向雙云，周珍輝，關(guān)文怡，張 浩

（北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院畜牧獸醫(yī)系，北京 102442）

來源于雞腸道的乳酸菌的篩選及其飼用性的評價(jià)

向雙云，周珍輝*，關(guān)文怡，張 浩

（北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院畜牧獸醫(yī)系，北京 102442）

為給益生菌的制備提供良好的株菌來源，自健康成年雞腸道內(nèi)分離鑒定得到9株（S1、S2、K1、K2、K3、H1、H2、M1、M2）乳酸菌，從生長速度、耐酸、耐膽鹽、耐雞膽汁、抑菌能力、安全性等方面對株菌進(jìn)行初步篩選。結(jié)果表明：S1、S2、K3和M14株菌接種后 8 h 快速生長，進(jìn)入對數(shù)生長期，接種 22 h 后進(jìn)入細(xì)菌生長穩(wěn)定期。耐酸試驗(yàn)表明S1、S2、K3和M1表現(xiàn)為較強(qiáng)的耐酸能力，其中M1耐酸能力最強(qiáng)，在pH為2.0、3.0、4.0的培養(yǎng)基中存活率分別為76.8%、79.2%、91.5%。耐膽鹽試驗(yàn)表明S1、S2、K3和M1 4株在0.1%、0.2%、0.3%濃度的膽鹽培養(yǎng)基中的存活率分別為93.5%、89.6%、86.3%；96.1%、90.3%、86.7%；94.8%、88.7%、85.6%；95.2%、91.1%、85.3%。在0.1%、0.2%、0.3%濃度的膽汁培養(yǎng)基中S1、S2、K3和M1的存活率分別為93.8%、90.5%、87.1%；95.9%、90.8%、86.8%；95.6%、88.7%、85.8%；94.8%、91.7%、86.2%。S2和M1對大腸桿菌的抑菌圈直徑為16.23和18.25mm，表現(xiàn)為高度敏感；S1和K3對大腸桿菌的抑菌圈直徑為11.68和12.58mm，表現(xiàn)為中度敏感。

雞源；乳酸菌；耐酸；耐膽鹽；耐膽汁；抑菌性；安全性

乳酸菌是可發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌的統(tǒng)稱，可以改善宿主胃腸道功能，降低腸道pH，恢復(fù)宿主腸道內(nèi)菌群平衡，抑制病原菌的生長，乳酸菌還能定植于腸黏膜形成黏膜屏障，保護(hù)腸道健康，是最早應(yīng)用于微態(tài)制劑的菌種。我國農(nóng)業(yè)部第 1126 號公告中允許使用的飼料微生物添加劑有16種，其中乳酸菌有11種，占69%[1]。然而，當(dāng)前禽用飼料生產(chǎn)上所用乳酸菌主要分離自外界環(huán)境，這些菌株由于生活環(huán)境與動物腸道環(huán)境相差甚遠(yuǎn)，致使乳酸菌在動物腸道中的生長性能差，在消化道表面的適應(yīng)力不強(qiáng)，影響其生物活性的發(fā)揮，導(dǎo)致其應(yīng)用效果不穩(wěn)定。一些學(xué)者認(rèn)為，動物用益生菌最好分離自動物自身消化道[2-3]。本試驗(yàn)旨在對從健康成年雞腸道分離到的菌株，通過形態(tài)學(xué)觀察、生化試驗(yàn)、16S rDNA 序列分析鑒定為乳酸菌的菌株，再通過生長速度測定、耐酸性試驗(yàn)、耐膽鹽試驗(yàn)、耐雞膽汁試驗(yàn)、抑菌能力測定、安全性等系列試驗(yàn)，篩選出生長速度快，并能很快適應(yīng)腸道環(huán)境，抑菌能力強(qiáng)，安全性好的乳酸菌菌株，為禽用益生菌制劑的研究提供豐富的菌株來源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株及指示菌 試驗(yàn)菌株為北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室自京郊某散養(yǎng)雞場健康成年雞腸道中分離純化后，通過形態(tài)學(xué)觀察、生化試驗(yàn)、16S rDNA 序列分析鑒定為乳酸菌的9株菌株，菌株編號分別為S1和S2（十二指腸源）、K1和K2及K3（空腸源），H1和H2（回腸源）、M1和M2（盲腸源）。指示菌為大腸桿菌，由微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 培養(yǎng)基與試劑 MRS液體培養(yǎng)基、MRS固體培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基、1 mol/L的HCl和1 mol/L的NaOH、膽鹽、新鮮雞膽汁等。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌生長曲線測定 將保存的菌株在MRS液體培養(yǎng)基中連續(xù)活化3代，活化好的9株乳酸菌按1%的接種量接種于MRS肉湯培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)，設(shè)3個重復(fù)。每隔2 h取樣測定其OD值，并以MRS液體培養(yǎng)基為空白對照。以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，平均OD值為縱坐標(biāo)繪制出生長曲線[4]。

