孫趙洋，趙元，袁志杰，娜仁高娃，強(qiáng)嘉楠，潘麗，秦貴信

（動物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林省動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長春 130118）

大豆抗原蛋白β-conglycinin線性表位及其不同種屬動物過敏血清結(jié)合能力比較

孫趙洋，趙元，袁志杰，娜仁高娃，強(qiáng)嘉楠，潘麗，秦貴信*

（動物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林省動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長春 130118）

試驗(yàn)通過生物信息學(xué)方法預(yù)測β-conglycinin線性表位，綜合已發(fā)表文獻(xiàn)篩選出四段具有代表性氨基酸序列合成短肽，采用ELISA和點(diǎn)雜交法檢測表位肽段與仔豬、犢牛、兔三種不同種屬動物過敏血清結(jié)合程度差異。結(jié)果表明：通過生物信息學(xué)方法預(yù)測合成的肽段均為β-conglycinin表位肽；三種動物過敏血清與四段表位肽結(jié)合能力存在顯著差異，其中四段表位肽與仔豬、犢牛過敏血清結(jié)合能力顯著高于兔過敏血清（P＜0.05）；同一動物與四段不同肽段結(jié)合敏感程度差異顯著（P＜0.05），兔過敏血清與肽段β1結(jié)合能力最強(qiáng)，仔豬過敏血清與α1肽段結(jié)合能力最強(qiáng)，犢牛過敏血清與肽段β2肽段結(jié)合能力最強(qiáng)。結(jié)果為尋找β-conglycinin最佳優(yōu)勢表位提供理論支持，同時(shí)為揭示大豆抗原蛋白種屬間致敏差異機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

β-伴大豆球蛋白；表位；ELISA法；點(diǎn)雜交法；動物種屬

大豆?fàn)I養(yǎng)價(jià)值豐富，富含蛋白質(zhì)及脂質(zhì)，廣泛應(yīng)用于食品和飼料工業(yè)。但大豆含有多種抗?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)，可引發(fā)腹瀉，影響生長發(fā)育[1]。其抗原物質(zhì)主要有大豆疏水蛋白（Soybean hydrophobic protein）、大豆殼蛋白（Soybean hull protein）、大豆抑制蛋白（Soybean profilin）、大豆空泡蛋白（Soybean vacuolar protein）、大豆球蛋白（Glycinin）、伴大豆球蛋白（Conglycinin）和Kunitz胰蛋白酶抑制因子等[2]。Glycinin和β-conglycinin對動物影響最大，二者占大豆抗原蛋白總量65%～80%[3]。β-conglycinin具有較強(qiáng)抗原性，可抵抗胃酸；由α、α'、β三種亞基組成，分子質(zhì)量分別為67、68及48 ku，其中α、β亞基占主要地位；α亞基由543個(gè)氨基酸殘基組成，β亞基由438個(gè)氨基酸殘基組成，目前α、β亞基具體表位尚不清楚。

研究發(fā)現(xiàn)，免疫細(xì)胞難以借助其表面受體識別整個(gè)蛋白質(zhì)抗原分子，僅識別抗原分子上特定部分即抗原表位，又稱抗原決定簇，是抗原分子中決定抗原特異性特殊化學(xué)基團(tuán)，可激發(fā)機(jī)體體液和細(xì)胞免疫，根據(jù)結(jié)合受體差異，抗原表位可分為T細(xì)胞表位和B細(xì)胞表位，根據(jù)結(jié)構(gòu)可分為線性表位和構(gòu)象表位。線性表位即連續(xù)性表位，存在抗原分子任意部分，蛋白質(zhì)變性前后均可測定[4-6]，構(gòu)象表位由于抗原蛋白氨基酸序列盤曲折疊產(chǎn)生，抗原表位是機(jī)體特異性免疫基礎(chǔ)。隨生物信息學(xué)發(fā)展和數(shù)據(jù)庫擴(kuò)增，生物信息學(xué)軟件應(yīng)用于蛋白質(zhì)抗原表位預(yù)測，提高試驗(yàn)效率[7-8]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，β-conglycinin β亞基與豬、狗、兔、鱸魚血清結(jié)合產(chǎn)生抗原表位敏感區(qū)域不同[9]；Chunjiang等研究發(fā)現(xiàn)β-conglycinin α亞基與豬血清結(jié)合產(chǎn)生抗原表位敏感區(qū)域差異顯著[10]。對β-conglycinin致敏犢牛產(chǎn)生抗原表位研究較少，本試驗(yàn)采用生物信息學(xué)方法，運(yùn)用計(jì)算機(jī)軟件分析預(yù)測β-conglycinin α亞基及β亞基蛋白結(jié)構(gòu)和抗原表位，結(jié)合已發(fā)表研究成果，用ELISA和點(diǎn)雜交方法比較大豆抗原蛋白β-conglycinin致敏兔、仔豬、犢牛三種不同種屬動物產(chǎn)生抗原表位差異。為研究大豆過敏原及低致敏大豆制品研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

