王 珊，高奕紅，高豐琴

(咸陽師范學(xué)院 化學(xué)與化工學(xué)院，陜西 咸陽 712000)

面對有機體的多樣與復(fù)雜及不斷惡化的環(huán)境，人類仍然要直接或間接地遭受各種各樣的危害，因此醫(yī)學(xué)和生物學(xué)的進步和突破，對新型、高效的藥物開發(fā)和應(yīng)用顯得尤為重要和迫切。牛血清白蛋白在結(jié)構(gòu)與性能上與人血清白蛋白極為相似且便宜易得，通過把它放在模擬人體環(huán)境中來研究生物學(xué)和生命科學(xué)是十分有意義的[1-2]。由于牛血清白蛋白能與許多內(nèi)源物質(zhì)和外源物質(zhì)結(jié)合，根據(jù)其原理在生理條件下，使目標藥物與牛血清白蛋白相結(jié)合，通過對其仔細研究和多次重復(fù)實驗來了解藥物-牛血清白蛋白結(jié)合體的結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點數(shù)、結(jié)合力、結(jié)合距離等問題，對于生物學(xué)與生命科學(xué)的進一步了解和對高效、低毒的新藥開發(fā)及正確用藥有很強的指導(dǎo)和啟發(fā)意義[3-7]。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

三羥甲基氨基甲烷：Mr=121.14，天津化學(xué)制藥廠;牛血清白蛋白(BSA)：Mr=66 430，天津化學(xué)制藥廠；鹽酸環(huán)丙沙星(CIP)：Mr=385.82，山西津華暉星制藥廠。以上試劑均為分析純。

紫外-可見分光光度計：UV-Vis specord50，德國耶拿公司；熒光分光光度計：RT-5310PC，日本島津公司；分析天平：AG135，瑞士梅特勒公司。

1.2 實驗步驟

1.2.1 Tris-HCl(pH=7.40)緩沖溶液的配制

用分析天平準確稱取3.028 5 g三羥甲基氨基甲烷，將三羥甲基氨基甲烷溶解后定容于250 mL的容量瓶中配成濃度為0.1 mol/L的A溶液。

再準確量取2.1 mL濃鹽酸(12 mol/L)，并將該濃鹽酸轉(zhuǎn)移至250 mL的容量瓶中并用蒸餾水定容，配成0.1 mol/L的鹽酸溶液記為B液。將B液緩慢加入A液中，在小磁子的攪拌下，在pH=7.40時加入約230 mL B溶液。然后用分析天平準確稱量2.925 g NaCl固體，加入至上述混合溶液中，配成c(NaCl)=0.1 mol/L。

最后準確稱量0.066 4 g BSA固體，加入至上述混合液中，并用蒸餾水定容至500 mL，配成含c(BSA)=2×10-6mol/L的Tris-HCl-NaCl-BSA溶液。

1.2.2 CIP溶液的配制

準確稱取0.009 6 g CIP，并用上述緩沖溶液-BSA溶解并定容于250 mL的容量瓶中配成的溶液c(CIP)=1×10-4mol/L。

1.2.3 不同c(CIP)的配制

取容量為25 mL的6個容量瓶，并依次標上0、1、2、3、4、5號，并按序號依次加入0、1、2、3、4、5 L已配好的c(CIP)=1×10-4mol/L溶液，然后用緩沖溶液-BSA定容，分別配成c(CIP)=0、4×10-6、8×10-6、12×10-6、16×10-6、20×10-6mol/L溶液用于熒光和紫外-可見光譜測量。

1.2.4 同步熒光光譜法測量不同c(CIP)

將0、1、2、3、4、5號不同c(CIP)依次加入到石英比色皿中，調(diào)節(jié)熒光光譜儀，使熒光發(fā)射與激發(fā)狹縫寬度分別是10和5，固定波長在280 nm處，波長范圍為300～540 nm，進行同步熒光光譜法測量，將每組熒光強度和對應(yīng)波長保存下來。

1.2.5 紫外-可見光譜法測量c(CIP)

將0、1、2、3、4、5號不同c(CIP)依次加入到石英比色皿中，調(diào)節(jié)紫外-可見分光光度儀，在波長范圍為190～540 nm之間以蒸餾水作為參比，掃描紫外-可見光譜，并保存數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 藥物與BSA的相互作用的光譜圖

2.1.1 不同c(CIP)與BSA間作用的熒光光譜圖

在c(BSA)=2×10-6mol/L條件下，不同c(CIP)與BSA間作用的熒光光譜圖見圖1。

λ/nm1～6為c(CIP)=0、4×10-6、8×10-6、12×10-6、16×10-6、20×10-6 mol/L圖1 不同c(CIP)與BSA間作用的熒光光譜圖

牛血清白蛋白的熒光發(fā)射波長在347 nm處[8]。由圖1可見，隨著c(CIP)的增大，牛血清白蛋白的熒光強度逐漸減小，說明鹽酸環(huán)丙沙星對牛血清白蛋白具有猝滅的作用[9]。

2.1.2 不同c(CIP)與BSA間作用的同步熒光光譜圖

在c(BSA)=2×10-6mol/L條件下，不同c(CIP)與BSA間作用的同步熒光光譜圖見圖2。

恒定波長的熒光光譜法被稱為同步熒光光譜法，在可能的條件下，選擇等于斯托克斯位移的Δλ，在理論上也應(yīng)該這樣，但實際上很多情況下要根據(jù)實驗來進行擇優(yōu)選擇，例如：熒光黃的同步熒光分析中Δλ=3 nm，此時所得同步熒光峰形好、互不干擾，而隨著Δλ的增大，當Δλ=10.20 nm時，同步熒光峰將變寬，估計會有重疊。恒定波長同步熒光光譜法具有選擇性好，靈敏度高，受干擾小等特征。