1.3.2 乳酸菌耐酸試驗(yàn) 將配制好的MRS液體培養(yǎng)基用1 mol/L的HCl和1 mol/L的NaOH將pH分別調(diào)至2.0、3.0、4.0，然后將培養(yǎng)24 h后的9株乳酸菌按1%的接種量分別接種于不同pH的培養(yǎng)基中，37℃分別處理3 h，每個處理設(shè)3個重復(fù)，以不加HCl和NaOH的MRS液體培養(yǎng)基為對照。處理完畢后，每個處理組和對照組的菌液10倍稀釋至合適的稀釋度，取3個合適稀釋度菌液100 μL分別涂布于MRS固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h后計(jì)數(shù)平皿的菌落數(shù)，記錄結(jié)果，每個處理計(jì)算平均菌落數(shù)。通過處理前后活菌數(shù)的平均計(jì)數(shù)結(jié)果計(jì)算乳酸菌的存活率。

存活率（%）=（不同 pH 的菌液平均活菌數(shù)/不加HCl的菌液平均活菌數(shù)）×100

1.3.3 乳酸菌耐膽鹽試驗(yàn) 選取生長速度好且耐酸性能強(qiáng)的S1、S2、K3和M1菌株進(jìn)行乳酸菌的耐膽鹽試驗(yàn)。在配制好的MRS液體培養(yǎng)基分別加入0.1%、0.2%、0.3%濃度的膽鹽后，將S1、S2、K3和M1 4株菌培養(yǎng)24 h后的菌液按5%（v/v）接種于含有膽鹽的MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)3 h，每個處理設(shè)3個重復(fù)，以不加膽鹽的MRS液體培養(yǎng)基為對照。處理完畢后，按1.3.2的方法取100 μL培養(yǎng)液進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算乳酸菌的平均存活率。

存活率（%）=（不同膽鹽濃度的菌液平均活菌數(shù)/不加膽鹽的菌液平均活菌數(shù)）×100

1.3.4 乳酸菌耐雞膽汁試驗(yàn) 為了進(jìn)一步研究試驗(yàn)所分離的乳酸菌對雞腸道的適應(yīng)性，更加真實(shí)地反映乳酸菌對雞腸道膽汁的耐受能力，課題組進(jìn)行了乳酸菌的耐雞膽汁試驗(yàn)。無菌操作取出雞的膽囊放入無菌平皿中，用注射器抽取膽汁放入無菌EP管中。按1.3.3的方法在MRS液體培養(yǎng)基中加入0.1%、0.2%、0.3%（v/v）濃度膽汁進(jìn)行乳酸菌的耐雞膽汁試驗(yàn)，37℃培養(yǎng)3 h，每個處理設(shè)3個重復(fù)，以不加膽汁的MRS液體培養(yǎng)基為對照。處理完畢后，按

