柴娟

·論著·

PCR與RT-PCR檢測咽拭子標本中肺炎支原體對比分析

柴娟

目的：分析聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)與逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)檢測咽拭子標本中肺炎支原體對比情況，為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。方法：選取河北省中醫(yī)院已采集咽拭子標本需檢測肺炎支原體的患者328例的臨床資料，臨床確診感染肺炎支原體患兒69例，疑似感染患兒259例，比較PCR與Rt-PCR檢測結(jié)果陽性率、靈敏度、特異度。結(jié)果：328例患者的咽拭子標本中，PCR共檢出肺炎支原體陽性標本33例，陽性率為10.06%。Rt-PCR共檢出肺炎支原體陽性標本65例，陽性率為19.82%。Rt-PCR檢測陽性率高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。PCR的靈敏度(18.84%)比Rt-PCR的靈敏度(88.41%)低，且2者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。PCR的特異度(87.64%)比Rt-PCR的特異度(94.59%)低，且2者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論：在檢測咽拭子中肺炎支原體時，Rt-PCR檢測的陽性率、靈敏度以及特異度均優(yōu)于PCR，值得在臨床上推廣。

肺炎支原體； 聚合酶鏈反應(yīng)； 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)

支原體肺炎(mycoplasma pneumonia)又稱原發(fā)性非典型肺炎或者冷凝集陽性肺炎，是一種“非典型肺炎”，它是指由肺炎支原體(mycoplasma pneumoniae，MP)感染，而引起的、呈間質(zhì)性肺炎及毛細支氣管炎樣改變。支原體肺炎臨床上常表現(xiàn)為頑固性劇烈咳嗽、畏寒、頭痛等，它的發(fā)病高峰年齡是學(xué)齡前期和學(xué)齡期兒童，其中3～15歲兒童的社區(qū)獲得性肺炎(community acquired pneumonia，CAP)中7%～30%是由肺炎支原體感染引起的[1]。肺炎支原體是兒童時期肺炎和其他呼吸道感染的重要病原體之一，臨床上應(yīng)根據(jù)其臨床特點進行早期診斷、早期治療[2]。目前在臨床上，對于診斷支原體肺炎的主要依據(jù)是實驗室檢查。其中病原學(xué)診斷是確診的有力依據(jù)，病原學(xué)診斷的方法有分離培養(yǎng)、血清學(xué)診斷以及核酸診斷。肺炎支原體的診斷方法不同時，它的特異性和準確率也不盡相同。本次資料通過對咽拭子標本分別采用聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)與逆轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription PCR，RT-PCR)的方法檢測肺炎支原體，并進行對比分析，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 資料與方法

1.1 資料 選取筆者所在河北省中醫(yī)院2011年5月-2016年5月已采集咽拭子標本需檢測肺炎支原體的患者328例，男171例，占52.13%；女157例，占47.87%。年齡1個月～16歲，平均年齡(3.12±0.69)歲。其中肺炎支原體感染病例69例，占21.04%，以及臨床疑似肺炎支原體感染病例259例，占78.96%。臨床疑似病例中包括支氣管炎或肺炎的病例138例，占53.28%，只出現(xiàn)發(fā)熱或者咳嗽并且無其他癥狀的患者121例，占46.72%。納入標準：(1)本次研究對象均符合《急性氣管-支氣管炎中醫(yī)診療指南(2015版)》[3]中關(guān)于支原體肺炎的診斷標準，即劇烈、持續(xù)咳嗽，白細胞數(shù)增加，發(fā)熱，呼吸窘迫，胸腔積液，胸痛等。(2)本次研究已經(jīng)倫理學(xué)委員會批準，且患者知情同意。排除標準：嚴重精神障礙、意識障礙，治療依從性較差，家族遺傳病史等患者。

