定簇上有4個以上位點發(fā)生氨基酸替換，且替換涉及到2-3個抗原決定簇[7-9]。發(fā)生這種差異時，應(yīng)警惕疫苗與當(dāng)前流行株的匹配效果。本次研究發(fā)現(xiàn)，Victoria系毒株與疫苗株B/Brisbane/60/2008匹配較好，疫苗株對人群仍具有較好的保護效果。而Yamagata系中2010年和2015年疫苗株與毒株匹配性較差，毒株發(fā)生抗原漂移，需要更換疫苗株，故WHO在2015年2月及時推出了B/Phuket/3073/2013疫苗株來取代B/Massachusetts/2/2012疫苗株。我省乙型流感的兩個種系常以一個種系為主混合流行，而WHO每年推薦的三價流感疫苗僅包含一個乙型流感成分，使得三價流感疫苗在保護人群預(yù)防流感的作用相當(dāng)有限，此外WHO根據(jù)全球的流行情況推薦的疫苗株很難兼顧到所有的國家和地區(qū)，因此，有關(guān)衛(wèi)生部門應(yīng)該根據(jù)我國流感病毒變異及流感流行的實際情況，研制適合的流感疫苗，尤其是包含兩個乙型種系的四價流感疫苗以提高疫苗的預(yù)防效果。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)毒株與下輪疫苗株的匹配性更好，反應(yīng)出疫苗株使用的滯后性，也提示我們應(yīng)該及時更新乙型流感疫苗株，保證流感疫苗的防控效果。

HA 基因糖基化位點的改變包括位點數(shù)目增減、位置變化、糖鏈結(jié)構(gòu)以及受體結(jié)合位點附近糖鏈的修飾等，這些改變不僅影響病毒的增殖和毒力，還影響病毒與宿主細(xì)胞受體的結(jié)合能力等[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，與疫苗株相比Yamagata系毒株在HA蛋白的196位上增加一個糖基化位點，這個糖基化位點發(fā)現(xiàn)于20世紀(jì)90年代，是乙型流感病毒的特征之一[11-13]，這個位點位于HA蛋白抗原決定簇區(qū)的190環(huán)，同時也是受體結(jié)合位點，可能會影響抗體對病毒的識別和結(jié)合。另外，與同年份其他毒株相比，Yamagata系的B/Fujian-cangshan/1358/2010和Victoria系的B/Fujian-siming/1209/2010等毒株分別在某個位點缺少一個糖基化位點，認(rèn)為這些毒株不是進化的主流，缺失的糖基化位點沒有延續(xù)至下一年，而這些糖基化位點的變化是否影響病毒的增殖和適應(yīng)性等，有待進一步的探索研究。

總之，本次基因分析表明，2010-2015年福建省乙型流感病毒兩個種系的HA基因逐漸發(fā)生變異，尤其是B Yamagata系流感病毒已經(jīng)出現(xiàn)抗原漂移現(xiàn)象，且WHO推薦的B Yamagata系流感疫苗株具有滯后現(xiàn)象，對人群不能提供良好的保護效果。今后在流感監(jiān)測中要繼續(xù)加強病原學(xué)監(jiān)測，及時發(fā)現(xiàn)新的變異株，為疫苗研發(fā)、指導(dǎo)疫苗接種和疫情防控提供科學(xué)依據(jù)。

[1] Rota PA, Wallis TR, Harmon MW, et al. Cocirculation of two distinct evolutionary lineages of influenza type B virus since 1983[J]. Virology, 1990, 175(1): 59-68.

[2] Kanegae Y, Sugita S, Endo A, et al. Evolutionary pattern of the hemagglutinin gene of influenza B viruses isolated in Japan: cocirculating lineages in the same epidemic season[J].J Virol, 1990, 64(6): 2860-2865.

[2] Burnham AJ, Baranovich T, Govorkova EA. Neuraminidase inhibitors for influenza B virus infection: efficacy and resistance[J]. Antiviral Res,2013,100(2):520-534. doi: 10.1016/j.antiviral.2013.08.023.

[4] http://www.who.int/influenza/vaccines/virus/en.

[5] McCullers JA, Wang GC, He S, et al. Reassortment and insertion-deletion are strategies for the evolution of influenza B viruses in nature[J]. J Virol, 1999, 73(9): 7343-7348.