1.3.2的方法取適量培養(yǎng)液進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算乳酸菌的平均存活率。

存活率（%）=（不同膽汁濃度的菌液平均活菌數(shù)/不加膽汁的菌液平均活菌數(shù)）×100

1.3.5 乳酸菌抑菌能力測定 采用牛津杯法測定S1、S2、K3和M1 4株菌對實(shí)驗(yàn)室分離的大腸桿菌的抑制能力。在制備好的營養(yǎng)瓊脂平板上加入0.1 mL培養(yǎng)好的大腸桿菌菌液，用涂布器將菌液涂布均勻。在培養(yǎng)基表面均勻垂直擺放4個牛津杯，輕輕加壓，使其與培養(yǎng)基接觸無空隙。在杯中加入培養(yǎng)好的S1、S2、K3和M1 4株菌的菌液，每株菌液做3個重復(fù)。置于4℃冰箱中作用 1 h后，再在37℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果。結(jié)果報(bào)告：以牛津杯周圍沒有肉眼可見細(xì)菌生長區(qū)域?yàn)橐志?，用游?biāo)卡尺測量抑菌圈的直徑，求出每株菌液3個平皿的平均值。根據(jù)抑菌圈平均值判斷乳酸菌對大腸桿菌的敏感性。抑菌圈直徑小于10 mm為耐藥，10～15 mm為中度敏感，15 mm以上為高度敏感。

1.3.6 安全性試驗(yàn) 1日齡的健康雛雞25只，隨機(jī)分為5 組，每組5只，試驗(yàn)組分別飲用S1、S2、K3和M1 4株菌的菌液，雛雞平均每日飲活菌1×1010個，持續(xù)飲活菌21 d，對照組正常飲水，觀察雛雞的精神狀態(tài)及采食、排便等情況 。

2 結(jié)果與分析

2. 1 乳酸菌生長曲線 從圖1可以看出，試驗(yàn)選取的9 株乳酸菌在培養(yǎng)開始時OD值沒有明顯改變，S1、S2、K3和M1 4株菌生長情況大致相同，培養(yǎng)基的OD值皆于接種后8 h快速上升，進(jìn)入對數(shù)生長期，接種22 h后進(jìn)入細(xì)菌生長穩(wěn)定期。K2、H1、H2、M2 4株菌在接種后12 h的OD 值快速上升，進(jìn)入對數(shù)生長期，培養(yǎng)至 28 h 后進(jìn)入生長穩(wěn)定期。K1菌的生長速度較慢，20 h后才開始進(jìn)入對數(shù)生長期。經(jīng)方差分析[5]，9株乳酸菌各菌株之間生長速度差異極顯著（F=9.27＞F0.01=2.59），結(jié)果表明S1、S2、K3和M1的生長性能較好，對數(shù)生長期長，K2、H1、H2、M2的生長性能一般，K1的生長性能較差。

圖 1 乳酸菌生長曲線

2.2 乳酸菌耐酸試驗(yàn)結(jié)果 由圖2可以看出，試驗(yàn)選取的9 株乳酸菌在pH 為2.0、3.0、4.0的條件下均能生長，但不同的生長環(huán)境表現(xiàn)出不一樣的耐受程度。隨著pH的降低，菌株的存活率都在下降。K1、K2、H1、H2、M2的耐酸能力較弱，S1、S2、K3和M1的生長情況大致相同，表現(xiàn)為較強(qiáng)的耐酸能力，其中M1耐酸能力最強(qiáng)，培養(yǎng)基pH為2.0、3.0、4.0的存活率分別為76.8%、79.2%、91.5%。

2.3 乳酸菌耐膽鹽試驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)2.1和2.2的試0.2%、0.3%濃度的膽鹽培養(yǎng)基中S1、S2、K3和M1的存活率分別為93.5%、89.6%、86.3%；96.1%、90.3%、86.7%；94.8%、88.7%、85.6%；95.2%、91.1%、85.3%，說明這4株乳酸菌對膽鹽均具有較好的耐受性。

