井賀楠++李靜雅++許芝山++楊如++路平

[摘要] 目的 研究食管癌中CD137/CD137L的表達(dá)情況，并分析兩者在食管癌中表達(dá)的意義及其與預(yù)后的關(guān)系。 方法 以購自上海芯超生物科技有限公司的食管癌組織芯片為研究對(duì)象，采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)組織芯片中87例食管癌組織及其相應(yīng)的癌旁組織中CD137/CD137L的表達(dá)情況；采用χ2檢驗(yàn)或Fisher's精確檢驗(yàn)的方法分析食管癌及癌旁組織中CD137/CD137L的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系；采用Kaplan-Meier法分析CD137/CD137L的表達(dá)與食管癌患者預(yù)后的關(guān)系。 結(jié)果 在87例食管癌組織和相應(yīng)的癌旁組織中CD137的陽性表達(dá)率分別為36.8%和72.4%，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。在87例食管癌組織和相應(yīng)的癌旁組織中CD137L的陽性表達(dá)率分別為57.5%和96.6%，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。食管癌中CD137表達(dá)陽性率與浸潤深度相關(guān)（P < 0.05），而與年齡、性別、腫瘤部位、分化程度、臨床分期均不相關(guān)（P > 0.05）。食管癌中CD137L表達(dá)與臨床分期相關(guān)（P < 0.05），而與年齡、性別、腫瘤部位、分化程度、浸潤深度均不相關(guān)（P > 0.05）。CD137表達(dá)與食管癌患者的預(yù)后不相關(guān)（P=0.6301），CD137L表達(dá)與食管癌患者的預(yù)后相關(guān)（P=0.0368）。 結(jié)論 CD137L的表達(dá)水平是影響食管癌患者預(yù)后的獨(dú)立因素；CD137/CD137L可能在食管癌的抗腫瘤免疫中發(fā)揮重要作用。

[關(guān)鍵詞] 食管癌；CD137；CD137L；預(yù)后

[中圖分類號(hào)] R735.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2017）01（b）-0004-05

The expression of CD137/CD137L in esophageal cancer and its correlation with prognosis

JING He'nan1，2 LI Jingya1 XU Zhishan1 YANG Ru1 LU Ping2 ZHAO Baosheng3 ZHONG Genshen1，2

1.Research Center of Life Sciences & Technology， the First Affiliated Hospital of Xinxiang Medical University， He'nan Province， Weihui 453100， China； 2.Department of Oncology， the First Affiliated Hospital of Xinxiang Medical University， He'nan Province， Weihui 453100， China； 3.The Second Department of Thoracic Surgery， the First Affiliated Hospital of Xinxiang Medical University， He'nan Province， Weihui 453100， China

[Abstract] Objective To investigate the expression of CD137/CD137L in esophageal cancer， and analyze the significance and correlation with disease prognosis. Methods The esophageal tissue chip purchased from Xinchao Biological Technology co. LTD， Shanghai was taken as the research object. Immunohistochemical method was used to detect the expression of CD137/CD137L of 87 cases of esophageal cancer tissues and its corresponding adjacent tissues in the tissue chip. Chi-square test or Fisher's inspection method was used to analyze the relationship of the expression of CD137/CD137L and the clinical pathological features in esophageal cancer tissue and corresponding adjacent tissue. Kaplan-Meier method was used to analyze the relationship between the expression of CD137/CD137L and the prognosis of esophageal cancer. Results The positive expression rate of CD137 in 87 cases esophageal cancer tissues and corresponding adjacent tissue was 36.8% and 72.4% respectively， the difference was statistically significant （P < 0.05）. The positive expression rate of CD137L in 87 cases esophageal cancer tissues and corresponding adjacent tissue was 57.5% and 96.6% respectively， the difference was statistically significant （P < 0.05）. The positive expression rate of CD137 in esophageal carcinoma tissues was related to depth of invasion （P < 0.05）， but no relation with gender， age， tumor site， differentiated degree and clinical stage （P > 0.05）. The positive expression rate of CD137L in esophageal carcinoma tissues was related to clinical stage （P < 0.05）， but no relation with gender， age， tumor site， differentiated degree and depth of invasion （P > 0.05）. The expression rate of CD137 was not related with the prognosis of esophageal cancer （P=0.6301）. The expression rate of CD137L was related with the prognosis of esophageal cancer （P=0.0368）. Conclusion The expression level of CD137L is a prognostic factor of esophageal cancer； CD137/CD137L may play an important role in antitumor immunity of esophageal cancer.

