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        腦蛋白水解物溶液的滅活及去除病毒工藝研究

        2017-03-19 09:34:09吳晶晶段洪雙
        科學(xué)與財(cái)富 2017年6期
        關(guān)鍵詞:工藝研究

        吳晶晶+段洪雙

        摘 要:目的:研究腦蛋白水解物溶液的滅活及病毒去除的工藝。方法:選擇披膜病毒科黃病毒屬的豬流行性乙型腦炎病毒(乙腦)、細(xì)小病毒科細(xì)小病毒屬的豬細(xì)小病毒(PPV)作為指示病毒,其中乙腦代表有囊膜的核糖核酸RNA),PPV作為無囊膜脫氧核糖核酸(DNA)病毒的代表。模擬生產(chǎn)工藝中的病毒滅活步驟100℃×10min,超濾作為滅活及去除病毒的條件。將病毒分別按照1∶4加入到腦蛋白水解物溶液中,進(jìn)行高溫、濃縮、超濾來滅活及去除病毒。以豬腎細(xì)胞(PK-15)細(xì)胞培養(yǎng)PPV,以倉(cāng)鼠腎細(xì)胞(BHK-21)培養(yǎng)乙腦,測(cè)定病毒滴度。結(jié)果:PPV、乙腦通過滅菌,病毒半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(TCID50)分別為6.15log/0.1mL(logs)、5.37log/0.1mL(logs);去除工藝平均病毒降低系數(shù)分別為6.15log/0.1mL(logs)、5.37log/0.1mL(logs)。結(jié)論:腦蛋白水解物溶液生產(chǎn)工藝中的高溫、濃縮、超濾均可作為病毒滅活及去除的有效工藝。

        關(guān)鍵詞:腦蛋白水解物;滅活;去除病毒;工藝研究

        健康的豬腦組織經(jīng)復(fù)合蛋白酶水解分離得到腦蛋白水解物,其主要含多種人體必須的游離氨基酸及活性小分子多肽,是一種神經(jīng)保護(hù)劑,具有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)和神經(jīng)保護(hù)的類似神經(jīng)生長(zhǎng)因子的作用,其中檢出游離氨基酸16種,占總含量的75%~80%,臨床多用于治療腦外傷,改善伴有記憶減退及注意力集中障礙等癥狀的腦血管疾病后遺癥,還可輔助治療腦功能不全、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、精神病性抑郁癥及蛋白質(zhì)消化吸收障礙等[1-2]。由于腦蛋白水解物溶液提取自動(dòng)物器官,在動(dòng)物源的選擇上或生產(chǎn)過程中可能存在源性病毒及其他污染性病毒。產(chǎn)品的安全性是產(chǎn)品生產(chǎn)的硬性指標(biāo),為了保證產(chǎn)品的質(zhì)量,除了通過嚴(yán)格控制原料的來源和質(zhì)量外,還應(yīng)該在生產(chǎn)環(huán)節(jié)中增加相應(yīng)的病毒滅活及去除步驟[3]。本次針對(duì)生產(chǎn)過程中的一些環(huán)節(jié)進(jìn)行研究探討,找出適合腦蛋白水解物溶液的滅活及去除病毒的工藝,并總結(jié)如下。

        1.材料與方法[4]

        1.1細(xì)胞與毒株 豬細(xì)小病毒(PPV 9025 C4)株、乙腦病毒株均在成都市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心采購(gòu),豬腎細(xì)胞、倉(cāng)鼠腎細(xì)胞(BHK-21)作為傳代細(xì)胞,均由吉林萬通藥業(yè)集團(tuán)梅河藥業(yè)股份有限公司實(shí)驗(yàn)室存放。本次研究時(shí)間為2015年10月至2016年9月。

        1.2藥品與試劑 滅活前的腦蛋白水解物病毒中間體(哈爾濱三聯(lián)藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn),批號(hào)141020、141021、141022);RPMI 1640培養(yǎng)基、抗生素(雙抗)、胎牛血清、胰酶等均由合肥博美生物科技有限責(zé)任公司提供