2.4 乳酸菌耐雞膽汁試驗(yàn)結(jié)果 從圖4可以看出，S1、S2、K3和M1 4株乳酸菌用不同濃度的雞膽汁處理后均能很好生長，和耐膽鹽的情況大致相同。在0.1%、0.2%、0.3%濃度的膽汁培養(yǎng)基中S1、S2、K3和M1的存活率分別為93.8%、90.5%、87.1%；95.9%、90.8%、86.8%；95.6%、88.7%、85.8%；94.8%、91.7%、86.2%，說明這4株乳酸菌驗(yàn)結(jié)果，耐膽鹽試驗(yàn)選取了生長速度和耐酸程度都較好的S1、S2、K3和M1 4株菌進(jìn)行耐膽鹽試驗(yàn)。從圖3可以看出，S1、S2、K3和M1 4株乳酸菌在不同濃度的膽鹽處理后均能很好生長，在0.1%、對雞膽汁同樣具有較好的耐受性。

圖 2 乳酸菌耐酸試驗(yàn)結(jié)果

圖3 乳酸菌耐膽鹽試驗(yàn)結(jié)果

2.5 乳酸菌抑菌能力測定試驗(yàn)結(jié)果 S1、S2、K3和M1 4株乳酸菌對大腸桿菌均具有一定的抑制作用。S2和M1對大腸桿菌的抑制能力較強(qiáng)，抑菌圈直徑為16.23 mm和18.25mm，表現(xiàn)為高度敏感；S1和K3對大腸桿菌有一定的抑制力，抑菌圈直徑為11.68 mm和12.58mm，表現(xiàn)為中度敏感。

圖4 乳酸菌耐雞膽汁試驗(yàn)結(jié)果

2.6 安全性試驗(yàn)結(jié)果 在21 d的雛雞飼喂試驗(yàn)過程中，S2和M1 2株菌的試驗(yàn)組效果較好，雛雞采食、排便均正常，精神狀態(tài)良好，生長發(fā)育正常，所有試驗(yàn)雛雞沒有死亡現(xiàn)象；S1和K3 2株菌的試驗(yàn)組在飼喂前3天個別雛雞有拉稀現(xiàn)象，但從第4天開始所有情況都正常，和M1和S2組沒有明顯差異。說明S1、S2、K3和M1 4株乳酸菌具有良好的生物安全性。

3 討 論

3.1 乳酸菌生長特性 乳酸菌是動物機(jī)體內(nèi)正常的生理菌群之一，在腸道中繁殖達(dá)到一定數(shù)量時，就能改善和調(diào)節(jié)宿主體內(nèi)微生物菌群的平衡，對宿主健康產(chǎn)生有益的作用[6]。所以作為益生菌制劑的菌株應(yīng)具備良好的生長特性，才能達(dá)到一定的益生效果。但不同來源的乳酸菌生長速度會受到菌株本身、生長環(huán)境等多方面因素的影響。李春紅[7]研究報(bào)道，乳酸菌在培養(yǎng)6 h后進(jìn)入對數(shù)生長期，16 h達(dá)到穩(wěn)定期；王蔚淼等[8]報(bào)道，乳酸菌的對數(shù)生長期一般出現(xiàn)在接種后12～24 h，其中最早進(jìn)入對數(shù)生長期的菌株為培養(yǎng)后 8 h；崔一吉吉等[9]研究表明，乳酸菌在接種后2 h活菌數(shù)緩慢上升，10 h活菌濃度達(dá)到最高，36 h活菌數(shù)開始緩慢下降。本試驗(yàn)的9株乳酸菌生長曲線有明顯差異，M1、S1、S2和K3 4株菌生長速度較快，很快進(jìn)入對數(shù)期，并且穩(wěn)定期長，顯示了較好的生長特性。K2、H1、H2、M2的生長性能一般，K1的生長性能較差。這些結(jié)果說明，不同來源的乳酸菌的生長速度會有差異，同一來源的乳酸菌由于菌株本身的特性，在生長速度上也會不同，所以生長速度應(yīng)成為益生菌制劑菌株篩選的重要條件。

