劉迎，姜蕾，潘波，林勇

（中國熱帶農業(yè)科學院環(huán)境與植物保護研究所，?？?571101）

斑馬魚胚胎經丙草胺暴露后對其仔魚致畸效應的研究

劉迎，姜蕾，潘波，林勇

（中國熱帶農業(yè)科學院環(huán)境與植物保護研究所，海口 571101）

為探討斑馬魚胚胎暴露于丙草胺后對斑馬魚仔魚的致畸效應和致畸機理，研究了斑馬魚胚胎暴露于0.50、1.00、1.50 mg·L-1丙草胺染毒液120 h后仔魚的畸形表型及比率，并通過檢測與畸形器官發(fā)育相關的基因表達探討致畸機理。結果發(fā)現，丙草胺暴露后誘導斑馬魚仔魚出現心包囊腫、軀干彎曲、游囊關閉等畸形表型，隨著暴露濃度的增加，各畸形癥狀比例增大。1.00、1.50 mg·L-1暴露組仔魚心包囊腫率分別為15.56%（P＜0.05）、25.56%（P＜0.01），脊柱彎曲率分別為27.78%（P＜0.01）、35.56%（P＜0.01）；0.50、1.00、1.50 mg·L-1暴露組仔魚游囊關閉率分別為20%（P＜0.05）、37.78%（P＜0.01）和60%（P＜0.01）。丙草胺顯著降低了心臟發(fā)育相關基因Tbx2[1.00 mg·L-1（P＜0.01）、1.50 mg·L-1（P＜0.05）]，骨骼發(fā)育相關基因BMP-2[1.50 mg·L-1（P＜0.05）]、BMP-4[1.00 mg·L-1（P＜0.01）、1.50 mg·L-1（P＜0.01）]，游囊發(fā)育相關基因shha[1.50 mg·L-1（P＜0.05）]、ihha[1.00 mg·L-1（P＜0.05）、1.50 mg·L-1（P＜0.05）]的表達水平。研究表明，丙草胺通過影響心臟、骨骼和游囊相關基因的表達引起斑馬魚仔魚的以上器官發(fā)育異常。

丙草胺；斑馬魚；致畸效應；Tbx2；BMP-2；BMP-4；shha；ihha

酰胺類除草劑是20世紀60年代開發(fā)的一類高效、高選擇性的除草劑，在全球農藥品種市場中列第9位，在各類除草劑中列第4位，僅排在氨基酸類、磺酰脲類和其他結構類之后[1]。隨著酰胺類除草劑的大量使用而引起的環(huán)境問題日益受到關注：甲草胺被美國環(huán)境保護局歸為B-2類致癌物[2]，同時也是一種環(huán)境內分泌干擾物[3]；乙草胺[4]和丙草胺[5]暴露可引起斑馬魚胚胎內分泌紊亂、細胞凋亡、氧化應激和免疫毒性；丁草胺可影響斑馬魚繁殖、擾亂甲狀腺激素、性激素等內分泌物質代謝[6]，同時丁草胺暴露引起斑馬魚胚胎內分泌紊亂和免疫毒性[7]；異丙甲草胺暴露可影響斑馬魚胚胎孵化，對胚胎產生致畸效應[8-9]。由于丙草胺為我國水稻田常用除草劑，研究其對斑馬魚胚胎毒性具有重要意義。

在斑馬魚胚胎發(fā)育過程中，關鍵基因的變化會導致心臟、骨骼等器官的發(fā)育異常。鞠黎等[10]研究推斷多氯聯苯誘導斑馬魚幼魚脊柱彎曲可能與通過抑制骨形態(tài)蛋白家族相關基因（BMP-2和BMP-4）的表達而影響骨骼細胞的正常分化有關，岳東等[11]研究發(fā)現久效磷通過干擾心臟發(fā)育相關基因（Tbx2）和肌肉發(fā)育相關基因（Mef2）的表達引起胚胎心率下降和幼魚出現包囊腫率和脊柱彎曲等畸形，Winata等[12]發(fā)現敲除對魚鰾組織分化與形成有決定作用的shha和ihha基因后，能夠引起魚鰾發(fā)育缺陷。實驗室前期研究發(fā)現斑馬魚胚胎暴露于丙草胺可降低斑馬魚胚胎孵化率，誘導斑馬魚仔魚出現心包囊腫、游囊關閉、軀干彎曲等畸形表型[9]。本實驗在此基礎上研究丙草胺不同濃度暴露下各畸形表型的百分比，同時通過產生畸形的相關器官——心臟、脊椎和游囊發(fā)育相關基因的表達變化來研究丙草胺在分子水平上對斑馬魚胚胎（仔魚）相關器官發(fā)育的影響，探討致畸機理。