        1.3儀器 ZCP-50W水套式CO2培養(yǎng)箱,上海喆圖科學(xué)儀器有限公司;MHY-26435超潔凈工作臺(tái),北京美華儀科技有限公司;奧林巴斯倒置顯微鏡CKX53,成貫儀器(上海)有限公司;離心超濾管(0.22μm),上海摩速科學(xué)器材有限公司其他常規(guī)實(shí)驗(yàn)儀器由本人所在實(shí)驗(yàn)室提供。

        1.4細(xì)胞的培養(yǎng)和病毒的增殖 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PK-15豬腎細(xì)胞用胰蛋白酶消化后接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,同步接種PPV,放置在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng);將倉(cāng)鼠腎細(xì)胞(BHK-21)長(zhǎng)成致密單層時(shí)接種乙腦,按上述培養(yǎng)條件進(jìn)行培養(yǎng),當(dāng)出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變后,將其置于-20℃/37℃進(jìn)行3次反復(fù)凍融,收集病毒液。未接種病毒的細(xì)胞作為陰性對(duì)照細(xì)胞。

        1.5病毒半數(shù)組織培養(yǎng)感染計(jì)量的測(cè)定 在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中測(cè)定細(xì)胞半數(shù)感染量,將傳代消化后的細(xì)胞稀釋成約105~106個(gè)/mL后,轉(zhuǎn)移到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)行培養(yǎng),每孔0.2mL;PK-15細(xì)胞傳代貼壁后再其未進(jìn)行生長(zhǎng)時(shí)機(jī)加入培養(yǎng)基,接種PPV。將病毒液進(jìn)行連續(xù)10倍的稀釋,待BHK-21細(xì)胞長(zhǎng)成單層后加入培養(yǎng)基,并將乙腦病毒接種,每個(gè)稀釋度以0.1mL接種6孔,并用0.9%NaCl注射液做陰性對(duì)照,放置在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),3小時(shí)后更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),每天觀察CPE并記錄,按Reed-Muench計(jì)算TCID50,病毒的TCID50應(yīng)大于105;

        1.6模擬制備工藝樣品 在無菌罩內(nèi)打開三批樣品溶液,每批取3.2mL等量裝入兩只2mL凍存管中,每管在分別加入PVP和乙腦病毒各0.4mL,混勻后作為高溫條件下滅活實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)樣品,并標(biāo)記為高溫。按生產(chǎn)工藝中的病毒滅活及去除工藝的方式處理樣品,將上述標(biāo)記為高溫的加入病毒的樣品分別在100℃下滅活10min,做為下一步病毒滅活效果監(jiān)測(cè)的樣品。另分別取的三批樣品各3.2mL,,等量分裝于兩只2mL凍存管中同樣各加入0.4mL的PVP和乙腦病毒混勻,用超濾柱超濾,并標(biāo)記,作為超濾病毒滅活及去除實(shí)驗(yàn)檢測(cè)樣品。同時(shí)做以培養(yǎng)基代替樣品溶液做不加入病毒的樣品對(duì)照。

        1.7批量制備工業(yè)樣品 取新鮮豬腦100kg,按工藝方法處理后得到脫脂腦酚11kg,加水溶解并混合2.9kg的胃蛋白酶、1.9kg胰蛋白酶進(jìn)行過濾,經(jīng)柱層析后得到腦蛋白水解物。

        1.8測(cè)定病毒滅活的滴定度,按1.5的方式將轉(zhuǎn)入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上的細(xì)胞稀釋液加入濃度為2%的血清,BHK-21細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后棄去培養(yǎng)基,重新加入0.09mL培養(yǎng)基后接種0.01mL在1.6中制備的樣品;PK-15細(xì)胞以每孔0.09mL同步接種病毒0.01mL傳代至培養(yǎng)板。接種樣品分別為:加入病毒并經(jīng)過病毒滅活及去除(高溫/超濾)過程的樣品、未加入病毒并經(jīng)過病毒滅活及去除(高溫/超濾)過程的樣品、經(jīng)過(高溫/超濾)處理后的病毒對(duì)照品、病毒原液、加入培養(yǎng)基的細(xì)胞空白對(duì)照。除空白對(duì)照樣品外,其余樣品莒南10倍梯度稀釋,連續(xù)做6個(gè)滴度,每個(gè)滴度向洪福2次,接種病毒后3h更換培養(yǎng)基。接種乙腦病毒、PPV進(jìn)行CPE的72h觀察。