[Key words] Esophageal cancer； CD137； CD137L； Prognosis

食管癌是我國常見的消化道惡性腫瘤，其發(fā)病率在所有腫瘤中居第4位[1]。盡管有多種治療策略，但食管癌5年生存率仍低于40%[2]，新的治療手段仍有待進(jìn)一步研發(fā)和探索。近些年來研究發(fā)現(xiàn)免疫治療有望成為新的腫瘤治療方法。眾所周知，T淋巴細(xì)胞在抗腫瘤免疫中發(fā)揮主要作用，而T淋巴細(xì)胞的激活需要抗原呈遞信號(hào)與協(xié)同刺激信號(hào)的雙重協(xié)同刺激。研究發(fā)現(xiàn)，通過應(yīng)用特定協(xié)同刺激分子的激動(dòng)性或者抑制性單克隆抗體信號(hào)來調(diào)節(jié)機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)可達(dá)到抗腫瘤的效果[3]。CD137/CD137L是繼PD-1/PD-L1、CD28/B7之后的又一重要的共刺激分子。CD137具有促進(jìn)活化T細(xì)胞向腫瘤部位轉(zhuǎn)移、抑制活化T細(xì)胞的凋亡、增強(qiáng)毒性殺傷T細(xì)胞的殺傷毒性的作用[4]。因此CD137/CD137L一度成為腫瘤免疫治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。近些年來，特異性的激動(dòng)型抗CD137單克隆抗體被開發(fā)并進(jìn)行臨床實(shí)驗(yàn)，初步顯現(xiàn)出其增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤免疫應(yīng)答的作用[5-6]。然而CD137/CD137L在食管癌中表達(dá)情況還少有文獻(xiàn)報(bào)道，因此本研究通過檢測(cè)分析食管癌中CD137/CD137L的表達(dá)，并對(duì)比相應(yīng)臨床病理特征來探討兩者在食管癌中表達(dá)的意義及與預(yù)后的關(guān)系，為CD137/CD137L相關(guān)的免疫治療在食管癌中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

食管癌組織芯片購自上海芯超生物科技有限公司，產(chǎn)品編號(hào)：[食管，180] HEso-Squ180Sur-03，所有患者術(shù)前均未接受過任何治療，具有完整的臨床資料；CD137單克隆抗體購自美國Abcam公司；CD137L單克隆抗體購自SinoBiological公司。山羊抗兔單克隆抗體、DAB顯色液、過氧化氫均購自上?；蚩萍忌锕?；改進(jìn)型枸櫞酸鹽抗原修復(fù)液購自博士德生物公司；山羊血清購自碧云天生物科技有限公司。

1.2 方法

將組織芯片進(jìn)行常規(guī)脫蠟、復(fù)水，然后按照標(biāo)準(zhǔn)的免疫組織化學(xué)操作流程逐步進(jìn)行抗原修復(fù)、中和內(nèi)源性的過氧化氫酶、血清封閉、滴加一抗（濃度1∶50）、4℃過夜、滴加二抗（濃度1∶100）、DAB顯色、復(fù)染、中性樹膠封片、觀察。用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。對(duì)于陽性染色結(jié)果的判定采用雙盲法進(jìn)行，由2名高年資病理科醫(yī)師獨(dú)立讀片。結(jié)果判定：CD137和CD137L的陽性表達(dá)主要定位于細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞膜，陽性表達(dá)表現(xiàn)為黃色或棕黃色顆粒。每張切片隨機(jī)挑選5個(gè)視野（400×），統(tǒng)計(jì)細(xì)胞數(shù)，先根據(jù)陽性細(xì)胞所占的百分?jǐn)?shù)計(jì)分：<5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分；再根據(jù)陽性細(xì)胞著色程度計(jì)分：無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，褐黃色為3分。將兩者相乘所得的總分進(jìn)行結(jié)果判定，分別對(duì)應(yīng)4種表達(dá)強(qiáng)度。陰性（-）：評(píng)分0～1分，弱陽性（+）：評(píng)分2～4分，中度陽性（++）：評(píng)分5～8分，強(qiáng)陽性（+++）：評(píng)分9～12分；將“+～+++”統(tǒng)計(jì)為陽性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher's精確檢驗(yàn)；采用Kaplan-Meier法比較生存情況，并行l(wèi)og-rank檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 食管癌和相應(yīng)癌旁組織中CD137的表達(dá)情況