山羊抗兔IgG抗體、兔抗豬IgG抗體、兔抗牛IgG抗體（帶有辣根過氧化物酶標(biāo)記）購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；美國96孔Corning可拆酶標(biāo)板購自上海越研生技公司；硝酸纖維膜（0.15 μm）購自浙江四甲生化塑料廠；DAB顯色液購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；多功能酶標(biāo)儀、脫色搖床（其林貝爾儀器制造有限公司），掃描儀（Epson），37℃恒溫培養(yǎng)箱。

1.2 大豆過敏原β-conglycinin α亞基與β亞基抗原表位預(yù)測

通過Pubmed網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器（http://www.ncbi.nlm. gov/pubmed/）檢索β-conglycinin α亞基與β亞基氨基酸序列。

應(yīng)用Bepipred1.0網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器，輸入氨基酸序列，根據(jù)氨基酸序列給出形成表位可能評分，得到表位數(shù)據(jù)。

應(yīng)用DNAstar生物分析軟件中protean程序，采用Jameson-Wolf法、Kyte-Doolittle法、Emini法和Karplus-Schulz法分別預(yù)測蛋白的抗原指數(shù)、親水性、表面可及性和柔韌性。

將大豆過敏原β-conglycinin α亞基與β亞基蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果與抗原指數(shù)、親水性、表面可及性和柔韌性預(yù)測結(jié)果結(jié)合，分析抗原表位。

1.3 表位肽合成

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，綜合文獻(xiàn)與預(yù)測結(jié)果，篩選β-conglycinin α亞基和β亞基各兩段代表性氨基酸序列，由北京華大蛋白公司合成短肽，純度達(dá)90%以上，合成肽保存在-20℃冰箱。

1.4 直接ELISA法檢測仔豬、犢牛、兔過敏血清與表位肽結(jié)合程度

1.4.1 直接ELISA法所用溶液及配置

碳酸納緩沖液（包被液）：將0.05 g Na2CO3，0.308 g NaHCO3，用蒸餾水定容至500 mL。樣品處理液（PBS）：將9 g NaCl，2.9 g Na2HPO4，0.3 g NaH2PO4，用蒸餾水定容至1 000 mL。封閉液（1% BSA）：0.1 g BSA溶于10 mL PBS，儲存于4℃中。PBST：將PBS和吐溫20按照一定比例配置；終止液：5.55 mL濃硫酸，44.45 mL水。

1.4.2 直接ELISA法

無菌去離子水將四段表位肽稀釋至濃度為1 μg·mL-1后，以每孔0.3 mL包被到96孔酶標(biāo)板，封好4℃過夜。次日將孔內(nèi)液體倒掉，PBST清洗3次，拍干，每孔加0.1 mL封閉液，37℃孵育2 h。清洗同上，拍干后向96孔酶標(biāo)板中加入0.1 mL稀釋后待檢兔、仔豬、犢牛過敏血清，37℃孵育2 h。洗板（同上）后加入相應(yīng)用辣根過氧化物酶（HPR）標(biāo)記抗兔、豬、牛IgG抗體（用樣品處理液稀釋3 000倍），每孔0.1 mL，37℃孵育2 h。酶標(biāo)板清洗拍干，每孔加0.1 mL底物液，37℃孵育10 min，孵育后，每孔加入50 μL終止液終止反應(yīng)。測每孔在波長490 nm下吸光值，記錄結(jié)果。

1.5 點(diǎn)雜交試驗(yàn)驗(yàn)證

點(diǎn)雜交抑制試驗(yàn)用于驗(yàn)證所得表位肽片段IgG結(jié)合能力。將硝酸纖維素膜（0.45 μm）于雙蒸水浸泡后取出，硝酸纖維素膜半干時(shí)，將合成β-conglycinin α亞基和β亞基四段表位肽用碳酸鹽緩沖液（pH 9.6）溶解，滴到膜上（每個(gè)點(diǎn)5 μg），室溫下放置干燥。將硝酸纖維素膜放入含5%脫脂奶粉PBST（含0.1%吐溫20的0.01 mol·L-1，pH 7.4 PBS）封閉。兔、仔豬、犢牛過敏血清（用含2.5%脫脂奶粉PBST稀釋）滴至封閉后硝酸纖維素膜中室溫孵育過夜。硝酸纖維素膜PBST洗滌3次，每次5 min。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記抗兔、仔豬、犢牛二抗（含2.5%的PBST稀釋）37℃孵育1 h，二抗稀釋度根據(jù)供應(yīng)商建議選擇1：2 000。之后用PBST洗3次，第1次15 min，后2次5 min，接著用PBS洗1次，5 min。迅速將洗后硝酸纖維素膜放入顯色液，顯色2～3 min雙蒸水終止反應(yīng)。對照組不加合成表位肽，碳酸鹽緩沖液（pH 9.6）替代，其余步驟一致，掃描儀（Epson）掃描記錄顯色結(jié)果。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

