李慧玲++吳驍++王丹

[摘要] 目的 觀(guān)察木犀草苷對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化的抑制作用。 方法 用噻唑藍(lán)（MTT）法檢測(cè)木犀草苷對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖的影響；用雞尾酒法誘導(dǎo)3T3-L1細(xì)胞分化，用油紅O染色、三酰甘油含量檢測(cè)脂肪細(xì)胞分化程度；采用RT-PCR和Western blot方法檢測(cè)木犀草苷對(duì)脂肪細(xì)胞過(guò)氧化物酶體增殖物活化受體γ（PPARγ）、CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α（C/EBPα）mRNA和蛋白表達(dá)的影響。 結(jié)果 木犀草苷5～80 μmol/L不影響細(xì)胞活性，160～320 μmol/L顯著抑制細(xì)胞活性，呈劑量依賴(lài)性抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞的分化，顯著降低脂肪細(xì)胞PPARγ、C/EBPα mRNA和蛋白的表達(dá)。 結(jié)論 木犀草苷能抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化，減少脂質(zhì)聚集，是通過(guò)下調(diào)PPARγ、C/EBPα的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。

[關(guān)鍵詞] 木犀草苷；3T3-L1前脂肪細(xì)胞；分化；PPARγ；C/EBPα

[中圖分類(lèi)號(hào)] R285 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2017）01（b）-0016-04

Inhibitory effect of galuteolin on the differentiation of 3T3-L1 preadipocyte

LI Huiling1 WU Xiao2 WANG Dan3 ZHANG Qiuhua1

1.Staff Room of Basic Pharmacology， Liaoning University of Traditional Chinese Medicine， Liaoning Province， Shenyang 110847， China； 2.Experimental Animal Center， He University， Liaoning Province， Shenyang 110163， China； 3.Staff Room of Histology and Embryology， Basic Medical College， Jinzhou Medical University， Liaoning Province， Jinzhou 121001， China

[Abstract] Objective To observe the inhibitory effect of galuteolin on the differentiation of 3T3-L1 preadipocyte. Methods The effect of galuteolin on the proliferation of 3T3-L1 preadipocyte was detected by methyl thiazolyl tetrazolium （MTT）； the differentiation of 3T3-L1 preadipocyte was induced by the cocktail method， the differentiation degree of preadipocyte was detected by oil red O staining and the content of triacylglycerol； the effects of galuteolin for the mRNA and protein expression of peroxisome proliferator activated receptor-γ （PPARγ） and CCAAT/enhancer binding protein α （C/EBPα） were measured by RT-PCR and Western blot. Results The concentration of 5-80 μmol/L galuteolin did not affect the cell activity， 160-320 μmol/L galuteolin could significantly inhibit the cell activity， which could significantly inhibit the differentiation of 3T3-L1 preadipocyte in a dose-dependent manner and decrease the mRNA and protein expression of PPARγ and C/EBPα. Conclusion Galuteolin can inhibit the differentiation of 3T3-L1 preadipocyte， reduce the lipid accumulation， which may be realized by down-regulating the expression of PPARγ and C/EBPα.

[Key words] Galuteolin； 3T3-L1 preadipocyte； Differentiation； PPARγ； C/EBPα

肥胖是高血壓病、2型糖尿病、心血管疾病、癌癥等的高危誘發(fā)因素，已成為快速增長(zhǎng)并蔓延全球的公共健康威脅[1-5]，它是由遺傳、環(huán)境等特定因素引起的進(jìn)食調(diào)控和能量代謝紊亂，使脂肪積聚過(guò)多、體重超常的內(nèi)分泌代謝疾病。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素、白藜蘆醇、槲皮素等黃酮類(lèi)化合物有較好的減肥作用[7]。木犀草苷是豆茶決明、金銀花、荊芥等植物中的天然黃酮類(lèi)化合物[6]。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，豆茶決明有減肥作用[8]，其中包含黃酮類(lèi)化合物木犀草苷。本研究主要探討木犀草苷對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化的影響及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

VARIOSKAN FIASH酶標(biāo)儀（Thermo Scientific）；CKX41倒置生物顯微鏡（中國(guó)OLYMPUS有限公司）；HERAcell 150i細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo Scientific）；YJ-VS超凈工作臺(tái)（天錫一凈凈化設(shè)備有限公司）；Hema480基因擴(kuò)增儀（珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司）；DYY-8B穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（北京市六一儀器廠(chǎng)）；PE2400型多功能PCR儀（美國(guó)Perking公司）。

1.2 主要試劑

3T3-L1前脂肪細(xì)胞（復(fù)旦IBS細(xì)胞資源中心FDCC）；木犀草苷（北京索萊寶科技有限公司，純度≥98%，批號(hào)20150511）；3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（IBMX）、地塞米松（DEX）、胰島素（Ins）（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)20151118、822A0522、601C022）；油紅O染液（西安赫特生物科技有限公司，批號(hào)20151103）；噻唑藍(lán)（MTT）、兔抗-PPARG多克隆抗體、兔抗-CEBPA多克隆抗體（上海碧云天生物科技有限公司，批號(hào)0101181501、20151208、20160123）；三酰甘油（TG）測(cè)試盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)20160108）；兔二步法檢測(cè)試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào)K156911D）。PCR引物委托上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