λ/nm1～6為c(CIP)=0、4×10-6、8×10-6、12×10-6、16×10-6、20×10-6 mol/L圖2 不同c(CIP)與BSA間作用的同步熒光光譜圖

通過對圖2的分析可以清楚地知道，隨著c(CIP)濃度的增大，牛血清白蛋白的熒光強度逐漸減小，這結(jié)果充分證明CIP對牛血清白蛋白有熒光猝滅的效果。另一方面，從對以上圖譜的分析可充分證明CIP對牛血清白蛋白有熒光猝滅作用，而且伴隨著c(CIP)的增大，猝滅強度也隨之增強[10-12]。

2.1.3 紫外-可見分光光譜圖

紫外-可見吸收光譜法是驗證小分子藥物與牛血清白蛋白是否生成復(fù)合物的非常有效的方法，為確證CIP與BSA的作用，分別測定了BSA及CIP-BSA體系的紫外-可見吸收光譜，在c(BSA)=2×10-6mol/L條件下，不同c(CIP)與BSA間作用的紫外-可見分光光譜圖見圖3。

λ/nm1～6為c(CIP)=0、4×10-6、8×10-6、12×10-6、16×10-6、20×10-6 mol/L圖3 不同c(CIP)與BSA間作用的紫外-可見分光光譜圖

由圖3可見，CIP-BSA體系的吸收光譜與其理論吸收光譜有明顯差別，說明CIP與牛血清白蛋白之間發(fā)生了相互作用，并生成了新復(fù)合物[5]。

2.2 熒光光譜分析

2.2.1 CIP與BSA相互作用分析

通過對圖1～圖3的分析，牛血清白蛋白的熒光強度隨c(CIP)的增大而表現(xiàn)為逐漸降低，且在最大發(fā)射波長的吸收峰處，牛血清白蛋白略有紅移現(xiàn)象，說明CIP對牛血清白蛋白的熒光猝滅過程是靜態(tài)猝滅，Stern-Volmer方程如下。

F0/F=1+Kqτ0c=1+Ksvc

(1)

式中，τ0為熒光壽命的大小，s；Ksv為Stern-Volmer猝滅常數(shù)，L/mol；Kq為猝滅速率常數(shù)，L/(mol·s)；F0、F分別為有、無猝滅劑時的熒光強度；c為猝滅劑的濃度， mol/L。

CIP與BSA相互作用的Stern-Volmer分析見圖4。

c(CIP)×106/(mol·L-1)圖4 CIP與BSA相互作用的Stern-Volmer分析

由圖4計算得出：Ksv=34 053 L/mol；Kq=3.405 3×1012L/(mol·s)。

Kq反映了體系中分子的彼此擴散和相互碰撞對生物大分子熒光壽命衰減速率的影響,各類熒光猝滅劑對生物大分子的最大動態(tài)熒光猝滅速率常數(shù)約為2.0×1010L/(mol·s)。通過計算結(jié)果發(fā)現(xiàn)CIP對牛血清白蛋白的熒光猝滅速率常數(shù)Kq值都遠大于2.0×1010L /(mol·s)(最大擴散碰撞猝滅常數(shù))[14]，可以推斷動態(tài)猝滅應(yīng)該是靜態(tài)猝滅。

當猝滅體分子和熒光物質(zhì)分子之間形成新的復(fù)合物而發(fā)生靜態(tài)猝滅時,服從Lineweaver-Burk雙倒數(shù)方程：

(2)

通過圖5計算得到靜態(tài)猝滅常數(shù)KLB=3.593×10-5L/mol，更加充分證明了該熒光猝滅不是因為碰撞而引起的動態(tài)猝滅，而是通過反應(yīng)生成的化合物而導(dǎo)致的靜態(tài)猝滅[15]。

c(CIP)-1×10-5/(L·mol-1)圖5 CIP與BSA相互作用的雙倒數(shù)分析

2.2.2 藥物與BSA相互作用的猝滅反應(yīng)參數(shù)

藥物與BSA相互作用的猝滅反應(yīng)參數(shù)見表1。

表1 藥物與BSA相互作用的猝滅參數(shù)

通過表1數(shù)據(jù)可知，CIP與牛血清白蛋白相互作用的猝滅規(guī)律為靜態(tài)猝滅[11-13]，同時由猝滅數(shù)據(jù)按Stern-Volmer方程，得到的猝滅速率常數(shù)Kq值都遠大于2.0×1010L/(mol·s)(最大擴散碰撞猝滅常數(shù))，充分證實了猝滅不是由于碰撞引起的動態(tài)猝滅,而是由藥物與牛血清白蛋白相互作用反應(yīng)生成化合物而引起的靜態(tài)猝滅[14-15]。另一方面，通過計算數(shù)據(jù)可知，由上述Stern-Volmer方程，雙倒數(shù)曲線的相關(guān)系數(shù)R可看出各曲線線性很好，結(jié)合點數(shù)n都近似為1。

3 結(jié) 論

CIP與牛血清白蛋白相互作用的規(guī)律為靜態(tài)猝滅，牛血清白蛋白與CIP之間的結(jié)合常數(shù)K=35 010.636、靜態(tài)猝滅常數(shù)KLB=3.593×10-5、結(jié)合位點數(shù)n=1.081 3、猝滅速率常數(shù)Kq=3.405 3×1012。這些數(shù)據(jù)分析結(jié)果可以為之后的醫(yī)藥研發(fā)提供很大的幫助。

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