3.2 乳酸菌耐酸耐膽鹽特性 乳酸菌具有調(diào)節(jié)腸道菌群、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等益生作用[10-12]。乳酸菌等益生菌能否發(fā)揮作用，取決于菌株能否通過胃腸道的酸性環(huán)境及十二指腸中高濃度的膽酸鹽，并以活菌的狀態(tài)到達(dá)小腸，從而發(fā)揮微生態(tài)乳酸菌的益生功能。本試驗(yàn)旨在探究生長速度好的乳酸菌是否能夠耐受不同濃度的酸性環(huán)境及高濃度的膽鹽，成為腸道中的優(yōu)勢菌群，從而發(fā)揮益生作用。試驗(yàn)選取的9 株乳酸菌在pH為2.0、3.0、4.0的條件下均能生長， S1、S2、K3和M1 4株菌表現(xiàn)為較強(qiáng)的耐酸能力，其中M1耐酸能力最強(qiáng)。但不同菌株對不同pH表現(xiàn)出不一樣的耐受程度，M1在pH為2.0、3.0、4.0 MRS液體培養(yǎng)基中存活率分別為76.8%、79.2%、91.5%。楊曉宇等[13]分離得到LS菌株能夠在pH 2.0的條件下高效存活，存活率達(dá)135%，這與LS的來源有直接關(guān)系，因?yàn)長S分離自酸駝乳中，可能是酸駝乳發(fā)酵過程中環(huán)境酸度較高對菌株耐酸長期馴化的結(jié)果。選取S1、S2、K3和M1 4株菌耐酸性能較好的菌株進(jìn)行耐膽鹽試驗(yàn)，4株乳酸菌對膽鹽均具有較好的耐受性。在0.3%的膽鹽濃度中，S1、S2、K3和M1的存活率分別為86.3%、86.7%、85.6%、85.3%。李春紅[7]研究表明，菌株XMR-3對膽鹽的耐受能力較強(qiáng)，當(dāng)膽鹽濃度為0.3%時，存活率可達(dá)87.3%。楊曉宇等[13]分離得到LJ1菌株在豬膽鹽中表現(xiàn)較高存活率，高達(dá)132%。由此可以看出，不同菌株在不同的膽鹽培養(yǎng)基中的存活率有較大差異，膽鹽種類、濃度的差異也會導(dǎo)致結(jié)果不一致。為了更接近雞腸道環(huán)境，本試驗(yàn)選取雞膽汁代替膽鹽進(jìn)行了乳酸菌的耐雞膽汁試驗(yàn)，結(jié)果表明，在0.3%濃度的膽汁培養(yǎng)基中S1、S2、K3和M1的存活率分別為87.1%、86.8%、85.8%、86.2%，說明這4株乳酸菌對雞膽汁具有較好的耐受性。

