蘇晴+鄧小飛++周人杰

[摘要] 目的 探討脂蛋白酯酶在compound K調(diào)節(jié)血脂水平中的作用。 方法 36只雄性SD大鼠隨機(jī)分為6組，除對照組外均給予高脂飲食，對照組和模型組給予生理鹽水腹腔注射，compound K給藥組分別給予compound K 1、3、9 mg/kg腹腔注射，GGPP組同時(shí)給予compound K 3、9 mg/kg GGPP。4周后處死動(dòng)物，取樣測定血脂、肝素后脂蛋白酯酶活性、脂蛋白酯酶表達(dá)水平等；培養(yǎng)大鼠肝細(xì)胞株BRL，分別給予compound K 3、10、30 μmol/L處理12 h后，檢測脂蛋白酯酶表達(dá)水平。 結(jié)果 與模型組比較，compound K 3、9 mg/kg組的總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、三酰甘油顯著降低，高密度脂蛋白膽固醇、肝素后血清脂蛋白酯酶活性和脂蛋白酯酶表達(dá)量顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），且呈劑量依賴性。體外細(xì)胞試驗(yàn)結(jié)果與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)一致。 結(jié)論 compound K能夠通過增加脂蛋白酯酶的表達(dá)和活性達(dá)到降低高脂飲食大鼠血清三酰甘油的作用，其機(jī)制與compound K激活肝X受體α相關(guān)。

[關(guān)鍵詞] compound K；動(dòng)脈粥樣硬化；脂蛋白酯酶；肝X受體α

[中圖分類號] R543 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）01（b）-0020-05

Role of lipoprotein lipase on serum lipid modulation of compound K

SU Qing DENG Xiaofei ZHOU Renjie

Department of Emergency， Xinqiao Hospital， the Third Military Medical University of PLA， Chongqing 400037， China

[Abstract] Objective To explore the role of lipoprotein lipase （LPL） on serum lipid modulation of compound K. Methods 36 male SD rats were divided into 6 groups. All animals were fed with high fat diet except control group. Control group and model group were given intraperitoneal injection of saline. compound K groups were treated with different doses of compound K （1， 3， 9 mg/kg）. GGPP group was administrated with compound K 3 and 9 mg/kg GGPP simultaneously. After 4 weeks， animals were sacrificed. Serum lipid profile， LPL activity and the expression of LPL mRNA and protein were measured. BRL cells were treated with different doses of compound K （3， 10， 30 μmol/L） for 12 h， and the expression levels of LPL were measured. Results Compared with model group， total cholesterol， low-density lipoprotein cholesterol and triglycerides levels of compound K 3 and 9 mg/kg groups were significantly decreased， high density lipoprotein cholesterol， serum lipoprotein lipase activity after heparin and LPL expression of compound K 3 and 9 mg/kg groups were significantly increased， with statistical differences （P < 0.05）， and the action depended on its dose. The results of in vitro cell experiments were consistent with animal experiments. Conclusion compound K can reduce the expression of serum triglyceride via up-regulation of LPL expression and activity， and the mechanism is associated with compound K activated liver X receptor α.

[Key words] compound K； Atherosclerosis； Lipoprotein lipase； Liver X receptor α

近年來，因動(dòng)脈粥樣硬化導(dǎo)致的心肌梗死、中風(fēng)等多種嚴(yán)重心腦血管疾病引發(fā)的死亡人數(shù)居各類疾病之首[1]。在目前廣泛采取防治措施的情況下，動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病率并沒有出現(xiàn)顯著的下降，提示現(xiàn)有防治手段尚待改進(jìn)，并亟需作用于新靶點(diǎn)的動(dòng)脈粥樣硬化防治藥物。compound K是二醇型人參皂苷經(jīng)過消化代謝后產(chǎn)生并吸收入血液循環(huán)的活性物[2-3]，具有多種藥理學(xué)活性。近期有研究證實(shí)，compound K能夠通過激活肝X受體α（liver X receptor α，LXRα）達(dá)到調(diào)節(jié)血脂和抗炎的作用，從而延緩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物動(dòng)脈粥樣硬化的形成[4]。

compound K作用靶點(diǎn)與現(xiàn)有調(diào)節(jié)血脂藥物不同，其機(jī)制也不相同。但目前的研究只關(guān)注了膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)通路的變化，解釋了低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）水平變化的機(jī)制，但對于三酰甘油（triglyceride，TG）水平變化的機(jī)制尚缺乏探討[4]。有研究證實(shí)，脂蛋白酯酶（lipoprotein lipase，LPL）在血脂代謝中也具有重要作用，血漿LPL是清除TG的限速酶，能夠通過催化富含TG的乳糜微粒水解供能或轉(zhuǎn)化為脂肪儲(chǔ)存，另外，LPL還在HDL-C合成中起一定的促進(jìn)作用。研究也表明，LPL單基因突變能夠?qū)е耇G異常升高和HDL-C降低等變化，并且顯著增加冠心病的危險(xiǎn)性[5-6]。本實(shí)驗(yàn)擬利用高血脂大鼠模型，對LPL在compound K調(diào)節(jié)血脂中的作用進(jìn)行探討，以進(jìn)一步深化對compound K防治動(dòng)脈粥樣硬化作用的機(jī)制研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑

