朱紅艷+蔣小芬++李先明++伍濤++楊夫臣++涂俊凡+劉政++秦仲麒

摘要：采用菌絲生長速率法測定了苯醚甲環(huán)唑?qū)Ψ蛛x自金水梨園的43個梨黑斑病菌[Alternaria alternata（Fries）Keissler]菌株的EC50。結(jié)果表明，苯醚甲環(huán)唑?qū)婧诎卟【甑腅C50分布在0.071 9～1.488 6 μg/mL范圍內(nèi)，平均值為0.507 2±0.333 3 μg/mL。W檢驗梨黑斑病菌對苯醚甲環(huán)唑敏感性的頻次分布呈正偏態(tài)分布。菌株主體表現(xiàn)為敏感，但存在敏感性降低的菌株。

關(guān)鍵詞：梨黑斑病菌[Alternaria alternata（Fries）Keissler]；苯醚甲環(huán)唑；敏感性

中圖分類號：S432.4+4；TQ445.1 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）24-6448-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.24.031

梨黑斑病是砂梨生產(chǎn)中危害嚴重的病害之一。病原菌為鏈格孢真菌[Alternaria alternata（Fries）Keissler][1]?；瘜W(xué)殺菌劑是防治梨黑斑病的主要手段。其中苯醚甲環(huán)唑是近年來常用的殺菌劑。目前尚無梨黑斑病菌對苯醚甲環(huán)唑存在抗藥性的報道，但由于苯醚甲環(huán)唑作用位點單一，長期連續(xù)使用易使病原菌產(chǎn)生抗性，存在潛在的抗藥風險。因而被殺菌劑抗性行動委員會劃為中等抗性風險的藥劑[2]。已有智利蘋果黑星病菌（Venturia inaequalis）、小麥赤霉病菌（Fusarium graminearm）對苯醚甲環(huán)唑出現(xiàn)了抗性[3，4]。本研究旨在檢測金水地區(qū)砂梨黑斑病菌對該殺菌劑的敏感性，為梨黑斑病菌的抗藥性檢測及制定合理的化學(xué)防控策略提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株：編號JS-1～JS-43，為2016年從湖北省武漢市江夏區(qū)金水閘梨園采集，利用組織分離法分離得到，經(jīng)柯赫氏法則及分子生物學(xué)技術(shù)鑒定，均為梨黑斑病菌。

供試藥劑：10%世高（苯醚甲環(huán)唑）水分散粒劑（先正達作物保護有限公司），市購。

含藥PDA培養(yǎng)基：將藥劑溶于無菌水中，配成10 mg/mL的母液。以無菌水稀釋成適當?shù)臐舛忍荻?，?0%體積的藥液量加入到50 ℃左右的PDA培養(yǎng)基中，混勻，配制成終濃度為12.5、10.0、5.0、1.0、0.1 μg/mL的含藥培養(yǎng)基，以無藥劑的PDA培養(yǎng)基作對照。

1.2 敏感性測定

參考Yin等[5]的方法進行，將黑斑病菌在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d，獲得菌落，用直徑為5 mm的打孔器從菌落邊緣生長旺盛處打孔，制備菌絲塊。將菌絲塊接種至含上述系列濃度藥劑的PDA平板中央。置于26 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，16 h/8 h的光照/黑暗交替培養(yǎng)。以菌絲塊接種至無藥劑PDA平板作對照。每個處理設(shè)3個重復(fù)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用十字交叉法垂直測量菌落直徑，減去菌絲塊直徑，即為菌落生長直徑，求出各處理的平均直徑，計算不同濃度梯度的菌絲生長抑制率。

抑制率=（1-）×100%

根據(jù)生物統(tǒng)計機率值換算表將菌絲生長抑制率換算成機率值。然后以殺菌劑濃度的對數(shù)值為橫軸，以抑制率機率值為縱軸，得出LP-D線性方程y=ax+b，根據(jù)線性公式計算苯醚甲環(huán)唑?qū)婧诎卟【骶甑腅C50（抑制中濃度）及r值（相關(guān)系數(shù)）。以SPSS軟件對EC50進行正態(tài)分布檢驗，當P>0.05，則認為符合正態(tài)分布，反之，則為非正態(tài)分布。

