徐紅紅++潘永玖++梁麗敏++李珊珊

摘 要：千里香為我國(guó)較常見(jiàn)的藥用植物，有麻醉止痛，消腫解毒等功效。本實(shí)驗(yàn)以其新生幼葉及莖段為外植體，通過(guò)優(yōu)化組織培養(yǎng)方法，篩選出適宜千里香生長(zhǎng)的培養(yǎng)基體系，其中生長(zhǎng)素的種類及含量對(duì)外植體的生長(zhǎng)具有重要作用，同時(shí)，一定濃度的活性炭也可以有效地預(yù)防愈傷組織的褐化。經(jīng)大量試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)適合千里香生長(zhǎng)的培養(yǎng)基為：MS +6-BA2.5mg/L+NAA0.5mg/L+活性炭0.5g/L；本次實(shí)驗(yàn)旨在為千里香的無(wú)土大面積栽培提供新的方法和途徑，同時(shí)也為千里香在分子水平的研究提供無(wú)菌材料。

關(guān)鍵詞：千里香；組織培養(yǎng)；優(yōu)化；生長(zhǎng)素

基金項(xiàng)目：廣西高校右江流域特色民族藥研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（xzdsysyy2015304）；2014年右江民族醫(yī)學(xué)院校級(jí)課題。

千里香（Murraya paniculata）又名七里香、萬(wàn)里香，為蕓香科（Rutaceae）九里香屬（Murraya）植物，原名小葉九里香，1978年黃成就將小葉九里香上升為種，更名為千里香[1]。千里香因具有耐旱不耐寒的特性而廣泛分布于我國(guó)的廣西、云南等高海拔溫?zé)岢睗竦貐^(qū)，植物體為常綠灌木，具有麻醉止痛，活血散瘀等多種功效，是我國(guó)較常用的中草藥材。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)千里香的研究較少，且多見(jiàn)于對(duì)其化學(xué)組份以及藥理作用的探索，D.P. Chakraborty等人發(fā)現(xiàn)千里香植物體內(nèi)含有一種新的香豆素抗生素[2]；Yao hua等人從千里香的葉子中提取了兩種氧甲基黃酮，具有抗菌消炎作用[3]；閆江紅等人利用HPLC法對(duì)千里香葉片中黃酮類成分含量進(jìn)行了測(cè)定[4]。人們對(duì)該材料進(jìn)行藥理分析的同時(shí)，對(duì)其組織培養(yǎng)方面以及分子蛋白水平的研究甚少，國(guó)內(nèi)外暫時(shí)還沒(méi)有千里香植物組織培養(yǎng)的相關(guān)文獻(xiàn)，通過(guò)本次實(shí)驗(yàn)，旨在為千里香進(jìn)一步的分子水平以及蛋白水平研究提供無(wú)菌材料，提高其實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性和成功率，同時(shí)，也為植物組織培養(yǎng)技術(shù)提供新的方法和途徑。

1材料采集

于2016年8月選擇晴朗天氣在廣西省百色市境內(nèi)進(jìn)行材料的采集，選擇生長(zhǎng)健壯、污染較少、無(wú)病害的千里香植株，采摘帶腋芽的莖段、帶小葉柄的葉軸以及幼葉作為培養(yǎng)材料。

2方法

2.1外植體處理

將采集的實(shí)驗(yàn)材料用無(wú)菌水沖洗8min。其中帶葉小柄的葉軸和帶腋芽的莖段分割成長(zhǎng)約1cm的莖段，嫩葉邊緣全部剪掉，以便愈傷組織的生長(zhǎng)，留下葉子的中心部分，約占原有葉子面積的一半以上。

2.2外植體消毒

將預(yù)處理好的外植體放入75%的酒精中，消毒8s，然后快速轉(zhuǎn)入10%的次氯酸鈉溶液消毒3min，然后用無(wú)菌水沖洗2次，再置于0.1%的氯化汞中消毒7min，之后用無(wú)菌水沖洗5次，最后將消毒后的外植體放在無(wú)菌濾紙上吸干表面水分后接種在胚芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。

2.3培養(yǎng)基配置

誘導(dǎo)芽生長(zhǎng)培養(yǎng)基

MS+6-AB2.5mg/L+NAA0.5mg/L+13g/L瓊脂+30g/L蔗糖

增殖培養(yǎng)基

（1）MS+6-AB（1.5、2.0、2.5、3.0）mg/L+NAA0.5mg/L+13g/L瓊脂+30g/L蔗糖+活性炭0.5g/L

（2）MS+6-AB2.5mg/L+NAA0.5mg/L+13g/L瓊脂+30g/L蔗糖

（3）MS+6-AB2.5mg/L+NAA0.5mg/L+13g/L瓊脂+30g/L蔗糖+活性炭0.5g/L

（4）MS+6-AB2.5mg/L+IBA0.1mg/L+13g/L瓊脂+30g/L蔗糖+活性炭0.5g/L

2.4愈傷組織培養(yǎng)

初代外植體接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為溫度為26℃，光照16h，黑暗8h，光強(qiáng)為2500lx的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期觀察和記錄外植體的生長(zhǎng)及變化。

2.5 6-BA濃度梯度試驗(yàn)

將長(zhǎng)勢(shì)一致、誘導(dǎo)良好的外植體分別轉(zhuǎn)入不同濃度的6-AB（1.5、2.0、2.5、3.0）mg/L的MS增殖培養(yǎng)基（1）中培養(yǎng)，每濃度試驗(yàn)10瓶，培養(yǎng)30d。

2.6活性炭試驗(yàn)