雄性SD大鼠：180～200 g，8～10周齡，購于第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)前為SPF級飼養(yǎng)，許可證號：SYXK（渝）2012-0002；高脂飼料配置：3%膽固醇、10%豬油、0.2%丙基硫氧嘧啶及86.8%基礎(chǔ)飼料。compound K（上海同田生物技術(shù)股份有限公司，純度> 98%）；GGPP（Sigma-Aldrich，USA）；血清生化AU-2700全自動(dòng)生化分析儀標(biāo)準(zhǔn)品（Randox Laboratories Ltd，UK）；LPL活性檢測試劑盒（HY-60073，上海鈺博生物科技有限公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（RR047，Takara，Japan）；Real-time定量PCR試劑盒（RR820，Takara，Japan）；LPL一抗（sc-73646，Santa Cruz，USA）；HRP標(biāo)記羊抗小鼠IgG抗體（ZDR-5117，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

1.2 動(dòng)物分組

雄性SD大鼠36只隨機(jī)分為6組，每組6只，除對照組外均給予高脂飲食，compound K給藥組分別給予compound K 1、3、9 mg/kg腹腔注射，1次/d；對照組和模型組均給予生理鹽水腹腔注射；GGPP組同時(shí)給予compound K 3、9 mg/kg GGPP腹腔注射，共持續(xù)4周。

1.3 樣本采集

每周測量體重一次，在實(shí)驗(yàn)第4周禁食12 h后采血獲得血清后用于血脂水平的檢測；尾靜脈給予肝素321.5 U/kg，15 min后采集肝素后血清樣本用于LPL活性檢測；脫頸椎法處死動(dòng)物后，取肝臟用于Real-time PCR、Western blot檢測。

1.4 血脂水平測定

將血清置于AU-2700全自動(dòng)生化分析儀中檢測總膽固醇（total cholesterol，TC）、TG、HDL-C和LDL-C水平。

1.5 LPL活性及表達(dá)水平測定

使用LPL活性檢測試劑盒測定肝素后血清中LPL活性。Real-time PCR法測定肝臟組織中LPL mRNA表達(dá)水平，引物為5′-TCCCAACCATACAAGACTCC-3′，5′-ACGTCGTCCATTGCTTTTGC-3′；內(nèi)參為GAPDH，引物為5′-TGAAGGTCGGTGTGAACGGATTTGG-3′，5′-ACGACATACTCAGCACCAGCATCAC-3′。Western blot法測定肝臟組織中LPL蛋白表達(dá)水平，LPL一抗?jié)舛葹?∶500，二抗?jié)舛?∶5000。

1.6 細(xì)胞培養(yǎng)及處理

常規(guī)培養(yǎng)BRL大鼠肝細(xì)胞于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱。對照組給予空溶劑處理，藥物處理組分別給予compound K 3、10、30 μmol/L處理12 h，GGPP組在給予compound K 10 μmol/L的基礎(chǔ)上給予GGPP 10 mmol/L。Real-time PCR法及Western blot方法同上。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 compound K對大鼠體重的影響

各組大鼠體重在試驗(yàn)期間正常增長，各組大鼠體重比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見表1。

2.2 compound K對大鼠血脂水平的影響

模型組與對照組TC、LDL-C和TG比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），提示高血脂動(dòng)物模型造模成功。與模型組比較，compound K 3 mg/kg組、compound K 9 mg/kg組的TC、LDL-C和TG降低，HDL-C升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），且具有劑量依賴性。GGPP組與模型組TC、HDL-C、LDL-C和TG比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見表2。

2.3 compound K對大鼠肝素后血清LPL活性的影響

與對照組比較，模型組肝素后LPL活性降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；與模型組比較compound K 3 mg/kg組、compound K 9 mg/kg組的LPL活性升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），且各給藥組導(dǎo)致的LPL活性增高呈劑量依賴性。GGPP組與模型組的LPL活性比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見表3。

2.4 compound K對大鼠肝臟中LPL表達(dá)水平的影響

與對照組比較，模型組肝臟中LPL mRNA表達(dá)水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；模型組與對照組肝臟中LPL蛋白表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）；與模型組比較，compound K各劑量組的LPL mRNA表達(dá)水平呈劑量依賴性升高，分別為306%、557%和618%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；LPL蛋白表達(dá)水平與mRNA表達(dá)水平變化規(guī)律一致，各組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。GGPP組與模型組LPL mRNA和蛋白表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見圖1。