ELISA數(shù)據(jù)以平均±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。采用SPSS 20.0單因子方差分析處理數(shù)據(jù)，以P＜0.05作差異顯著標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物信息學(xué)軟件預(yù)測結(jié)果分析

大豆致敏源β-conglycinin α亞基氨基酸序列共543個(gè)氨基酸殘基。由圖1可知，β-轉(zhuǎn)角區(qū)域在整個(gè)氨基酸序列中出現(xiàn)頻率較高，出現(xiàn)表位可能性高。

DNAStar的Protean程序提供精確抗原表位。蛋白質(zhì)親水性，表面可及性、柔韌性等在抗原形成中具有重要作用，當(dāng)親水性＞0，抗原指數(shù)＞0，表面可及性＞1時(shí)，形成表位可能性大，由圖2可知，親水性區(qū)域占據(jù)整個(gè)氨基酸序列絕大部分，該蛋白質(zhì)親水性能較高。蛋白表面可及性和柔韌性區(qū)域越多代表易折疊、伸展。抗原性指數(shù)代表蛋白質(zhì)形成表位能力，蛋白質(zhì)抗原指數(shù)高，形成表位可能性大。

β-conglycinin β亞基氨基酸序列共438個(gè)氨基酸殘基，β-轉(zhuǎn)角區(qū)域在整個(gè)氨基酸序列中出現(xiàn)頻率較高，說明該區(qū)域出現(xiàn)表位可能性較高（見圖3）。

β-conglycinin β亞基蛋白質(zhì)親水性，表面可及性、柔韌性等性質(zhì)預(yù)測判定方法同β-conglycinin α亞基，結(jié)果見圖4。

BepiPred 1.0軟件結(jié)合Markov模型和規(guī)模化方法預(yù)測B細(xì)胞線性表位，結(jié)果見表1。在DNAStar和BepiPred 1.0預(yù)測結(jié)果基礎(chǔ)上篩選預(yù)測β-conglycinin α和β亞基表位。

結(jié)合預(yù)測結(jié)果，篩選β-conglycinin α亞基和β亞基各兩段氨基酸序列，由北京華大蛋白公司合成短肽，純度達(dá)90%以上，結(jié)果見表2。

圖1 DNAStar分析β-conglycinin α亞基二級結(jié)構(gòu)Fig.1Secondary structure of α subunit from β-conglycinin analysised by DNAStar

圖2 DNAStar分析β-conglycinin α亞基親水性、柔韌性、抗原性指數(shù)和表面可及性Fig.2DNAstar prediction result of antigenicindex,hydrophilicity,surface probability and flexible regions of α Subunit of β-conglycinin

圖3 DNAStar分析β-conglycinin β亞基二級結(jié)構(gòu)Fig.3Secondary structure of β Subunit from β-conglycinin analysised by DNAStar

圖4 DNAStar分析β-conglycinin β亞基親水性、柔韌性、抗原性指數(shù)和表面可及性Fig.4DNAstar prediction result of antigenicindex,hydrophilicity,surface probability and flexible regions of β Subunit of β-conglycinin

表1 DNAstar和BepiPred 1.0預(yù)測結(jié)果Table 1DNAstar and BepiPred 1.0 predicted results

表2 β-conglycinin α亞基與β亞基合成表位肽結(jié)果Table 2β-conglycinin α subunit and β subunit synthesis epitope peptide results

2.2 直接ELISA法檢測兔、仔豬、犢牛過敏血清與表位肽結(jié)合程度分析

ELISA法檢測兔、仔豬、犢牛過敏血清與表位肽結(jié)合能力，酶標(biāo)儀在490 nm處測得吸光值，經(jīng)SPSS 20.0分析結(jié)果見表3。