1.3 “雞尾酒誘導(dǎo)法”誘導(dǎo)3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化

參考Ariemma等[9]的方法，將3T3-L1前脂肪細(xì)胞用含10%胎牛血清（FBS）的DMEM高糖培養(yǎng)液在5%CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，細(xì)胞100%融合后，再培養(yǎng)2 d，換上含有10% FBS、0.5 mmol/L IBMX、1 μmol/L DEX和10 μg/mL Ins的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)2 d，更換含有10% FBS和10 μg/mL Ins的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，2 d后更換含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液，至分化完成。木犀草苷在每次誘導(dǎo)時(shí)同時(shí)加入。

1.4 MTT法檢測(cè)木犀草苷對(duì)細(xì)胞增殖的影響

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以每孔1×104個(gè)細(xì)胞接種到96孔板中。5%CO2、37℃培養(yǎng)48 h后，加入0、5、10、20、40、80、160、320 μmol/L的木犀草苷，設(shè)24、48、72、96 h時(shí)間點(diǎn)，MTT法，490 nm測(cè)定吸光值[10]。

1.5 油紅O染色檢測(cè)細(xì)胞分化和脂質(zhì)含量

誘導(dǎo)3T3-L1細(xì)胞分化的同時(shí)，分別加入5、20、80 μmol/L的木犀草苷，11 d后，用0.01 mol/L PBS洗2次，按油紅O染液說(shuō)明書(shū)操作，倒置顯微鏡觀(guān)察脂滴并拍照。然后加入100%異丙醇，溶出油紅，510 nm測(cè)吸光值[11]。

1.6 TG含量檢測(cè)

3T3-L1細(xì)胞按“1.3”分化加藥11 d后，用0.01 mol/L PBS洗2次，蛋白裂解液裂解，用細(xì)胞刮收集細(xì)胞，TG測(cè)試盒測(cè)定TG含量。用BCA蛋白試劑盒定量裂解液中蛋白含量。

1.7 RT-PCR檢測(cè)成脂分化基因的表達(dá)

按“1.3”分化處理11 d后，用BEYOZOL試劑提取總RNA，用基因擴(kuò)增儀將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。RT-PCR的相關(guān)基因引物序列見(jiàn)表1[10]。

1.8 Western blot檢測(cè)分化基因的表達(dá)

收集誘導(dǎo)分化的細(xì)胞，Western blot方法[12]測(cè)定PPARγ、C/EBPα的蛋白表達(dá)。以β-Actin為內(nèi)參。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間差異采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 木犀草苷對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖的影響

木犀草苷在5～160 μmol/L濃度時(shí)對(duì)細(xì)胞增殖沒(méi)有影響，在給藥72、96 h后，160～320 μmol/L濃度能降低前脂肪細(xì)胞的增殖和細(xì)胞活性（圖1）。后續(xù)選擇5、20、80 μmol/L劑量，研究其對(duì)3T3-L1前脂肪分化的影響。

2.2 木犀草苷對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化的影響

油紅O染色結(jié)果顯示，木犀草苷5、20、80 μmol/L組所含紅色“戒環(huán)”樣脂滴數(shù)和TG含量較對(duì)照組明顯減少（圖2～3），表明其可明顯抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化。

2.3 木犀草苷對(duì)脂肪分化相關(guān)基因表達(dá)的影響

C/EBPα和PPARγ是前脂肪細(xì)胞分化的關(guān)鍵調(diào)控因子。圖4～5結(jié)果表明木犀草苷各劑量組均能顯著下調(diào)3T3-L1前脂肪細(xì)胞C/EBPα和PPARγ mRNA和蛋白的表達(dá)水平。

3 討論

肥胖發(fā)生源于脂肪組織的大量聚集，是由脂肪組織細(xì)胞數(shù)量增多和體積增大引發(fā)的，是前脂肪細(xì)胞增殖分化的結(jié)果[13-14]。本研究結(jié)果表明，木犀草苷濃度在5～80 μmol/L不影響細(xì)胞活性，在160～320 μmol/L顯著抑制細(xì)胞活性，降低脂質(zhì)的沉積，減少TG含量。這些結(jié)果表明，木犀草苷能抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞的分化。

脂肪生成是由轉(zhuǎn)錄因子激活的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路嚴(yán)格監(jiān)控的復(fù)雜過(guò)程[15-16]，涉及最核心轉(zhuǎn)錄因子PPARγ、CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白（C/EBPα、C/EBPβ和C/EBPδ）的調(diào)控。C/EBPβ和C/EBPδ在分化的早期表達(dá)，誘導(dǎo)PPARγ和C/EBPα的表達(dá)。PPARγ和C/EBPα協(xié)同作用，激活脂肪細(xì)胞特異性基因表達(dá)導(dǎo)致脂肪細(xì)胞最終的分化，脂滴形成[17-22]。本研究發(fā)現(xiàn)，木犀草苷能顯著降低PPARγ和C/EBPα mRNA和蛋白的表達(dá)，因此，筆者推測(cè)木犀草苷是通過(guò)抑制PPARγ和C/EBPα的表達(dá)而降低3T3-L1細(xì)胞分化和TG含量。

本研究通過(guò)“雞尾酒法”誘導(dǎo)3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化，提示木犀草苷能抑制前脂肪細(xì)胞分化，降低脂質(zhì)沉積，機(jī)制與抑制脂肪細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子C/EBPα和PPARγ的表達(dá)有關(guān)。此機(jī)制為木犀草苷在脂類(lèi)代謝中的作用提供了理論依據(jù)。

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（收稿日期：2016-11-01 本文編輯：張瑜杰）