1.2 方法 標本的采集處理：選用國家批準生產(chǎn)的一次性使用的咽拭子(生產(chǎn)廠家：深圳市華晨陽科技有限公司；型號：華晨陽CY96000)，拭子應(yīng)當(dāng)包括潔凈海綿頭、PP桿、PP桿與海綿頭應(yīng)連接牢固，經(jīng)無塵清洗包裝。參照《臨床檢驗標本采集送檢手冊》[4]進行采樣，用彎壓舌板向后壓舌，將拭子伸入咽部，轉(zhuǎn)動拭子取出粘液，在咽拭子標本試管中加入1mL無菌生理鹽水(生產(chǎn)廠家：西安京西雙鶴藥業(yè)有限公司；規(guī)格：500 mL,4.5 g；國藥準字H20059041)，充分震蕩搖勻，將拭子在管壁充分擠壓后丟棄，密封試管并送往檢測。(1)PCR法檢測：吸取樣品液轉(zhuǎn)至1.5 mL離心機(生產(chǎn)廠家：上海嘉措儀器設(shè)備有限公司；型號：HC-3018R)離心管中，12 000 r/min離心5 min。棄上清取沉淀加入50 μL核酸提取液，混勻后2 000 r/min離心10 s，100℃水浴或干浴10 min，12 000 r/min離心10 min，上清供PCR擴增用。然后嚴格按照ELISA試劑盒(生產(chǎn)廠家：上海一基實業(yè)有限公司)說明書處理樣品，最后對比樣品與標準品的熒光值以判定檢驗結(jié)果。所有操作均符合實驗室管理規(guī)范。(2)Rt-PCR法檢測：根據(jù)Rt-PCR試劑盒(生產(chǎn)廠家：上海普振生物科技有限公司；型號：M-MLV)說明書的步驟進行操作檢測，電腦將會在完成反應(yīng)后，自動采集并分析結(jié)果。

1.3 診斷 診斷標準:(1)臨床診斷。陣發(fā)性刺激性嗆咳、發(fā)熱、乏力等臨床表現(xiàn)，X線顯示肺部有不同程度炎癥，血清支原體IgM陽性，大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物預(yù)治療時顯效。(2)PCR診斷。只有當(dāng)陽性對照Ct值小于38，陰性對照Ct值無數(shù)據(jù)時，樣本檢測數(shù)據(jù)才為有效。檢測樣本的Ct值不大于38，則判定支原體感染陽性。(3)Rt-PCR診斷。當(dāng)患者咽拭子DNA的拷貝數(shù)不小于1.0e+005coeiesml則診斷為支原體感染陽性。

1.4 觀察指標 檢測后第2天：(1)比較PCR與Rt-PCR檢測結(jié)果陽性率。(2)比較PCR與Rt-PCR兩種檢測方法靈敏度。(3)比較PCR與Rt-PCR 2種檢測方法特異度。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)均采用SPSS16.0 for Windows統(tǒng)計學(xué)軟件進行整理分析，PCR與Rt-PCR檢測結(jié)果陽性率、靈敏度、特異度均以%表示，進行差異對比時采用χ2檢驗，在α=0.05的水準上，當(dāng)P<0.05時，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PCR與Rt-PCR檢測結(jié)果陽性率比較 328例患者的咽拭子標本中，PCR共檢出肺炎支原體陽性標本33例，陽性率為10.06%。Rt-PCR共檢出肺炎支原體陽性標本65例，陽性率為19.82%。Rt-PCR檢測陽性率高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 PCR與Rt-PCR檢測結(jié)果陽性率比較

2.2 PCR與Rt-PCR 2種檢測方法靈敏度比較 PCR的靈敏度(18.84%)比Rt-PCR的靈敏度(88.41%)低，且2者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 PCR與Rt-PCR 2種檢測方法靈敏度比較

2.3 PCR與Rt-PCR 2種檢測方法特異度比較 PCR的特異度(87.64%)比Rt-PCR的特異度(94.59%)低，且2者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 PCR與Rt-PCR 2種檢測方法特異度比較