由表3可知，同一動物與四段不同肽段結(jié)合敏感程度差異顯著（P＜0.05），對兔過敏血清，肽段α 1和α2、β2與之結(jié)合能力較差，與β1結(jié)合能力較強(qiáng)；對仔豬過敏血清，肽段β2結(jié)合能力最差，α1結(jié)合能力最強(qiáng)；對犢牛過敏血清，肽段α2和β1結(jié)合能力較差，β2結(jié)合能力最強(qiáng)。不同種屬動物與同一肽段結(jié)合敏感程度差異顯著（除β1外）（P＜0.05），對α1肽段，犢牛與之結(jié)合能力顯著高于兔和仔豬（P＜0.05）；對α2肽段，兔與之結(jié)合能力顯著低于仔豬和犢牛（P＜0.05）；對β2肽段，仔豬與之結(jié)合能力最差，犢牛結(jié)合能力最強(qiáng)，三種動物間有顯著差異（P＜0.05）。

2.3 點(diǎn)雜交驗(yàn)證結(jié)果

點(diǎn)雜交試驗(yàn)驗(yàn)證預(yù)測潛在表位結(jié)合能力，如圖5所示。

表3 ELISA檢測兔、仔豬、犢牛過敏血清與四段表位肽結(jié)合結(jié)果Table 3ELISA detection of rabbit,piglets,calves allergic serum and four epitopes peptide binding results

圖5 三種不同種屬動物β-conglycinin過敏血清與四段肽點(diǎn)雜交試驗(yàn)結(jié)果Fig.5Results of dot-blot test between β-conglycinin allergic serum from three different species of animals and four peptides

由圖5可見，β-conglycinin致敏三種不同種屬動物過敏血清結(jié)合程度，兔結(jié)合能力最弱，仔豬與犢牛較強(qiáng)，對照組無顏色；兔過敏血清與肽段β1和肽段β2結(jié)合能力較強(qiáng)，與肽段α1和肽段α2結(jié)合能力較弱，仔豬過敏血清與肽段α1和肽段β1結(jié)合能力較強(qiáng)，與肽段α2和肽段β2結(jié)合能力較弱，犢牛過敏血清與肽段β2結(jié)合能力較強(qiáng)，與肽段α1、α2和β1結(jié)合能力較弱，對照組均無顏色。

3 討論

傳統(tǒng)免疫學(xué)技術(shù)通過克隆、表達(dá)和分離純化完整蛋白抗原，利用抗原獲得與之交叉反應(yīng)性強(qiáng)抗體，方法復(fù)雜，表達(dá)效率低[11]。隨生物信息學(xué)發(fā)展，通過生物信息學(xué)及序列分析軟件預(yù)測，獲得蛋白質(zhì)基因和氨基酸序列中蘊(yùn)含抗原表位或與抗原表位相關(guān)信息[12]。預(yù)測蛋白質(zhì)表位算法主要有親水性、柔韌性、二級結(jié)構(gòu)、表面可及性以及抗原性指數(shù)等方法?？乖砦昏b定耗時(shí)長、費(fèi)用高，需嚴(yán)格篩選。生物信息學(xué)方法預(yù)測可克服該缺點(diǎn)，是便捷快速鑒定方法。利用生物信息學(xué)方法預(yù)測分析蛋白質(zhì)表位，可減少盲目性。蛋白質(zhì)表位形成因素多，僅憑單個(gè)軟件預(yù)測結(jié)果精確率低。結(jié)合ELISA和點(diǎn)雜交方法預(yù)測抗原表位，可提高預(yù)測效率及成功率[13]。本試驗(yàn)以兩種生物信息學(xué)軟件預(yù)測β-conglycinin抗原表位區(qū)域，結(jié)合Chunjiang研究結(jié)果，在抗原表位區(qū)域篩選四段較具有代表性肽段[10]，經(jīng)ELISA和點(diǎn)雜交方法驗(yàn)證，結(jié)果真實(shí)可信。

