劉金龍+溫亮+彭一洪+鄭威+戴光忠+楊軍

摘要：篩選得到一種解硒菌9906-5B，利用含單質(zhì)硒的煤矸石生產(chǎn)亞硒酸鈉，以便有效防止化學(xué)法提取硒造成的環(huán)境污染。在培養(yǎng)基中加入單質(zhì)硒，利用解硒菌9906-5B，根據(jù)單因素結(jié)果設(shè)計它的響應(yīng)面試驗。運用SAS軟件對解硒因素參數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，探討單因素條件下9906-5B的解硒效果。結(jié)果表明，解硒菌9906-5B在pH 6.0溫度30 ℃解硒菌發(fā)酵28 h條件下，解硒率達(dá)到79.10%。

關(guān)鍵詞：9906-5B解硒菌；解硒率；響應(yīng)面分析

中圖分類號：Q939.96 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）24-6395-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.24.019

硒是人體必需的微量元素之一，也是長壽元素。硒有抗癌、抗氧化作用，能夠增強(qiáng)人體免疫力，拮抗有害重金屬，能夠保肝護(hù)肝，具有調(diào)節(jié)維生素A、維生素C、維生素E、維生素K的吸收與利用，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)和酶及輔酶合成的功能，能夠增強(qiáng)生殖功能。缺硒會導(dǎo)致克山病、大骨節(jié)病、心血管病、癌癥、糖尿病等40多種疾病[1，2]。

湖北省恩施州富硒土壤資源豐富，表層土壤硒含量大于0.4 mg/kg的富硒地區(qū)面積約10 456 km2，占全州面積的43.63%，恩施市含硒碳質(zhì)頁巖出露面積850 km2，硒礦儲量達(dá)50多億t，新塘鄉(xiāng)雙河魚塘壩的硒礦被稱為“世界罕見和惟一獨立工業(yè)硒礦床”，填補了全球無獨立硒礦床的空白。核心礦區(qū)長6 km，寬1.5 km，面積0.88 km2，含硒量均值為3 637.5 mg/kg，含硒品位為230～6 300 mg/kg，探明具有工業(yè)開采價值的硒金屬（工業(yè)純硒）45.699 t，漁塘壩巖石中硒的含量最高達(dá)6 300 mg/kg，是國外已發(fā)現(xiàn)最高含硒巖石的11倍[3]。這些富硒碳質(zhì)巖石中的硒主要以有機(jī)態(tài)、元素態(tài)和硫化物/硒化物態(tài)的形式存在[4]。這些礦物硒有效態(tài)含量低，不易被動植物吸收利用，并且硒往往與重金屬伴生，人為在貧硒土壤中補充硒礦粉，有可能帶來土壤的二次污染，但目前采用的酸堿法提取硒的方法，又會造成水體等環(huán)境污染。因此，本研究借鑒稀有金屬和含量少的貴金屬礦成功采用微生物選礦技術(shù)提取的方法，嘗試?yán)梦⑸飶奈V石中提取硒，用單質(zhì)硒配成培養(yǎng)基，使用篩選到的解硒菌9906-5B發(fā)酵，觀察在不同條件下解硒菌對單質(zhì)硒離子化的效果，探討利用微生物從含硒礦石中提取硒的技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料

解硒菌（湖北民族學(xué)院篩選，中國科學(xué)院北京微生物研究所鑒定）、單質(zhì)硒純度99%（湖北恩施市新塘鄉(xiāng)雙河魚塘壩）。

試驗設(shè)備：超凈工作臺（蘇州凈化SW-CJ-2FD）、恒溫?fù)u床（HQL150B中國科學(xué)院武漢儀器廠）、試管、培養(yǎng)皿、接種環(huán)、酒精燈、三角瓶（250、500 mL）。

試驗試劑：牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉、鹽酸、氫氧化鈉均為分析純，廠家均為國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 解硒菌活化培養(yǎng)基配制及試管菌種制作 牛肉膏瓊脂培養(yǎng)基：牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、氯化鈉5 g，瓊脂1.5 g，去離子水1 000 mL，用10%鹽酸或10%的氫氧化鈉調(diào)整pH到7.2～7.6，分裝在試管中，高壓蒸氣滅菌，取出擺斜面，在超凈工作臺上無菌接種活化菌種，制成試管種。

1.2.2 解硒菌搖瓶種子液培養(yǎng)基配制 種子液培養(yǎng)基（牛肉膏液體培養(yǎng)基）：牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、氯化鈉5 g，去離子水1 000 mL。每500 mL三角瓶裝100 mL解硒菌搖瓶種子液培養(yǎng)基，接種試管菌種，置控溫?fù)u床培養(yǎng)。

1.2.3 解硒菌單因素解離單質(zhì)硒方法設(shè)計 使用牛肉膏液體培養(yǎng)基，溫度30 ℃，發(fā)酵28 h，設(shè)搖瓶液體培養(yǎng)基pH分別為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，分別接菌種于控溫培養(yǎng)基上；使用牛肉膏液體培養(yǎng)基，pH 5.5，發(fā)酵28 h，設(shè)搖瓶液體培養(yǎng)基培養(yǎng)溫度分別為27.5、28.0、28.5、29.0、29.5、30.0、30.5、31.0、31.5、32.0、32.5、33.0 ℃，分別接菌種于控溫培養(yǎng)基上；使用牛肉膏液體培養(yǎng)基，溫度為30 ℃，pH 5.5，設(shè)搖瓶液體培養(yǎng)基發(fā)酵時間分別為17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28 h，分別接菌種于控溫培養(yǎng)基上。