        2.結(jié)果

        分別測(cè)定PPV毒株和乙腦毒株的TCID50,每隔24h通過倒置顯微鏡觀察未接種病毒的和接種病毒后的PK-15細(xì)胞和BHK-21細(xì)胞,72h內(nèi)未接種病毒的PK-15細(xì)胞和BHK-21細(xì)胞形態(tài)基本完整,無明顯變化;而接種病毒后的PK-15細(xì)胞和BHK-21細(xì)胞出現(xiàn)的脫落、拉網(wǎng)、圓縮、折光性減弱等明顯的CPE。收集接毒48h的PK-15細(xì)胞、接毒72hBHK-21細(xì)胞各30mL,分裝于凍存管中,作為本實(shí)驗(yàn)的病毒原液。按Reed-Muench計(jì)算出PPV的TCID50,為0.1mL 107.24logs,乙腦的TCID50,為0.1mL 103.36logs,兩者稀釋的病毒液備用。

        模擬工藝對(duì)加入病毒的樣品進(jìn)行滅活及去除驗(yàn)證,經(jīng)高溫、超濾后的樣品加入培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)觀察,此件對(duì)照細(xì)胞正常生長(zhǎng)。

        3.討論

        通過本次研究結(jié)果,可以看出病毒滅活及去除的效果受多種因素影響,如何針對(duì)這些影響因素作出客觀的評(píng)價(jià),在將乙腦和PPV病毒添加到腦蛋白水解物溶液中中,高溫工藝可以有效的將病毒滅活,超濾可有效將其去除,從而都是病毒喪失了對(duì)細(xì)胞的感染能力。通過實(shí)驗(yàn)的對(duì)照組可以看出,經(jīng)以上方法處理后的男蛋白水解物溶液不再對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性。由此可見,在生產(chǎn)工藝中增加有效的病毒滅活和去除措施是非常必要的,高溫滅活和超濾去除病毒的方法在工藝上是可行的,部分學(xué)者[5]通過研究發(fā)現(xiàn)在超濾工藝的基礎(chǔ)上增加了層析工藝,更有利于生產(chǎn)過程中的雜志去除,該項(xiàng)結(jié)論值得進(jìn)一步研究推廣和研究。

        參考文獻(xiàn)

        [1] 余燕, 梁蔚陽, 鄧鋒,等. 腦蛋白水解物對(duì)神經(jīng)細(xì)胞損傷修復(fù)活力測(cè)定方法的研究[J]. 中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué), 2016, 33(6):704-707.

        [2] 黃潔, 王孝功, 單敏. 高效液相色譜柱后衍生法對(duì)腦蛋白水解物注射液生產(chǎn)工藝的優(yōu)化研究[C]// 全國(guó)色譜學(xué)術(shù)報(bào)告會(huì)及儀器展覽會(huì). 2015.

        [3] 辜正平, 王伯初, 曠瑜. 肝水解肽的制備及其病毒滅活/去除工藝的驗(yàn)證[J]. 中國(guó)生物制品學(xué)雜志, 2010, 23(1):95-97.

        [4] 李鳳霞, 初云海, 黃清玲,等. 腦蛋白水解物溶液的滅活/去除病毒工藝研究[J]. 中國(guó)基層醫(yī)藥, 2015, 22(1):54-56.

        [5] 黃潔, 王孝功, 單敏,等. 腦蛋白水解物的提取工藝優(yōu)化[J]. 中國(guó)藥房, 2016, 27(28):3985-3987.

        作者簡(jiǎn)介:吳晶晶,哈爾濱三聯(lián)藥業(yè)股份有限公司,主管藥師,150025,本科,1983年生人。

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