2.5 compound K對體外培養(yǎng)大鼠肝細(xì)胞LPL表達(dá)水平的影響

與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，與對照組比較，compound K 3、10、30 μmol/L組肝細(xì)胞中LPL mRNA表達(dá)水平呈劑量依賴性升高，分別為252%、317%、408%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；LPL蛋白表達(dá)水平變化與mRNA表達(dá)水平變化規(guī)律一致，且各組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。GGPP組LPL mRNA和蛋白表達(dá)水平與compound K 3、10、30 μmol/L組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），提示阻斷LXR途徑能夠抑制compound K導(dǎo)致的LPL蛋白表達(dá)水平增高。見圖2。

3 討論

compound K是二醇型人參皂苷（如Rb1等）在體內(nèi)的代謝產(chǎn)物，早期研究發(fā)現(xiàn)，口服Rb1后血清中只能檢測出compound K成分，而無Rb1[7]，且給腸道無微生物小鼠口服Rb1（200 mg/kg）后，血液中未檢測出Rb1及其代謝產(chǎn)物。提示compound K可能是口服二醇型人參皂苷后在體內(nèi)發(fā)揮藥理作用的活性代謝產(chǎn)物。研究發(fā)現(xiàn)，compound K具有多種藥理學(xué)活性，包括抑制多種腫瘤細(xì)胞生長[8-9]、增強(qiáng)順鉑化療效果[10]、抑制平滑肌細(xì)胞增殖[11]、激動(dòng)糖皮質(zhì)激素受體[12]、緩解嗎啡成癮[13]和抗炎作用[14]等，但對于compound K對心血管系統(tǒng)和血脂代謝方面的藥理學(xué)研究還比較少見。本研究通過體內(nèi)外試驗(yàn)探索了compound K對血脂代謝關(guān)鍵酶LPL的可能作用及機(jī)制。

本研究結(jié)果中compound K能夠顯著降低LDL-C和升高HDL-C的活性，與Zhou等[4]對膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)活性方面的研究結(jié)果一致。本研究還發(fā)現(xiàn)，compound K能夠?qū)е赂咧嬍炒笫笱逯蠺G顯著下降。TG是動(dòng)脈粥樣硬化形成的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，目前臨床上廣泛使用的苯氧乙酸類（貝特類）降血脂藥就是以降低TG水平為靶點(diǎn)的。本研究結(jié)果提示，compound K除了能夠通過增強(qiáng)膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)的途徑達(dá)到防治動(dòng)脈粥樣硬化的目的外，還具有顯著降低TG的作用。為探索compound K降低TG水平的機(jī)制，我們對在TG代謝中起重要作用的LPL活性進(jìn)行了檢測。結(jié)果顯示，compound K能夠?qū)е赂嗡睾笱逯蠰PL活性的顯著升高，其變化規(guī)律與TG水平的變化規(guī)律一致。且該活性升高的機(jī)制與LPL表達(dá)水平增高有關(guān)，其上調(diào)作用發(fā)生在轉(zhuǎn)錄環(huán)節(jié)。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)也得到相同的結(jié)果。結(jié)合關(guān)于compound K具有LXRα激動(dòng)劑作用的結(jié)果，以及LXRα具有調(diào)節(jié)LPL轉(zhuǎn)錄表達(dá)作用的報(bào)道，我們推測，compound K上調(diào)LPL表達(dá)與激活LXRα有關(guān)。故利用GGPP阻斷LXRα的活性進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示，GGPP在體內(nèi)外試驗(yàn)中均能夠顯著抑制compound K導(dǎo)致的LPL表達(dá)水平上調(diào)，提示compound K上調(diào)LPL表達(dá)水平確與其激活LXRα相關(guān)。

血管內(nèi)皮上的LPL能夠有效地脂解富含TG脂蛋白，使其轉(zhuǎn)變?yōu)椴灰字聞?dòng)脈粥樣硬化的脂蛋白譜[15]，并在HDL-C的形成中具有重要作用[16]，故LPL活性的增高對動(dòng)脈粥樣硬化病變具有一定的保護(hù)作用，還能改善高脂飲食導(dǎo)致的代謝功能紊亂[17-18]。盡管有研究發(fā)現(xiàn)特異性地增加動(dòng)脈壁巨噬細(xì)胞LPL的表達(dá)可能通過促進(jìn)LDL在內(nèi)皮下基質(zhì)的潴留而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程[19]，但研究認(rèn)為，LPL對動(dòng)脈粥樣硬化的具體作用與其表達(dá)部位關(guān)系更密切[20]，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的肝臟中LPL表達(dá)增高與乳糜微粒在肝臟中的攝取和代謝水平增高有關(guān)，提示compound K調(diào)節(jié)血脂從而抑制動(dòng)脈粥樣硬化形成的作用可能與其增加LPL活性有關(guān)。故深入探索compound K上調(diào)LPL表達(dá)及活性的機(jī)制，進(jìn)一步明確其構(gòu)效關(guān)系，可能為將來研發(fā)更有效的動(dòng)脈粥樣硬化防治藥物提供新的策略和靶點(diǎn)。

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（收稿日期：2016-10-02 本文編輯：李亞聰）