1 材料與方法

1.1 供試藥劑和實驗儀器

94%丙草胺原藥（山東濱農科技有限公司）、丙酮（廣州化學試劑廠）、吐溫-80（國藥集團化學試劑有限公司）。SMZ1000體視顯微鏡（日本Nikon公司）、PYX-250Q-C人工培養(yǎng)箱（廣東韶關科技試驗儀器有限公司）、斑馬魚水循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)（Z-A-S4，上海海圣工貿有限公司）、AUY220萬分之一電子天平（日本島津公司）。

1.2 斑馬魚胚胎采集

實驗所用斑馬魚購于?？谑兴沙厮屦^，體長為2～3 cm，在實驗室斑馬魚水循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)中馴養(yǎng)2周后，將雌雄魚分開馴養(yǎng)2周用于胚胎采集。成魚每日喂食2次人工飼料，光照/黑暗周期為14 h∶10 h。試驗前一天晚上關燈前將雌雄魚按1∶2配對放入產卵缸中，第二天早上8：00開燈，半個小時后收集胚胎，經2次清洗、去掉糞便和凝結的卵后轉移至試驗用水中（曝氣自來水，硬度82 mg·L-1，pH 7.52），于（26±1）℃人工培養(yǎng)箱中培養(yǎng)待用。

1.3 斑馬魚胚胎染毒

0.5g（折百后）丙草胺原藥加1.0 mL丙酮充分溶解后加0.8 mL吐溫-80助溶，用去離子水定容至100 mL容量瓶配制成5000 mg·L-1母液，置于4℃冰箱中備用。根據前期研究[9]斑馬魚胚胎半數致畸質量濃度（120 h）EC50=1.36 mg·L-1，將母液依次稀釋成含丙草胺0.50、1.00、1.50 mg·L-1進行染毒，所有染毒液中丙酮的濃度≤0.01%。將30 mL染毒液轉移到直徑為10 cm的培養(yǎng)皿中，每皿中移入受精后6 h的受精卵50顆，每處理重復3次，設置溶劑對照和空白對照（CK），將培養(yǎng)皿轉移到培養(yǎng)箱（26±1℃）培養(yǎng)，光/暗周期為14 h∶10 h。整個染毒周期為6～120 hpf（Hour post fertilization）。上述操作重復2組，一組用來調查畸形表型和比例，另一組用作基因表達分析。

1.4 魚胚胎染毒觀察指標

120hpf染毒結束后，在體式顯微鏡下觀察斑馬魚仔魚的畸形表型及采集圖像，計算各種畸形表型的比例。

1.5 基因表達分析

隨機取不同組斑馬魚胚胎（48、72 hpf）或幼魚（120 hpf）各30枚（條），用AxyPrep總RNA小量制備試劑盒（AXYGEN）進行總RNA抽提，提取所得總RNA用NanoDrop ND-2000C紫外分光光度計（美國Thermo Fisher）測定RNA質量和濃度。等量的總RNA（2 μg）通過PrimeScriptTMⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit（TaKaRa）反轉錄為cDNA，所有操作均嚴格按照試劑盒說明進行。按照SYBR Premix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus，TaKaRa）試劑盒說明書進行目的基因的熒光檢測，目的基因和內參基因引物序列參考見表1。使用實時熒光定量PCR儀（ABI-7500）進行實時定量PCR實驗，采用兩步法進行real-time PCR反應，其程序設置為：95℃30 s；95℃5 s，60℃34 s，40個循環(huán)。QPCR的數據分析采用2-ΔΔCT方法。每次實驗設置3次RNA提取重復和3次QPCR平行管重復。