[6] Wang Q, Cheng F, Lu M, et al. Crystal structure of unliganded influenza B virus hemagglutinin[J]. J Virol, 2008, 82(6): 3011-3020. doi: 10.1128/JVI.02477-07.

[7] 張燁, 溫樂英, 趙翔, 等. 2004-2005年中國B型流感病毒抗原性及基因特性研究[J]. 中華實驗和臨床病毒學(xué)雜志, 2006, 20(2): 11-13. doi: 10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2006.02.004.

[8] 張麗榮, 林毅雄, 李紅霞, 等. 珠海市2007-2008年乙型流感病毒基因特性分析[J]. 中國人獸共患病學(xué)報, 2010, 26(9): 847-850. doi : 10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2010.09.014.

[9] Rivera K, Thomas H, Zhang H, et al. Probing the structure of influenza B hemagglutinin using site-directed mutagenesis[J]. Virology, 1995, 206(2): 787-795. doi: 10.1006/viro.1995.1001.

[10] 丁小滿, 俞慕華. 流感病毒蛋白糖基化及其功能研究進展[J]. 中國人獸共患病學(xué)報, 2014, (12): 1267-1271. doi : 10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2014.12.020.

[11] Pechirra P, Nunes B, Coelho A, et al. Molecular characterization of the HA gene of influenza type B viruses[J]. J Med Virol, 2005, 77(4): 541-549. doi: 10.1002/jmv.20490.

[12] Tsai HP, Wang HC, Kiang D, et al. Increasing appearance of reassortant influenza B virus in Taiwan from 2002 to 2005[J]. J Clin Microbiol, 2006, 44(8): 2705-2713. doi: 10.1128/JCM.02694-05.

[13] Nakagawa N, Kubota R, Maeda A, et al. Influenza B virus victoria group with a new glycosylation site was epidemic in Japan in the 2002-2003 season[J]. J Clin Microbiol, 2004, 42(7): 3295-3297. doi: 10.1128/JCM.42.7.3295-3297.2004.

Analysis of genetic characterization on hemagglutinin gene of influenza B virus isolated in Fujian province, 2010-2015

LinLihua,XieJianfeng,WengYuwei,ZhangYanhua,ZhaoLin,ZhengKuicheng

FujianCenterforDiseaseControlandPrevention，F(xiàn)ujianKeyLaboratoryforZoonosesResearch，F(xiàn)uzhou350001,China

LinLihuaandXieJianfengarethefirstauthorswhocontributedequallytothearticle

ZhengKuicheng,Email:kingdadi9909@126.com

Objective To understand the epidemiological and virological features of influenza B viruses and the difference between the vaccine strains and epidemic strains, the antigenic and genetic characteristics on hemagglutinin (HA) gene of influenza B viruses circulating in Fujian during 2010-2015. Methods The representative strains were selected randomly according to the lineage of influenza B viruses isolated from network laboratory in Fujian, 2010-2015. Viral RNA was extracted and gene fragments were amplified by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR ) and the PCR products were sequenced. The complete HA gene sequence was obtained and analyzed via bioinformatics. Results Compared to the vaccine strains recommended by WHO，there were significant changes in genetic and antigenic characteristics on HA gene of B Yamagata lineage viruses from 2010 to 2015, especially in 2010, 2014 and 2015. There were major five amino acid residues substitutions (116, 150, 165, 196 and 202) involved in antigenic determinants, and the variable sites gradually increased as time on over. However, the variability of B Victoria lineage viruses on HA gene was less and there was no obvious trend over time. The results showed that the B Yamagata vaccine strains of 2010 and 2015 recommended by WHO had poor protective effect on influenza virus infection, while the B Victoria vaccine strain still play a satisfactory protective effect on humans in Fujian. Conclusions With time on, influenza B Yamagata lineage viruses had gradually mutated, causing a poorly match with vaccine strains in part of year, and emerging antigenic drift phenomenon. Strengthening further surveillance of mutations of B influenza virus remains essential to allow for early warning of influenza epidemic.

Influenza B virus;Hemagglutinin;Genetic characterization;Phylogenetic tree

福建省自然科學(xué)基金(2015J01294)；福建省醫(yī)學(xué)創(chuàng)新課題(2014-CX-9)；福建省衛(wèi)生系統(tǒng)中青年骨干人才培養(yǎng)項目(2015-ZGN-ZD-10)

鄭奎城，Email：kingdadi9909@126.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2017.01.010

乙型流感病毒; 血凝素; 基因特征; 進化樹

2016-09-27)