食管癌細(xì)胞上CD137無明顯可見的陽性表達(dá)。87例食管癌組織中有32例CD137表達(dá)陽性，陽性率為36.8%；相應(yīng)癌旁組織中CD137表達(dá)陽性63例，陽性率為72.4%；兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見表1、圖1（封四）。

2.2 食管癌和相應(yīng)癌旁組織中CD137L的表達(dá)情況

87例食管癌組織中，CD137L表達(dá)陽性50例，陽性率為57.6%，顯著低于相應(yīng)癌旁組織中的96.6%，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見表1、圖1（封四）。

表1 CD137、CD137L在食管癌和相應(yīng)癌旁組織中表達(dá)情況（例）

2.3 食管癌組織中CD137表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

在87例食管癌組織中CD137陽性表達(dá)率與患者的年齡、性別、腫瘤部位、分化程度、臨床分期均不相關(guān)（P > 0.05），而與浸潤深度相關(guān)（P < 0.05）。見表2。

表2 食管癌組織中CD137表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系（例）

2.4 食管癌組織中CD137L表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

在87例食管癌組織中CD137L陽性表達(dá)率與患者的年齡、性別、腫瘤部位、分化程度、浸潤深度均不相關(guān)（P > 0.05），而與臨床分期相關(guān)（P < 0.05）。見表3。

2.5 食管癌組織中CD137、CD137L的表達(dá)與患者預(yù)后相關(guān)性

食管癌組織中CD137表達(dá)與食管癌患者的預(yù)后不相關(guān)（P=0.6301）；CD137L表達(dá)與食管癌患者的預(yù)后相關(guān)（P=0.0368）。見圖2、3。

3 討論

腫瘤的免疫治療是運(yùn)用免疫調(diào)節(jié)分子增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤反應(yīng)來治療腫瘤的新方法。協(xié)同刺激分子是一類在機(jī)體免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用的調(diào)節(jié)分子。其中，CD137及其配體CD137L是繼CD28/B7之后的又一重要的協(xié)同刺激分子。研究表明，CD137主要表達(dá)于活化的T細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、單核細(xì)胞表面[7]，具有促進(jìn)T細(xì)胞增殖分化、促進(jìn)細(xì)胞因子產(chǎn)生[8]、增強(qiáng)毒性殺傷細(xì)胞活性[9]的功能。另有研究顯示，CD137固有表達(dá)CD4+CD25+免疫調(diào)節(jié)性T細(xì)胞[10]。而機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)主要依賴于T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫[11]。這都提示CD137在抗腫瘤免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。

CD137屬于腫瘤壞死因子超家族的一種跨膜糖蛋白，其主要表達(dá)于活化的T細(xì)胞、NK細(xì)胞以及樹突狀細(xì)胞表面[7]。然而CD137在實(shí)體腫瘤細(xì)胞上表達(dá)情況頗有爭議。Broll等[12]研究發(fā)現(xiàn)，CD137在惡性腫瘤中呈現(xiàn)高表達(dá)，而在良性腫瘤、炎癥及正常組織中不表達(dá)，陽性表達(dá)主要分布于腫瘤組織的血管壁上。新近的研究發(fā)現(xiàn)[13]，霍奇金淋巴瘤的RS細(xì)胞上亦存在CD137的表達(dá)，其陽性表達(dá)率為85.7%。而在一項(xiàng)結(jié)腸癌的研究中發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌細(xì)胞上CD137的表達(dá)呈陰性[14]。為研究CD137在食管癌組織細(xì)胞中的表達(dá)，本研究采用免疫組織化學(xué)的方法對(duì)87例食管癌組織和相應(yīng)癌旁組織中的CD137表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，食管癌組織中CD137的陽性表達(dá)主要分布于腫瘤的間質(zhì)細(xì)胞中，87例食管癌組織中有32例為陽性，陽性率為36.8%，而在食管癌腫瘤細(xì)胞中CD137的表達(dá)均為陰性；而CD137在相應(yīng)的癌旁組織中的表達(dá)陽性率為72.4%，明顯高于食管癌組，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。