目前，大豆致敏不同種屬動物產(chǎn)生抗原表位差異研究倍受關(guān)注。Earl等研究發(fā)現(xiàn)，β-conglycinin β亞基致敏豬、狗、兔、鱸魚產(chǎn)生抗原表位敏感區(qū)域差異顯著，四種動物敏感區(qū)域在β-conglycinin氨基酸序列上分布在不同區(qū)域[9]；Chunjiang等研究發(fā)現(xiàn)β-conglycinin α亞基與豬血清結(jié)合產(chǎn)生抗原表位區(qū)域差異顯著，S185-R231區(qū)域產(chǎn)生明顯抗性區(qū)域[10]。本試驗(yàn)系統(tǒng)的比較β-conglycinin致敏兔、仔豬、犢牛產(chǎn)生抗原表位差異，ELISA驗(yàn)證結(jié)果與點(diǎn)雜交驗(yàn)證結(jié)果一致。結(jié)果表明，不同種屬動物與同一肽段結(jié)合敏感程度差異顯著（P＜0.05），其中兔血清與四段肽段反應(yīng)均不明顯。這可能因兔屬于嚙齒動物，與大豆中β-conglycinin不易產(chǎn)生過敏反應(yīng)或反應(yīng)較弱，與其生理結(jié)構(gòu)特性有關(guān)。仔豬與犢牛免疫反應(yīng)相對較強(qiáng)，可能因大豆抗原蛋白引起斷奶動物腸道形態(tài)變化，誘發(fā)過敏反應(yīng)發(fā)生[14]；Barratt和Sissons等對犢牛的研究表明，大豆中β-conglycinin對犢牛消化道具有較強(qiáng)致敏作用，血清中大豆抗原特異性滴度升高，犢牛腸道結(jié)構(gòu)損傷，消化吸收障礙，繼發(fā)過敏性腹瀉[15-16]。本試驗(yàn)同一動物與四段不同肽段結(jié)合敏感程度差異顯著（P＜0.05），可能是因免疫細(xì)胞難以借助其表面受體識別蛋白質(zhì)抗原分子。本試驗(yàn)僅選擇四段具代表性肽段，比較大豆抗原蛋白β-conglycinin線性表位與三種不同種屬動物過敏血清結(jié)合能力，存在一定局限性。

4 結(jié)論

大豆抗原蛋白β-conglycinin可使兔、仔豬、犢牛三種不同種屬動物發(fā)生過敏反應(yīng)，大豆抗原蛋白β-conglycinin與三種動物過敏血清發(fā)生特異性結(jié)合的線性抗原表位敏感區(qū)域差異顯著；β-conglycinin致敏仔豬、犢牛產(chǎn)生過敏血清與四段表位肽結(jié)合能力顯著高于兔子。

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Comparison of binding capacity of soybeanβ-conglycinin linear

epitopes and allergic serum of different species animals/

SUN Zhaoyang,

ZHAO Yuan,YUAN Zhijie,Narengaowa,QIANG Jianan,PAN Li,QIN Guixin(Key Laboratory of Animal Production,Product Quality and Security,Ministry of Education,Jilin Provincial Key Laboratory of Animal Nutrition and Feed Science,School of Animal Science and Technology,Jilin Agricultural University,Changchun 130118,China)

The binding capacity of β-conglycinin linear epitopes and three different species(rabbit, piglets,calf)allergic serum was compared in this study.The linear epitopes were firstly predicted by bioinformatics method,then the four peptides with linear epitopes were selected and synthesized in terms ofthe predicted results and relative reports.The four peptides were identified with different allergic serum by ELISA and Dot blot.Result showed that the peptides synthesized by bioinformatics method were all βconglycinin peptides;Another finding was that the binding ability of the different species animals and the same peptides have the significant difference(P＜0.05),four peptides and piglets,calf allergies serum bining ability significantly stronger than rabbit serum;Four different peptides bining with the allergic serum of the same animal showed significant difference（P＜0.05）,the allergic rabbit serum presented the strongest combined ability with the peptidesβ1;the allergic piglets serum presented the strongest combined ability with the peptidesα1;the allergic calf serum presented the strongest combined ability with peptidesβ2.The result provided theoretical support for selectβ-conglycinin best advantage peptide,and revealed the mechanism of soybean protein antigen sensitization differences between species.

β-conglycinin;epitope;ELISAmethod;dot-blot method；species

S823；S828；S829.1

A

1005-9369（2017）01-0058-07

2016-11-24

國家自然科學(xué)基金（31572439，31572415）；吉林省自然科學(xué)基金（20160101348JC）；吉林省教育廳“十二五”科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（2015198）

孫趙洋（1991-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)閯游餇I養(yǎng)與飼料科學(xué)。E-mail:sunzhaoyang702@126.com

*通訊作者：秦貴信，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)楸容^動物營養(yǎng)。E-mail:qgx@jlau.edu.cn

時(shí)間2017-1-9 15:46:03[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20170109.1546.002.html

孫趙洋，趙元，袁志杰,等.大豆抗原蛋白β-conglycinin線性表位及其不同種屬動物過敏血清結(jié)合能力比較[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2017,48(1):58-64.

Sun Zhaoyang,Zhao Yuan,Yuan Zhijie,et al.Comparison of binding capacity of soybeanβ-conglycinin linear epitopes and allergic serum of different species animals[J].Journal of Northeast Agricultural University,2017,48(1):58-64.(in Chinese with English abstract)