1.6 數據處理

將所有的數據求出平均值和標準差（Mean±SE），使用SPSS 19.0軟件對實驗數據進行統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析（One-way ANOVO）中的LSD（Least significant difference）對處理組和對照之間差異顯著性進行比較。使用Origin 8.0軟件作圖。

表1 熒光定量斑馬魚相關基因的引物序列Table 1 Primers used for the quantification of the mRNA expression by QPCR

2 結果與分析

2.1 胚胎期丙草胺暴露對斑馬魚仔魚的致畸效應

丙草胺暴露后誘導斑馬魚仔魚（120 hpf）產生的畸形表型見圖1。斑馬魚仔魚出現心包囊腫、游囊關閉、軀干彎曲等現象，且同一條仔魚可出現2～3種癥狀。試驗中溶劑對照組斑馬魚仔魚沒有出現致畸現象。

圖2顯示丙草胺暴露斑馬魚胚胎至120 hpf，不同濃度暴露組仔魚產生畸形表型的百分比。隨著暴露濃度的增加，心包囊腫、脊柱彎曲、游囊關閉癥狀的嚴重程度增加。其中，0.50、1.00、1.50 mg·L-1暴露組仔魚心包囊腫率分別為5.56%、15.56%和25.56%，與對照組相比，1.00 mg·L-1暴露組顯著升高（P＜0.05），1.50 mg·L-1暴露組極顯著升高（P＜0.01）；0.50、1.00、1.50 mg·L-1暴露組仔魚脊柱彎曲率分別為6.67%、27.78%和35.56%，與對照組相比，1.00、1.50 mg·L-1暴露組均極顯著升高；0.50、1.00、1.50 mg·L-1暴露組仔魚游囊關閉率分別為20.00%、37.78%和60.00%，與對照組相比，0.50 mg·L-1暴露組顯著升高，1.00、1.50 mg·L-1暴露組均極顯著升高。

圖2 丙草胺暴露120 h斑馬魚仔魚的畸形率Figure 2 The malformation rate of larvae after zebrafish embryos exposed to pretilachlor for 120 h

圖1 丙草胺暴露120 h斑馬魚仔魚的畸形表型Figure 1 The malformation phenotype of zebrafish larvae after exposure to pretilachlor for 120 h

2.2 丙草胺暴露對斑馬魚心臟、脊椎和游囊發(fā)育相關基因表達的影響

胚胎期丙草胺暴露后斑馬魚仔魚產生心包囊腫、脊柱彎曲、游囊關閉癥狀，因此選取了心臟、脊椎和游囊發(fā)育相關基因來研究丙草胺在分子水平上對斑馬魚胚胎（仔魚）相關器官發(fā)育的影響（圖3）。結果表明，丙草胺暴露斑馬魚胚胎至48 hpf，1.00 mg·L-1暴露組Tbx2基因的表達水平極顯著降低（P＜0.01），1.50 mg·L-1暴露組表達水平顯著降低（P＜0.05）；丙草胺暴露斑馬魚胚胎至仔魚（120 hpf），1.50 mg·L-1暴露組BMP-2基因的表達水平顯著降低，1.00、1.50 mg·L-1暴露組BMP-4基因的表達水平極顯著降低；丙草胺暴露斑馬魚胚胎至72 hpf，1.50 mg·L-1暴露組shha基因的表達水平顯著降低，1.00、1.50 mg·L-1暴露組ihha基因的表達水平顯著降低。

