李偉杰，田野，豈曉鑫，蔣穎，魏財(cái)文，蔣桃珍(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

禽源多殺性巴氏桿菌多位點(diǎn)序列分型研究

李偉杰，田野，豈曉鑫，蔣穎，魏財(cái)文，蔣桃珍*
(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

為了解國(guó)內(nèi)禽源多殺性巴氏桿菌流行情況，對(duì)分離自18省份的84株多殺性巴氏桿菌采用莢膜多重PCR分型和多位點(diǎn)序列分型對(duì)其血清型和基因型進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明：禽源多殺性巴氏桿菌主要以血清A型為主，占96.4%(81/84)；多位點(diǎn)序列分型可將禽源多殺性巴氏桿菌分為 5種ST型，其中ST129為主要流行型，占94.0%(79/84)。本研究為我國(guó)禽源多殺性巴氏桿菌的流行病學(xué)監(jiān)測(cè)和基因多樣性提供了數(shù)據(jù)支持。

多殺性巴氏桿菌；莢膜分型；多位點(diǎn)序列分型

禽霍亂是由多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida)引起的雞、鴨和鵝等多種禽類的一種接觸性、敗血性傳染病[1]。病禽、康復(fù)禽或健康帶菌禽是主要的傳染源，主要通過(guò)被污染的飼料、飲水經(jīng)消化道感染，多發(fā)生于性成熟的禽類，自然感染潛伏期為2～9 d。在潮濕、多雨、氣溫較高的季節(jié)時(shí)有發(fā)生。本病是危害我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)的重要細(xì)菌性傳染病之一。

脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)[2]、腸道細(xì)菌基因間重復(fù)序列(ERIC-PCR)指紋圖譜技術(shù)[3]和多位點(diǎn)序列分型(MLST)[4]等方法推動(dòng)了對(duì)多殺性巴氏桿菌分子流行病學(xué)和基因多樣性的研究?，F(xiàn)在MLST已經(jīng)成為病原菌基因分型的金標(biāo)準(zhǔn)，在分子流行病學(xué)調(diào)查中得到廣泛應(yīng)用[5-7]。由于國(guó)內(nèi)對(duì)禽源多殺性巴氏桿菌的基因多樣性和分子流行病學(xué)狀況研究的不多，因此本研究擬對(duì)分離和收集的禽源多殺性巴氏桿菌進(jìn)行MLST分型，以便為我國(guó)多殺性巴氏桿菌病暴發(fā)的流行病學(xué)監(jiān)測(cè)和基因多樣性研究提供支持。

1 材料與方法

1.1 菌株 84株分離株分離自國(guó)內(nèi)的不同地區(qū)和不同年代(表1)，由中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心提供。

表1 多殺性巴氏桿菌的血清分型和MLST分型

續(xù)表

續(xù)表

1.2 主要試劑 胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)和胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)購(gòu)自O(shè)XOID公司，馬血清購(gòu)自GIBCO公司，Ex Taq酶、DL2000 DNA Maker購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司，瓊脂糖購(gòu)自Biowest公司，Goldview購(gòu)自北京賽百盛基因技術(shù)有限公司。

1.3 菌株DNA的提取 分離株在含5%馬血清的TSA培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h采用熱裂解法[8]提取基因組 DNA，挑取純培養(yǎng)菌落于100 μL無(wú)菌蒸餾水中，沸水浴10 min，然后冰浴10 min，12000 r/min離心1 min，上清作為PCR擴(kuò)增的模板DNA。

1.4 菌株kmtI基因的擴(kuò)增及序列分析 按照文獻(xiàn)方法[9]對(duì)分離株進(jìn)行kmtI基因的PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序后與 NCBI 核酸數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行 BLAST序列比對(duì)。

1.5 菌株血清型的鑒定 按照Townsend等[9]建立的多殺性巴氏桿菌莢膜多重PCR方法對(duì)分離株血清型進(jìn)行鑒定，引物見表2，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。

表2 多殺性巴氏桿菌種鑒定、莢膜血清分型和MLST的引物

*在zwf-1對(duì)應(yīng)的引物不能有效擴(kuò)增的情況下使用

1.6 MLST 分型 根據(jù)Subaaharan等[4]建立的禽源多殺性巴氏桿菌 MLST 分型方法，對(duì)本研究中84株分離株的7個(gè)看家基因(腺苷酸環(huán)化酶基因adk、酯酶基因est、6-磷酸-甘露糖異構(gòu)酶基因pmi、葡萄糖-6磷酸脫氫酶基因zwf、蘋果酸脫氫酶基因mdh、谷氨酸脫氫酶基因gdh、磷酸葡萄糖異構(gòu)酶基因pgi)進(jìn)行擴(kuò)增及測(cè)序，引物見表2。序列經(jīng)MEGA7軟件編輯后，提交到RIRDC MLST在線數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，獲得菌株的序列型，并利用 MEGA7軟件對(duì)RIRDC MLST 數(shù)據(jù)庫(kù)中的部分 ST 型進(jìn)行序列比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分析其分子進(jìn)化關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離株的kmtI鑒定 通過(guò)對(duì) 84株分離株進(jìn)行kmtI基因的擴(kuò)增和測(cè)序，提交 GenBank進(jìn)行 BLAST 比對(duì)，結(jié)果顯示與多殺性巴氏桿菌的相似性均達(dá) 99 %以上。表明本研究中收集和分離的84株分離株均為多殺性巴氏桿菌。