3 討論

肺炎支原體是兒童、成人、青少年上呼吸道與下呼吸道主要感染致病的病原體，其中青少年與學(xué)齡前兒童為肺炎支原體的主要感染人群，在社區(qū)獲得性肺炎青少年與學(xué)齡前兒童患者中由肺炎支原體感染引發(fā)所占比例較大，約為23%～50%[5-7]。支原體肺炎主要以間質(zhì)性肺炎為病理改變表現(xiàn)，部分患者并發(fā)支氣管肺炎，被稱為原發(fā)性非典型肺炎。該疾病主要是通過飛沫進行傳播，正常情況下該疾病的潛伏期約為2～3周。肺炎支原體感染早期患者臨床癥狀較輕，一般僅表現(xiàn)為呼吸道癥狀，如發(fā)熱、咳嗽、頭痛、乏力、嘔吐、惡心、咽痛、食欲減退、肌肉酸痛等，無特定的發(fā)病季節(jié)[8]。研究[9]發(fā)現(xiàn)當(dāng)人體感染肺炎支原體病菌2～3周后，臨床癥狀表現(xiàn)相繼出現(xiàn)，其中最突出的癥狀表現(xiàn)為刺激性、陣發(fā)性咳嗽，其次為痰中帶血、胸痛、呼吸困難等，無嚴重的肺部體征，且該疾病對β內(nèi)酰胺不產(chǎn)生任何效果。同時對肺炎支原體感染患者進行胸部X線檢查時，病變表現(xiàn)或輕微、或廣泛，主要特征為胸片陰影顯著但體征輕微。血常規(guī)檢查患者白細胞數(shù)量或正、?；蚱撸缙谠\斷和治療有利于患兒的恢復(fù)。因此，對病原體積極采取準確率較高的檢測手段，有助于合理指導(dǎo)臨床用藥[10-11]。

目前臨床上主要有以下幾種病原體檢測方法：(1)能夠從患兒鼻腔、咽喉、胸水或體液中分離出肺炎支原體是確診患兒感染肺炎支原體的最有利依據(jù)，但是由于支原體的常規(guī)培養(yǎng)需要10～14 d，甚至需要更長的時間，對于患兒的早期診斷及治療的價值較小。(2)血清學(xué)檢查。血清學(xué)檢查包括特異性試驗和非特異性試驗，前者常用的是酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)等，后者常用的是檢測血清Mp-IgM。血清學(xué)診斷有一定的弊端，其敏感性和特異性較低[12]。(3)抗體檢測法?？贵w檢測法在檢測過程中由于二次血清的獲取不易，常會延長診斷時間，患者容易錯過最佳治療時間，進而會導(dǎo)致肺炎支原體感染的臨床治療失敗率較高，治療失敗后臨床上多采用用藥治療方式，會使病情遷延難愈。(4)核酸診斷方法。核酸診斷方法包括PCR，Rt-PCR技術(shù)，環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)等,核酸診斷方法具有快速、特異性強、敏感等特點，適用于早期診斷[13]。Khorana[14](1971)等最早提出核酸體外擴增的設(shè)想后，對于其的研究也越來越多，后來逐漸應(yīng)用到臨床的診治當(dāng)中。不同的PCR技術(shù)在臨床上也有許多研究，胡文娟等[15]認為采用實時定量PCR方法檢測肺炎支原體具有快速經(jīng)濟,且污染少,特異性強,靈敏度高優(yōu)點。崔亞利等[16]也認為血清學(xué)檢測是診斷肺炎支原體感染的標準實驗室手段,但PCR方法對于免疫損壞及年幼患兒肺炎支原體感染早期診斷更加適合。目前，臨床在支原體肺炎的臨床表現(xiàn)、影像學(xué)改變和實驗室診斷以及藥物治療方面有了一定的共識，但是最優(yōu)的診斷方法還在探究之中。本文研究的是對比PCR與RT-PCR 2種不同的方法在咽拭子標本中肺炎支原體的檢測結(jié)果，以探究兩種方法的優(yōu)缺點。