3 討論

研究發(fā)現丙草胺暴露斑馬魚胚胎至120 hpf，斑馬魚仔魚出現心包囊腫、脊柱彎曲、游囊關閉等癥狀，且隨著暴露濃度的增加，畸形表型的嚴重程度增加，呈現劑量-效應關系。心包囊腫、脊柱彎曲、游囊關閉等癥狀是許多環(huán)境化學物質誘導斑馬魚胚胎/仔魚產生的畸形表型[11，13-14]，心包囊腫具有不可逆性，一旦形成就難以自然消失[15]，將造成仔魚心臟的結構異常和功能缺失，甚至威脅到斑馬魚的生存[11]。本試驗中出現心包囊腫的仔魚2 d內便會死亡。脊椎彎曲會導致仔魚游動能力減弱，停留在培養(yǎng)皿底部，最終因缺氧和影響取食而死。斑馬魚游囊由前后兩個組成，后游囊在受精后4.5 d開始充氣，游囊通過充氣和放氣來調節(jié)魚體的比重，以控制魚體內外的水壓平衡和身體沉浮，對于仔魚的呼吸和取食具有重要意義[16]。研究發(fā)現[17]游囊可以作為化學物質暴露的特定靶標器官，試驗中發(fā)現游囊關閉是丙草胺誘導斑馬魚仔魚出現的最敏感指標，畸形比率高于其他兩種畸形表型，游囊關閉的仔魚游動能力減弱而停留在培養(yǎng)皿底部，最終因缺氧和影響取食而死亡。

T-box基因家族在脊椎動物心臟發(fā)育中起重要作用，主要作用于脊椎動物的早期心臟譜系決定、心室特化、房室分隔和胚胎傳導系統(tǒng)分化等[18]。其中，Tbx2基因在房室特異性分化和房室管形成方面發(fā)揮了重要的作用[19]。本研究中丙草胺暴露斑馬魚胚胎至48 hpf，1.00 mg·L-1暴露組Tbx2基因的表達水平極顯著降低，1.50 mg·L-1暴露組表達水平顯著降低，表明丙草胺可能通過抑制心臟發(fā)育相關基因Tbx2的表達來影響心臟的發(fā)育，導致斑馬魚仔魚出現心包囊腫現象。有關化學物質導致斑馬魚心臟發(fā)育毒性的機理研究很多，心臟發(fā)育過程中Nkx2.5在心臟傳導系統(tǒng)、心房形成等方面起著重要作用[20]，章強等[14]報道低濃度銅通過下調Nkx2.5的上游基因Gata5來調控Nkx2.5的表達，從而影響斑馬魚胚胎的心臟發(fā)育。Tbx5轉錄因子在早期心臟發(fā)育，尤其是心房和左心室的發(fā)育中起著關鍵的作用，Hong等[21]研究發(fā)現軟骨藻酸（DA）暴露后斑馬魚心臟發(fā)育異常，推斷DA是通過調控Tbx5影響鈣循環(huán)相關基因的表達而引起心臟發(fā)育毒性。丙草胺是否通過上述機理來誘導斑馬魚心包囊腫尚需進一步驗證。

骨形態(tài)發(fā)生蛋白（Bone morphogenetic proteins，BMPs）是唯一能夠單獨誘導骨組織形成的局部生長因子，是骨組織形成過程中最關鍵的調節(jié)因子。在骨形成早期，BMP-2不僅可使未分化間質細胞向骨形成中心募集，并分化為骨系細胞，而且可使成纖維細胞、成肌細胞及骨髓的基細胞逆轉分化為骨系細胞[22]；BMP-4可促進軟骨細胞的分化和發(fā)育[23]。本研究發(fā)現丙草胺暴露斑馬魚胚胎至仔魚（120 hpf），1.50 mg·L-1暴露組BMP-2基因的表達水平顯著降低，1.00、1.50 mg·L-1暴露組BMP-4基因的表達水平極顯著降低。這表明丙草胺可能通過抑制BMP-2和BMP-4的表達而影響骨骼細胞的正常分化，造成斑馬魚仔魚脊椎彎曲。研究發(fā)現Mef2在骨骼肌、心肌和平滑肌發(fā)育過程中的介導細胞分化中起主要作用，最突出的作用是控制肌細胞分化過程中的基因轉錄[24]，岳東等[11]研究發(fā)現，久效磷暴露斑馬魚胚胎可能通過促進Mef2基因的表達而導致斑馬魚仔魚脊柱彎曲。研究表明MyoD、Myf5可調節(jié)骨骼肌的規(guī)范和分化[25]，丙草胺是否通過影響上述基因表達來誘導斑馬魚仔魚脊椎彎曲需進一步通過試驗驗證。shha和ihha基因對魚鰾上皮層、中胚層和外層組織的分化和形成具有決定作用[12]。本研究發(fā)現丙草胺暴露斑馬魚胚胎至72 hpf，1.50 mg·L-1暴露組shha基因的表達水平顯著降低，1.00、1.50 mg·L-1暴露組ihha基因的表達水平顯著降低，表明丙草胺可能通過抑制shha和ihha基因的表達而影響游囊的正常分化和發(fā)育，造成斑馬魚仔魚游囊發(fā)育畸形。