1.2.4 解硒菌復(fù)因素解離單質(zhì)硒響應(yīng)面試驗設(shè)計 將單質(zhì)硒用塊煤煤粉配成單質(zhì)硒含量為300 mg/kg的含硒材料，將10%解硒菌搖瓶種子液加入到解硒菌搖瓶種子液培養(yǎng)基（煤粉重量的50%）中，并用其拌勻煤粉，煤粉含水率達(dá)60%，堆積控發(fā)酵。解硒菌復(fù)因素解離單質(zhì)硒響應(yīng)面試驗設(shè)計[5]見表1。

1.2.5 離子硒的檢測方法 發(fā)酵處理樣品送至湖北省恩施州硒產(chǎn)業(yè)研究院，采用液相色譜和原子熒光聯(lián)用法檢測離子硒含量，再用加入的單質(zhì)硒減去檢測的離子硒含量，求得解硒菌解硒率（mg/kg）[6]。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素對解硒菌解硒率的影響

2.1.1 不同pH對解硒菌解硒率的影響 測定不同pH對解硒菌解硒率的影響，結(jié)果如圖1所示，在pH 5.5時解硒率最高，同時也適合解硒菌發(fā)酵的活性酸度范圍。

2.1.2 不同溫度對解硒菌解硒率的影響 由圖2可知，隨溫度提高，解硒率不斷上升，在30 ℃時達(dá)最大，溫度繼續(xù)升高解硒率反而下降，說明解硒菌活性被高溫抑制。結(jié)果表明，30 ℃是解硒菌的適宜溫度，其活性達(dá)最大。

2.1.3 不同發(fā)酵時間對解硒菌解硒率的影響 由圖3可知，隨發(fā)酵時間延長，解硒率不斷增大，但當(dāng)解硒菌發(fā)酵時間超過28 h后，解硒率不變，說明解硒菌解硒達(dá)到飽和。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗

2.2.1 根據(jù)Box-Behnken試驗設(shè)計方案 選取培養(yǎng)基pH（X1）、發(fā)酵溫度（X2）、發(fā)酵時間（X3）3個影響因子，解硒率為響應(yīng)值，試驗設(shè)計結(jié)果見表2，在pH為6.0，發(fā)酵溫度為30 ℃，發(fā)酵時間為28 h時，解硒率最高，為79.10%。

2.2.3 響應(yīng)面分析 由響應(yīng)面可知，發(fā)酵溫度響應(yīng)曲面最陡峭，對解硒菌解硒率作用最顯著，其次是培養(yǎng)基的pH，再次是發(fā)酵時間。

3 小結(jié)

本研究將響應(yīng)曲面法運用于優(yōu)化解硒菌解硒工藝。經(jīng)試驗優(yōu)化后的解硒菌解硒最佳工藝條件為：解硒菌發(fā)酵時間為28 h、pH 6.0、發(fā)酵溫度30 ℃。此工藝下提取率為79.10%。

通過篩選解硒能力更強(qiáng)的菌種可提高解硒率。解硒菌種是客觀存在的，通過育種手段可以獲得解硒能力更強(qiáng)的菌種，提高解硒率，還可通過篩選混合菌提高解硒能力。

解硒菌將煤矸石中的單質(zhì)硒分解為離子硒。用解硒菌生產(chǎn)亞硒酸鈉生產(chǎn)工藝：將單質(zhì)硒礦石磨成硒礦粉，加入解硒菌將硒礦石中單質(zhì)硒降解成離子硒，加入適量的硒離子吸附劑，壓濾、加熱蒸發(fā)濾液，濃縮、結(jié)晶，加熱烘干結(jié)晶-加硫酸反應(yīng)-生成亞硒酸鈉。與傳統(tǒng)亞硒酸鈉生產(chǎn)工藝相比不加大量強(qiáng)堿，可降低成本，加酸生產(chǎn)亞硒酸鈉不向外排酸，生產(chǎn)中環(huán)境污染少。

參考文獻(xiàn)：

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[2] 徐兵河，孫 燕.微量元素硒的防癌抗癌作用[J].中國新藥雜志，1998，7（3）：176-179.

[3] 彭祚全，黃劍鋒.世界硒都恩施硒資源研究概述[M].北京：清華大學(xué)出版社，2012.

[4] 韓文亮，朱建明，秦海波，等.恩施漁塘壩富硒碳質(zhì)巖石中硒的形態(tài)分析[J].礦物學(xué)報，2007，27（1）：89-95.

[5] 王 希，鐘耀廣，市川壽.響應(yīng)面優(yōu)化超聲波快速提取鱈魚皮中膠原蛋白的工藝研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2014，45（7）：117-123.

[6] 王 欣，幸苑娜，陳澤勇，等.高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法檢測富硒食品中6種硒形態(tài)[J].分析化學(xué)研究報告，2013，41（11）：1669-1674.