2.2 血清分型 利用莢膜多重PCR 方法將 84株多殺性巴氏桿菌分為 A和B共2種血清型，其中81株為A型，占96.4%；其余3株為B型，且均分離自霍亂雞(表1)。

2.3 MLST分型 對(duì)84株多殺性巴氏桿菌分別進(jìn)行adk、est、pmi、zwf、mdh、gdh和pgi7個(gè)看家基因的擴(kuò)增和測(cè)序，結(jié)果顯示可以將其分為 ST129、ST122、ST107、ST62和ST44 5種 ST 型，其中禽源多殺性巴氏桿菌主要以 ST129 型為主，占94%(79/84)具體見表1。利用 MEGA7對(duì)本研究確定的5個(gè)ST型和國(guó)內(nèi)報(bào)道的其他ST型[10]進(jìn)行序列分析，結(jié)果表明：國(guó)內(nèi)分離株ST122和ST44親緣關(guān)系最近，ST62和ST58親緣關(guān)系最近；主要流行的ST-129型與ST122、ST44、ST62、ST58具有較近的親緣關(guān)系，在同一大的分支上；ST8和ST107與其他的ST型親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖1)。

圖1 84株禽源多殺性巴氏桿菌的多位點(diǎn)序列系統(tǒng)進(jìn)化樹

3 討論與小結(jié)

多殺性巴氏桿菌根據(jù)莢膜抗原可分為A、B、D、E和F 5種血清型，本研究通過(guò)莢膜多重PCR方法對(duì)84株禽源多殺性巴氏桿菌(主要分離收集自1953年至1990年)進(jìn)行血清分型，結(jié)果有81株為莢膜A型。程安春等[11]對(duì)從1990-1995年分離自四川省不同地區(qū)的256株鴨源多殺性巴氏桿菌進(jìn)行血清分型，其中254株為莢膜A型，2株未定型；程龍飛等[12]收集2007-2013年福建及鄰近省份分離的95株禽源多殺性巴氏桿菌，經(jīng)鑒定莢膜型全為A型；Wang等[5]對(duì)2011-2012年分離自江蘇省不同地區(qū)的40株禽源多殺性巴氏桿菌流調(diào)結(jié)果顯示全部為莢膜A型。以上研究都表明多年來(lái)國(guó)內(nèi)引起禽霍亂的優(yōu)勢(shì)血清型為A型。

多殺性巴氏桿菌的MLST是由多位點(diǎn)酶電泳(MLEE)衍生出來(lái)，主要通過(guò)看家基因序列的多態(tài)性對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分類[4]。由MLST得到的分型結(jié)果可與數(shù)據(jù)庫(kù)中已有的信息進(jìn)行比對(duì)，從而使不同地點(diǎn)和不同時(shí)間分離的菌株可以進(jìn)行橫向和縱向比較。目前多殺性巴氏桿菌多位點(diǎn)序列分型的在線數(shù)據(jù)庫(kù)有兩個(gè)(http://pubmlst.org/pmultocida/)：Multiple host MLST由英國(guó)格拉斯哥大學(xué)開發(fā)，針對(duì)不同宿主來(lái)源的多殺性巴氏桿菌；RIRDC MLST由澳大利亞動(dòng)物研究所開發(fā)，針對(duì)禽源多殺性巴氏桿菌。截止2016年11月18日，RIRDC MLST數(shù)據(jù)庫(kù)中已經(jīng)鑒定有329種 ST 型。本研究通過(guò)對(duì)84株多殺性巴氏桿菌MLST的鑒定，獲得5個(gè)ST型，主要以 ST129為主，占94%(79/84)，與文獻(xiàn)報(bào)道[5,10]的一致。還鑒定到 ST122、ST107、ST62和ST44，這在禽源多殺性巴氏桿菌中為國(guó)內(nèi)首次報(bào)道。由于MLST能夠區(qū)分親緣關(guān)系較近的菌株，能夠?qū)Ρl(fā)的流行菌株進(jìn)行溯源，因此本研究中基因型相同的79株菌株可能來(lái)源于同一株多殺性巴氏桿菌?？紤]到ST129型已在斯里蘭卡[6]、印度[7]和丹麥等(http://pubmlst.org/pmultocida/)許多國(guó)家被發(fā)現(xiàn)，此基因型可能在全球都有分布。同時(shí)它可以從發(fā)生禽霍亂的雞、鴨、鵝和麻雀體內(nèi)分離到，說(shuō)明它具有多動(dòng)物宿主的特性。

