單曲拉姆 澤旺曲珍 索朗曲吉

（1.西藏自治區(qū)農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所，西藏拉薩 850000；2.西藏自治區(qū)拉薩市尼木縣吞巴鄉(xiāng)農(nóng)牧綜合服務(wù)中心，西藏拉薩 850000）

論牛冷凍精液人工授精技術(shù)

單曲拉姆1澤旺曲珍2索朗曲吉1

（1.西藏自治區(qū)農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所，西藏拉薩 850000；2.西藏自治區(qū)拉薩市尼木縣吞巴鄉(xiāng)農(nóng)牧綜合服務(wù)中心，西藏拉薩 850000）

牛冷凍精液人工授精是一項(xiàng)具有重大科學(xué)價值的繁殖新技術(shù)，它是建立在家畜育種工作的迫切需要和人工授精技術(shù)高度發(fā)展基礎(chǔ)上的。近代生理學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)、低溫學(xué)、化工學(xué)、電子學(xué)以及超聲波技術(shù)的進(jìn)展，為精液的冷凍保存，運(yùn)輸和使用技術(shù)，提供了現(xiàn)代化的技術(shù)裝備。該項(xiàng)技術(shù)不僅在畜牧生產(chǎn)上獲得了顯著的效益和廣泛的應(yīng)用，而且迅速擴(kuò)大到其它生物貯存和其它科學(xué)領(lǐng)域，如農(nóng)業(yè)、工業(yè)、醫(yī)療衛(wèi)生等。

1 牛冷凍精液的生產(chǎn)程序

要生產(chǎn)出高質(zhì)量冷凍精液，除了引進(jìn)或選留優(yōu)良公牛及科學(xué)的飼養(yǎng)管理以外，在凍精生產(chǎn)過程中必須嚴(yán)格操作規(guī)程。現(xiàn)將其生產(chǎn)程序作一介紹：

根據(jù)生產(chǎn)性能的需要選留種公牛并進(jìn)行科學(xué)的飼養(yǎng)管理，等至合適的年齡時，即可進(jìn)行采精調(diào)教至正式生產(chǎn)，其工藝流程為：采精器械準(zhǔn)備及稀釋液的配制→人工采集精液→鮮精活力鏡檢 0.6級以上→鮮精液稀釋2－4倍→降溫平衡→鏡檢平衡后活力→制凍→鏡檢凍后活力0.3級以上→分裝貼標(biāo)→保存→輸精。

2 液氮、凍精的保存及運(yùn)輸

液氮、凍精均存放于低溫生物容器（液氮罐）內(nèi)，液氮罐是用不銹鋼或鋁合金制成的雙層外壁容器，內(nèi)外兩層中間為高度真空并填有絕熱材料，容器蓋用泡沫塑料制成，即可少量透氣，又有隔熱作用。因?yàn)橐旱姆悬c(diǎn)很低（ -195.8℃），所以往空罐內(nèi)填充液氮時，開始要緩慢少量，待罐內(nèi)溫度降低后，再逐步加大流量及速度，液氮、凍精貯存罐每年倒空1－2次自然放置60－70小時，使罐內(nèi)溫度回升到常溫，然后用清水沖洗干凈，并加以干燥。

液氮罐內(nèi)有精液貯存時，注意當(dāng)液氮耗量達(dá)到60－70%時。就要補(bǔ)充液氮，防止因缺少液氮而使罐內(nèi)溫度回升導(dǎo)致精子死亡。貯存液氮和凍精的液氮罐應(yīng)放置在陰涼、干燥、通風(fēng)透氣條件較好的房間內(nèi)。運(yùn)輸液氮和凍精時，嚴(yán)禁用任何物品將罐口封嚴(yán)，以堵塞液氮的自然揮發(fā)量而使罐內(nèi)產(chǎn)生較高壓力而發(fā)生沖爆事故、危及安全。不論使用何種交通工具運(yùn)輸液氮和凍精，均不得嚴(yán)閉車窗口，因?yàn)楣迌?nèi)液氮隨時地都處于微量自然揮發(fā)狀態(tài)，如通風(fēng)透氣條件不好，則室內(nèi)空氣中氮?dú)夂吭黾?，氧氣含量減少，會造成乘坐人員因缺氧而發(fā)生窒息事故。

3 凍精液的解凍技術(shù)和解凍方法

冷凍精液的解凍過程與冷凍過程比較，雖然方法簡單，速度快，時間短，但同樣重要，解凍的溫度變化與冷凍相反，溫度是由低到高，同樣應(yīng)避免或減少在通過結(jié)晶危險溫度區(qū)精子細(xì)胞膜內(nèi)發(fā)生變化而對精子造成損傷甚至死亡。

3.1 顆粒凍精的解凍技術(shù)和解凍方法

1）解凍液的配制

我省目前使用的解凍液為2.9%的檸檬酸鈉（Na3C6H5O7、2H2O）溶液，大部分人工授精站都是統(tǒng)一從省育種站購買，也有少部分地區(qū)自制生產(chǎn)，不論是購買或自己配制，都必須嚴(yán)格生產(chǎn)過程中的操作規(guī)程。統(tǒng)一配方并調(diào)定準(zhǔn)確有關(guān)參數(shù)（PH值，滲透壓）?，F(xiàn)將配方及配制方法介紹如下：