2 結(jié)果與分析

2.1 苯醚甲環(huán)唑?qū)Σ煌婧诎卟【甑腅C50測定結(jié)果

由表1可知，苯醚甲環(huán)唑?qū)婧诎卟【腅C50分布在0.071 9～1.488 6 μg/mL范圍內(nèi)，平均值為0.507 2 μg/mL。菌株JS-2和菌株JS-23的EC50較高，分別為1.488 6、1.451 4 μg/mL。菌株JS-40、JS-43的EC50比較低，分別為0.071 9、0.106 1 μg/mL。最高值為最低值的20.70倍。

2.2 梨黑斑病菌敏感性分析

以SPSS檢驗正態(tài)性，由表2可知，W=0.863，P=0.000﹤0.05，說明各菌株對苯醚甲環(huán)唑敏感性的頻次分布不符合正態(tài)分布。偏度系數(shù)SK=1.462>0，分布呈正偏態(tài)分布，峰度系數(shù)ku大于0（圖1），表明金水地區(qū)黑斑病菌對苯醚甲環(huán)唑主體表現(xiàn)為敏感，但也出現(xiàn)了敏感性下降的菌株。

由于目前尚未見該病菌對殺菌劑敏感基線的報道，所以本研究以最小EC50為標準，計算供試菌株的抗性系數(shù)?？剐韵禂?shù)=待測菌株EC50/相對敏感菌株EC50?？剐韵禂?shù)1～3為敏感菌株，3～7為低抗菌株，7～10為中抗菌株，大于10的為高抗菌株。

3 小結(jié)與討論

為明確金水地區(qū)梨黑斑病菌對苯醚甲環(huán)唑的敏感性，本研究采用菌絲生長速率法測定了苯醚甲環(huán)唑?qū)鹚鎴@43個黑斑病菌菌株的EC50。W檢驗結(jié)果顯示，黑斑病菌對苯醚甲環(huán)唑敏感性的頻次分布呈正偏態(tài)分布。說明金水地區(qū)黑斑病菌株主體對苯醚甲環(huán)唑表現(xiàn)為敏感，但存在敏感性降低的菌株，可為梨黑斑病菌的抗藥性檢測及制定合理的化學(xué)防控策略提供理論依據(jù)。

但本研究僅測定了苯醚甲環(huán)唑?qū)z生長的EC50，還未開展對病原菌分生孢子的EC50的測定，而黑斑病菌的分生孢子在病害循環(huán)中是非常關(guān)鍵的一環(huán)[6，7]。黑斑病菌分生孢子對苯醚甲環(huán)唑的敏感性還需進一步的分析。此外，還應(yīng)對該地區(qū)梨黑斑病菌的抗藥性進行跟蹤，以確定發(fā)展動態(tài)，從而判斷是否產(chǎn)生嚴重抗藥性，進而及早采取有效措施，防止抗藥性發(fā)展。

參考文獻：

[1] TERAKAMI S，MORIYA S，ADACHI Y，et al. Fine mapping of the gene for susceptibility to black spot disease in Japanese pear（Pyrus pyrifolia Nakai）[J].Breeding Science，2016，66：271-280.

[2] 劉長令.世界農(nóng)藥大全·殺蟲劑卷[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2006.10-168.

[3] HENR？魱QUEZ S J L，SAEMIENTO V O，ALAC？魷N C P. Sensitivity of Venturia inaequalis Chilean isolates to difenoconazole，fenarimol，mancozeb and pyrimethanil[J].Chilean Journal of Agricultural Research，2011，71（1）：39-44.

[4] RCKANOVI E，MIHAJLOVI M，POTO NIK. In vitro sensitivity of Fusarium graminearum（Schwabe） to difenoconazole， prothioconazole and thiophanate-methyl[J].Pesticide Phytome- dicine，2010，25（4）：325-333.

[5] YIN Y N，LIU X，LI B Q，et al. Characterization of sterol demethylation inhibitor-resistant isolates of Fusarium asiatcum and F. graminearum collected from wheat in China[J].Phytophathology，2009，99（5）：487-497.

[6] 王貴元，崔文寧.梨黑斑病的生物學(xué)特性及其致病性研究進展[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)，2011（10）：16-18.

[7] 李永才，畢 陽.蘋果梨黑斑病的發(fā)生及侵染過程[J].植物保護學(xué)報，2006，33（2）：131-135.