綜上所述，本研究為禽源多殺性巴氏桿菌的流行病學(xué)提供了一些本底數(shù)據(jù)，為今后多殺性巴氏桿菌的監(jiān)測(cè)起到了支撐作用，同時(shí)對(duì)于研制有效的疫苗預(yù)防和控制禽霍亂有一定的幫助。

[1] Wilson B A, Ho M.Pasteurellamultocida: from zoonosis to cellular microbiology [J]. Clinical Microbiology Reviews, 2013, 26 (3): 631-655.[2] Blackall P J, Miflin J K. Identification and typing ofPasteurellamultocida: a review [J]. Avian Pathology, 2000, 29 (4): 271-287.

[3] Loubinoux J, Lozniewski A, Lion C,etal. Value of enterobacterial repetitive intergenic consensus PCR for study ofPasteurellamultocidastrains isolated from mouths of dogs [J]. J Clin Microbiol, 1999, 37 (8): 2488-2492.

[4] Subaaharan S, Blackall L L, Blackall P J. Development of a multi-locus sequence typing scheme for avian isolates ofPasteurellamultocida[J]. Vet Microbiol, 2010, 141(3/4): 354-361.

[5] Wang Y, Zhu J，Lu C,etal. Evidence of circulation of an epidemic strain ofPasteurellamultocidain Jiangsu, China by multi-locus sequence typing (MLST) [J]. Infection, Genetics and Evolution, 2013, 20: 34-38.

[6] Hotchkiss E J, Hodgson J C, Lainson F S,etal. Multilocus sequence typing of a global collection ofPasteurellamultocidaisolates from cattle and other host species demonstrates niche association [J]. BMC Microbiol, 2011, 11: 115-123.[7] Sarangi L N, Thomas P, Gupta S K,etal. Molecular epidemiology ofPasteurellamultocidacirculating in India by multilocus sequence typing [J]. Transbound Emerg Dis, 2016, 63(2): 286-292.

[8] 李偉杰，魏財(cái)文，田野，等. 豬源多殺性巴氏桿菌莢膜分型及外膜蛋白H基因序列分析[J]. 中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2015，42 (1): 32-37.

[9] Townsend K M. Boyce J D, Chung J Y,etal. Genetic organization ofPasteurellamultocidacap loci and development of a multiplex capsular PCR typing system [J]. J Clin Microbiol, 2001, 39(3): 924-929.

[10]王林柏，孫久鶴，郭東春，等. 國(guó)內(nèi)部分地區(qū)多殺性巴氏桿菌莢膜血清型和基因型的研究[J]. 中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2016，38 (2): 116-119.

[11]程安春，汪銘書，陳孝躍，等. 256株鴨源多殺性巴氏桿菌血清學(xué)鑒定及病原特性研究[J]. 中國(guó)獸醫(yī)科技，1997，27(7)：13-15.

[12]程龍飛，許利娜，林建生，等. 福建及鄰近省份禽源多殺性巴氏桿菌的分離鑒定[J]. 中國(guó)動(dòng)物傳染病學(xué)報(bào)，2014，22(4)：40-44.

(編輯：李文平)

Multi-locus Sequence Typing ofPasteurellamultocidaIsolated from Avian

LI Wei-jie，TIAN Ye，QI Xiao-xin，JIANG Ying，WEI Cai-wen，JIANG Tao-zhen*
(ChinaInstituteofVeterinaryDrugControl,Bejing100081,China)

To investigate the epidemic status of thePasteurellamultocidaisolated from avian, eighty-fourP.multocidaisolates collected from 18 provinces were subject to identifications of the serotypes and genotypes by capsular multiplex PCR and multi-locus sequence typing. The results showed thatP.multocidaisolated from avian were mainly classified into serotype A, accounting for 94.6%. Five different sequence types including ST129, ST122, ST107, ST62, ST44 were identified by MLST, and the predominate genotype was ST129, accounting for 94.6%. The present study provides data support for the epidemiological surveillance and genetic diversity ofP.multocidaisolated from avian.

Pasteurellamultocida; capsular serotyping; multi-locus sequence typing

2016-11-21

A

1002-1280 (2017) 02-0001-06

S852.61

生物安全關(guān)鍵技術(shù)研發(fā)(2016YFC1201603)；國(guó)家微生物資源平臺(tái)(NIMR-5)

李偉杰，副研究員，從事獸醫(yī)微生物和獸用生物制品研究。

蔣桃珍。E-mail：jiangaozhen@ivdc.org.cn