準(zhǔn)量稱取檸檬酸鈉 2.9克，放入玻璃量筒內(nèi)加蒸餾水至100毫升刻度，混合均勻，測定PH值為7.33，滲透壓290.3，經(jīng)定量濾紙過濾，分裝于安瓿內(nèi)，每只安瓿內(nèi)的凈溶量為1.5毫升，用酒精燈火焰封口，然后置于高壓消毒鍋中消毒滅菌（蒸氣1.06－1.4kg/cm2，消毒時間為20－40分鐘，蒸氣溫度為121－126℃），保存在陰涼干燥處待用，有效期為6個月。安瓿解凍液的優(yōu)點(diǎn)是便于保管，衛(wèi)生，能減少外界環(huán)境污染，取用方便。據(jù)了解，有的單位使用的解凍液是自行配制后盛裝于三角燒瓶中保存?zhèn)溆?，這種方法保存的時間短，接觸外界污染機(jī)會多，取用不便，而且質(zhì)量很難保證。建議各地使用安瓿法解凍液，以保證凍精解凍后的質(zhì)量。

2）解凍溫度

冷凍精液的解凍溫度分為快速解凍（40℃），室溫解凍（15－20℃），冷水（4－5℃）緩慢解凍三種方法。目前世界上大部分地區(qū)都采用35－40℃這個溫度范圍解凍，實(shí)踐證明，采用40℃快速解凍精子復(fù)蘇率較高，且活力較強(qiáng)。

3）解凍技術(shù)操作

解凍過程中必須嚴(yán)格各個環(huán)節(jié)的操作過程，注意以下事項(xiàng)：a、凍精離開液氮面與放入解凍液中的速度一定要快取快放，盡量縮短空間停留時間；b、顆粒凍精上不得粘附凍霜，如有應(yīng)稍加振動，使其脫落后再行解凍；c、解凍過程的各個環(huán)節(jié)，必須嚴(yán)格控制環(huán)境污染；d、夾取顆粒凍精的金屬鑷子要經(jīng)預(yù)冷后再夾取凍精，以防止顆粒凍精粘附在鑷子上難以脫落。

3.2 解凍具體操作步驟

首先將恒溫容器（電熱恒溫水溶鍋或廣口保溫杯）內(nèi)的水溫調(diào)至 40℃±2℃，將裝有解凍液的安瓿放入溫水內(nèi)，等其溫度與恒溫水大約相等時，即將安瓿拿出，用消毒紗布抹去安瓿周圍的水分，再用安瓿開口器或金屬鑷子將安瓿尖端開口，口徑大小以能放入一顆凍精為宜，然后夾取一顆凍精放入安瓿的三分之二，在水中輕緩游動，使安瓿內(nèi)的顆粒凍精溫度均勻上升，游動安瓿時必須特別小心，絕對不能將恒溫水振入安瓿內(nèi)，觀察顆粒大約溶解至80－90%時，即可將其拿出水面，再次用消毒紗布擦去安瓿周圍的水分，并略加搖動，使精液完全溶解，混合均勻，然后在20℃左右溫度的顯微鏡下檢查精子活力情況，如有效精子（呈直線前進(jìn)運(yùn)動的精子）的活力在0.3級以上，即可用于輸精。

3.3 細(xì)管凍精的解凍技術(shù)和解凍方法

在使用細(xì)管精液過程中，首先必須按照冷凍精液的規(guī)程操作，雖然細(xì)管凍精不易受外界環(huán)境污染，但標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化的技術(shù)操作也是確保受胎率，避免生殖系統(tǒng)感染病菌的重要措施。

1）檢查細(xì)管體

細(xì)管凍精從液氮中取出后，首先檢查細(xì)管體是否有裂紋和封口不嚴(yán)的現(xiàn)象，如發(fā)現(xiàn)有裂紋者，該支細(xì)管凍精應(yīng)棄之不用，如屬封口不嚴(yán)，則解凍時可封口不嚴(yán)的一端朝上放入40℃左右的恒溫水中進(jìn)行解凍，盡量避免因解凍方法不當(dāng)而導(dǎo)致解凍后精子活力不強(qiáng)乃致死亡的人為因素。

2）解凍

首先準(zhǔn)備 40℃左右的恒溫水，恒溫容器的準(zhǔn)備與顆粒凍精解凍法介紹的相同，細(xì)管凍精從液氮中取出后，手拿細(xì)管上端（封裝精液后封口），立即放入恒溫水中并輕緩游動，以保持其管壁受熱均衡。經(jīng)20－30秒鐘后即可解凍完畢。目前全國各地較為普遍使用此種解凍方法的解凍效果好且受胎率高，除此種方法外，也有其它幾種方法可供參考，但不提倡廣泛使用。

S858．23

A

1003-1650(2017)04-0251-01