4 結論

丙草胺暴露斑馬魚胚胎后干擾了心臟、骨骼和游囊相關基因的表達，引起斑馬魚仔魚相關器官的發(fā)育異常，進而導致斑馬魚仔魚出現心包囊腫、游囊關閉、軀干彎曲等畸形現象。

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Teratogenic effects of embryonic exposure to pretilachlor on the larvae of zebrafish

LIU Ying,JIANG Lei,PAN Bo,LIN Yong
（Institute of Environment and Plant Protection,Academy of Tropical Agriculture Sciences of China,Haikou 571101,China）

To investigate the teratogenic effect and mechanism of abnormality of embryonic exposure to pretilachlor on the larvae of zebrafish,the malformation phenotype and abnormality rate of the larvae were studied after embryos were esposed to 0.50,1.00 and 1.50 mg· L-1pretilachlor from 6 h post fertilization（hpf）to 120 hpf,and also the abnormality mechanism was investigated by testing the gene expression related organ development.The results showed that pretilachlor could induce malformations of larvae,including pericardial cyst,spinal curvature and uninflated swim bladder,and the percentage of three kinds of abnormalities increased with the increase of exposure dose.The pericardial cyst rate were 15.56%（P＜0.05）,25.56%（P＜0.01）and spinal curvature rate were 27.78%（P＜0.01）,35.56%（P＜0.01）respectively after embryo exposed to 1.00,1.50 mg·L-1pretilachlor.The uninflated swim bladder rate were 20%（P＜0.05）,37.78%（P＜0.01）,60%（P＜0.01）respectively after embryo exposed to 0.50,1.00,1.50 mg·L-1pretilachlor.mRNA expressions of heart development related gene Tbx2[1.00 mg·L-1（P＜0.01）,1.50 mg·L-1（P＜0.05）],skeleton development related genes BMP-2[1.50 mg·L-1（P＜0.05）],BMP-4[1.00 mg· L-1（P＜0.01）,1.50 mg·L-1（P＜0.01）]and swim bladder development related genes shha[1.50 mg·L-1（P＜0.05）],ihha[1.00 mg·L-1（P＜0.05）, 1.50 mg·L-1（P＜0.05）]were reduced significantly after embryos were esposed to pretilachlor.The results deduced that pretilachlor could induce heart,skeleton and swim bladder developmental anomaly by supressing the mRNA expressions of above-mentioned oragan development related gene.

pretilachlor；zebrafish；teratogenic effect；Tbx2；BMP-2；BMP-4；shha；ihha

X171.5

A

1672-2043（2017）03-0481-06

10.11654/jaes.2016-1418

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LIU Ying,JIANG Lei,PAN Bo,et al.Teratogenic effects of embryonic exposure to pretilachlor on the larvae of zebrafish[J].Journal of Agro-Environment Science,2017,36（3）：481-486.

2016-11-08

劉迎（1981—），男，山東泰安人，助理研究員，主要從事農藥安全性評價與應用研究。E-mail：yingliu_zju@163.com

*通信作者：林勇E-mail：linyongty@163.com

海南省自然科學基金項目（20153125）；海南省社會發(fā)展科技專項（2015SF35）

Project supported：The Natural Science Foundation of Hainan Province，China（20153125）；Social Development of Science and Technology Projects of Hainan Province，China（2015SF35）