CD137需要與其唯一的配體CD137L相結(jié)合形成復(fù)合物才能發(fā)揮其生物活性[15]，其分子機(jī)制目前還不太清楚。研究證實(shí)，CD137L表達(dá)于多數(shù)實(shí)體性腫瘤細(xì)胞上[16]。本研究通過對(duì)87例食管癌組織中CD137L的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)分析，也證實(shí)了這一觀點(diǎn)；食管癌組織中CD137L的表達(dá)陽性率為57.6%，明顯低于相應(yīng)癌旁組織中CD137L的陽性表達(dá)（96.6%），兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。

腫瘤組織中低表達(dá)和不表達(dá)免疫共刺激分子是腫瘤免疫逃逸的機(jī)制之一[17]。本研究顯示，食管癌組織中CD137和CD137L的表達(dá)水平均低于癌旁組織，表明在食管癌中存在免疫共刺激分子的表達(dá)抑制，其具體的分子機(jī)制尚不清楚。研究證實(shí)，激活機(jī)體抗腫瘤免疫的關(guān)鍵是免疫細(xì)胞識(shí)別腫瘤組織中的特異性抗原，而腫瘤組織中常低表達(dá)或不表達(dá)特異性的抗原[18]，這也是腫瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視的重要原因。另外，腫瘤組織中存在轉(zhuǎn)化生長因子-β、白介素-10[19]等免疫抑制因子的免疫抑制作用導(dǎo)致腫瘤組織內(nèi)活化的T淋巴細(xì)胞減少，而CD137主要表達(dá)于激活狀態(tài)的T細(xì)胞上，因此推測(cè)食管癌中CD137陽性淋巴細(xì)胞數(shù)低于相應(yīng)癌旁組織可能與此相關(guān)。

本研究將食管癌中CD137和CD137L的表達(dá)與患者臨床病理資料進(jìn)行對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)，CD137的表達(dá)與患者的年齡、性別、腫瘤部位、分化程度、臨床分期均不相關(guān)（P > 0.05），而與浸潤深度相關(guān)（P < 0.05），即隨著食管癌浸潤深度的增加，CD137的表達(dá)逐漸降低；CD137L的表達(dá)與患者的年齡、性別、腫瘤部位、分化程度、浸潤深度均不相關(guān)（P > 0.05），而與臨床分期相關(guān)（P < 0.05），即隨著臨床分期的增加，CD137L的表達(dá)逐漸降低。提示食管癌中CD137和CD137L的表達(dá)可能與患者不良預(yù)后相關(guān)。本研究分別對(duì)87例食管癌患者的生存期進(jìn)行生存分析，結(jié)果顯示，CD137L的表達(dá)與食管癌患者的預(yù)后相關(guān)（P=0.0368），而CD137的表達(dá)與食管癌患者的預(yù)后不相關(guān)（P=0.6301）。這可能與CD137在食管癌組織中存在表達(dá)抑制相關(guān)。同時(shí)也為CD137和CD137L相關(guān)的免疫治療在食管癌中的應(yīng)用提供了一個(gè)理論基礎(chǔ)。

綜上所述，本研究通過免疫組化的方法初步證實(shí)了食管癌組織中CD137和CD137L的表達(dá)均低于相應(yīng)的癌旁組織。CD137和CD137L在食管癌中的表達(dá)分別與浸潤深度和臨床分期相關(guān)。由此推測(cè)CD137/CD137L可能在食管癌的抗腫瘤免疫中發(fā)揮重要作用。這為CD137/CD137L相關(guān)的免疫治療在食管癌中的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)，但本研究還存在諸多的不足之處，為了得到更精確的評(píng)估，還需要大樣本研究和長時(shí)間隨訪進(jìn)一步驗(yàn)證。

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（收稿日期：2016-09-21 本文編輯：程 銘）