3.3 乳酸菌抑菌能力 在研制開發(fā)益生菌制劑時，菌種對致病菌的抑制作用也是評價(jià)益生菌制劑有效性的重要依據(jù)。乳酸菌產(chǎn)生的大量有機(jī)酸如乳酸，能降低腸道內(nèi)的pH和Eh （氧化還原電勢），使腸道處于酸性環(huán)境[14]，從而抑制病原性細(xì)菌如沙門氏菌、志賀氏菌、致病性大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、痢疾桿菌等的生長，同時低 pH 能促進(jìn)腸道蠕動，加速病原菌排出體外[15-16]，從而起到調(diào)節(jié)動物消化道微生態(tài)平衡和維護(hù)畜禽腸道健康的作用。李春紅[7]研究表明，分離自蛋雞腸道的菌株XMR-3對變形桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌4種常見病原菌均具有良好的抑制效果，抑菌圈直徑均超過20 mm。高擎等[17]研究報(bào)道，11株乳酸菌對大腸桿菌 K88、K99、雞白痢沙門菌指示菌均有不同程度的抑制作用。本試驗(yàn)中S2和M1對大腸桿菌的抑制能力較強(qiáng)，抑菌圈直徑為16.23 mm和18.25 mm，表現(xiàn)為高度敏感。因此，乳酸菌對常見病原菌具有一定的抑制作用。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)比較了課題組從健康成年雞腸道中成功分離的9株乳酸菌的生長速度、耐酸、耐膽鹽、耐膽汁和抑菌特性。結(jié)果表明，M1、S1、S2和K3 4株乳酸菌具有良好的生物安全性，具有較快的生長速度，較好的適應(yīng)腸道環(huán)境的能力，而且具有良好的抑菌能力，具有進(jìn)一步制備成優(yōu)質(zhì)、高效活菌益生菌制劑的開發(fā)條件，為益生菌的制備提供了良好的菌株來源。

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Screening Lactic Acid Bacteria Derived from Adult Chicken Intestinal Gut and Evaluation for their Implications in Chicken Feeding

XIANG Shuang-yun, ZHOU Zhen-hui, GUAN Wen-yi, ZHANG Hao*
(Beijing agricultural vocational college of animal husbandry and veterinary department, Beijing 102442)

For the preparation of probiotic strains from good, healthy adult intestinal tract in isolation and identi fi cation of 9 strains (S1, S2, K1, K2, K3, H1, H2, M1, M2) of lactic acid bacteria from the preliminary screening of strain growth, acid resistance, salt tolerance, chicken bile and bile the inhibition ability and safety etc.. The results showed that S1, S2, K3 and M14 strains grew rapidly at 8 h after inoculation, and entered the logarithmic growth phase. After inoculation for 22 h, they were in stable stage of bacterial growth. Acid test showed that S1, S2, K3 and M1 showed strong acid resistance, and M1 acid resistant ability was the strongest, and the survival rate was 76.8%, 79.2%, and in the medium of pH of 2, 3, respectively. Bile salt tolerance test showed that S1, S2, K3 and M1 4 strains in 0.1%, 0.2%, 0.3% bile salt concentration of culture medium survival rate were 93.5%, 89.6%, 86.3%; 96.1%, 90.3%, 86.7%; 94.8%, 88.7%, 85.6%; 95.2%, 91.1%, 85.3%. The survival rates of S1, S2, K3 and M1 were 93.8%, 90.5%, and 87.1%, respectively, at the concentration of bile concentrations of 0.1%, 0.2% and 0.3%, respectively, and those of,,, and so on, respectively, 95.9%, 90.8%, 86.8%, 95.6%, 94.8%, respectively. S2 and M1 were highly sensitive to the inhibitory circle diameter of Escherichia coli 16.23mm and 18.25mm, and S1 and K3 were moderately sensitive to the inhibitory circle diameter of 11.68mm and 12.58mm, respectively.

Chicken source; Lactic acid bacteria; Acid; Bile salts resistance; Bile tolerance; Antibacterial sex; Security

S831.5

：A

：10.19556/j.0258-7033.2017-02-097

2016-07-06；

2016-12-26

北京市教育委員會科技計(jì)劃面上項(xiàng)目；禽源益生菌添加劑的研發(fā)與推廣（KM201512448006）

向雙云（1977-），女，講師，碩士，研究方向?yàn)閯游锛膊》揽兀珽-mail:103662549@qq.com

* 通訊作者：周珍輝（1969-），女，教授，碩士，研究方向?yàn)閯游锛膊》揽?，E-mail:zzhzyy2013@163.com