研究結(jié)果顯示328例患者的咽拭子標本中，PCR共檢出肺炎支原體陽性標本33例，陽性率為10.06%。Rt-PCR共檢出肺炎支原體陽性標本65例，陽性率為19.82%。Rt-PCR檢測陽性率高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。說明Rt-PCR可提高咽拭子標本中肺炎支原體的檢測陽性率。與傳統(tǒng)的PCR檢測方式相比，PT-PCR檢測方式隨著生物分子學(xué)的發(fā)展被廣泛應(yīng)用于臨床診斷中，具有定量準確、檢測速度快、重復(fù)性好、全封閉反應(yīng)等優(yōu)點，從而可提高檢測陽性率。本次研究結(jié)果顯示PCR的靈敏度(18.84%)比Rt-PCR的靈敏度(88.41%)低，PCR的特異度(87.64%)比Rt-PCR的特異度(94.59%)低，且2者差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明Rt-PCR可提高咽拭子標本中肺炎支原體的檢測靈敏度與檢測特異度。相關(guān)文獻[17-18]報道不同年齡階段患兒產(chǎn)生的肺炎支原體抗體可能存在較大差異，分子生物學(xué)方法檢測肺炎支原體則不存在血清學(xué)檢測缺點。傳統(tǒng)的PCR檢測方法檢測結(jié)果中容易出現(xiàn)假陰性，而RT-PCR檢測技術(shù)則是將熒光基團加入至PCR反應(yīng)體系中，通過積累的熒光信號對PCR的整個進程實施實時監(jiān)測，再由標準曲線定量分析咽拭子標本，不僅可解決傳統(tǒng)PCR檢測的污染問題，而且檢測效率較高，檢測耗時一般只需要1～2 h。因此RT-PCR的檢測特異度與靈敏度較高，在檢測過程中無需進行熔解曲線分析即可進行多重檢測，且可彌補以往的熒光染料方式的不足之處，具有較好的臨床應(yīng)用效果[19-20]。

綜上所述，采用Rt-PCR與PCR 2種不同的方法檢測咽拭子標本中的肺炎支原體時，Rt-PCR的靈敏度以及特異度均比PCR的高，值得在臨床上推廣應(yīng)用。

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Comparative study of PCR and RT-PCR in detection of mycoplasma pneumoniae in throat swab samples

CHAIJuan．

(HebeiProvincialTraditionalChineseMedicineHospital,Shijiazhuang,Hebei050011,China)

Objective:To analyze the detection of mycoplasma pneumoniae in throat swab samples by polymerase chain reaction (PCR) and reverse transcription PCR (RT-PCR) and compare the results, so as to provide the basis for clinical application.Methods:Clinical data of 328 cases of patients in the TCM Hospital of Hebei Province from May 2011 to May 2016 were collected,of which 69 cases were clinically diagnosed with mycoplasma pneumoniae infection and 259 cases were suspected to be infected.PCR and Rt-PCR test results were compared in terms of positive rate,sensitivity, and specificity.Results:In the 328 cases of throat swab specimens,33 cases of mycoplasma positive samples were detected by PCR,the positive rate being 10.06%;65 cases of positive samples were detected by Rt-PCR,with the positive rate of 19.82%. The positive rate of Rt-PCR test was higher than that of the control group, and the difference was statistically significant(P<0.05).The sensitivity of PCR (18.84%) was lower than that of Rt-PCR (88.41%),and the difference was statistically significant(P<0.05).The specificity of PCR(87.64%) was lower than that of Rt-PCR (94.59%), and the difference was statistically significant(P<0.05).Conclusion:The positive rate, sensitivity and specificity of Rt-PCR in the detection of mycoplasma pneumoniae in throat swab are better than those of PCR. It is worth popularizing in clinical practice.

Mycoplasma pneumoniae; PCR; RT-PCR

河北省中醫(yī)院 檢驗科，河北 石家莊 050011

柴娟(1972-)，女，副主任技師，大學(xué)。

10.14126/j.cnki.1008-7044.2017.02.014

R 375.2

A

1008-7044(2017)02-0162-04

2016-10-28)