將誘導(dǎo)良好的外植體分別移至不含活性炭以及含有活性炭的增殖培養(yǎng)基中（2、3增殖培養(yǎng)基），進(jìn)行抑制褐化實(shí)驗(yàn)，每種培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)10瓶，培養(yǎng)15d，觀察有無(wú)活性炭對(duì)外植體褐化影響。

2.7生長(zhǎng)素種類試驗(yàn)

挑選長(zhǎng)勢(shì)好的材料放入含有一定濃度的IBA生長(zhǎng)素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)（4），每種接種10瓶，周期30d，與其他生長(zhǎng)素進(jìn)行對(duì)比。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同6-BA濃度對(duì)愈傷組織的影響

6-BA為植物組織培養(yǎng)常用的細(xì)胞分裂素，可以有效促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)行分裂，經(jīng)過(guò)查閱相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)植物在組織培養(yǎng)過(guò)程中，該生長(zhǎng)素的使用含量差異較大，例如林茜等人對(duì)四數(shù)九里香植物組織進(jìn)行培養(yǎng)過(guò)程中[5]，6-BA增長(zhǎng)濃度為1.0mg/L。王小敏等人在兩面針的組織培養(yǎng)與快速繁殖中[6]，6--BA的增長(zhǎng)濃度為2.0mg/L，因而本實(shí)驗(yàn)利用不同的濃度梯度培養(yǎng)，最終篩選出最適宜千里香生長(zhǎng)的6-BA濃度為2.5mg/L。由表1可知，當(dāng)外植處于不同濃度的6-BA培養(yǎng)基時(shí)，外植體均可長(zhǎng)出愈傷組織，而當(dāng)6-BA濃度為2.5mg/L時(shí)，培養(yǎng)基的發(fā)芽率最高，當(dāng)6-BA濃度大于或者小于該濃度時(shí)，培養(yǎng)基的發(fā)芽率均明顯下降，因而，2.5mg/L6-BA濃度為最適宜培養(yǎng)千里香的濃度。

3.2 不同生長(zhǎng)素種類對(duì)愈傷組織的影響

NAA、IBA均為植物組織培養(yǎng)常用的生長(zhǎng)素，通過(guò)實(shí)驗(yàn)對(duì)比，外植體處于不同培養(yǎng)基中發(fā)芽率略有不同，由表2可知，當(dāng)外植體處于含有生長(zhǎng)素NAA的MS培養(yǎng)基中，發(fā)芽率優(yōu)于含生長(zhǎng)素IBA的培養(yǎng)基，分析原因可能是INA促進(jìn)愈傷組織生根，尤其是不定根的生長(zhǎng)，以及外植體的生長(zhǎng)效果等方面略低于生長(zhǎng)素NAA。

x3.3 活性炭（AC）對(duì)愈傷組織褐化的影響

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在千里香組織培養(yǎng)的各個(gè)時(shí)間段均有褐化的現(xiàn)象發(fā)生，這在一定程度上影響了千里香的生長(zhǎng)，有實(shí)驗(yàn)表明，褐化的發(fā)生及褐化程度對(duì)外植體的生長(zhǎng)有一定的影響[7]，其中相對(duì)較大的材料褐化程度較輕，而較小的材料更容易發(fā)生褐化[8]。有報(bào)道稱，低濃度下的活性炭可以吸附培養(yǎng)基中的多酚氧化物及有毒物質(zhì)，所以可以有效地防止外植體的褐化[9]。通過(guò)比較有無(wú)活性炭發(fā)現(xiàn)，當(dāng)添加0.5mg/L的活性炭時(shí)，可以很好的抑制外植體褐化（圖1和圖2）。

3.4 溫度和光照對(duì)愈傷組織的影響

有研究發(fā)現(xiàn)，低溫條件可明顯降低褐化率，而高溫培養(yǎng)卻促進(jìn)褐化的發(fā)生，當(dāng)溫度較高時(shí)褐化率達(dá)52.7%[10]。但千里香適宜在溫?zé)岢睗竦沫h(huán)境中生長(zhǎng)，因而，選擇的組織培養(yǎng)溫度為26℃，外植體的褐化率較低，同時(shí)也符合千里香的生長(zhǎng)環(huán)境。

培養(yǎng)光照不適亦對(duì)外植體的生長(zhǎng)產(chǎn)生影響，趙伶俐等人研究結(jié)果表明，2000lx光強(qiáng)培養(yǎng)的外植體褐化率較嚴(yán)重，1000lx和3000lx光強(qiáng)培養(yǎng)可降低外植體的褐化率[11]，因而，本次實(shí)驗(yàn)選擇2500lx光強(qiáng)，既可以有效降低褐化率也可以促進(jìn)外植體生長(zhǎng)。

4 結(jié)語(yǔ)

現(xiàn)代植物組織培養(yǎng)較常用的生長(zhǎng)素包括6-BA、NAA、IBA，其中6-BA可促進(jìn)外植體的腋芽伸長(zhǎng)生長(zhǎng)，NAA可促進(jìn)外植體的生根，本次實(shí)驗(yàn)篩選出適宜千里香外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)的生長(zhǎng)素濃度為6-BA2.5mg/L、NAA0.5mg/L，同時(shí)，也驗(yàn)證了活性炭可有效抑制外植體發(fā)生褐化反應(yīng)，增加植物體的成活率，因而較為適宜千里香組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基為MS+6-BA2.5mg/L+NAA0.5mg/L+活性炭0.5mg/L。千里香是我國(guó)的一味中草藥材，有行氣活血、解毒消腫、散瘀止痛等功效，但人們主要研究其化學(xué)組成，至今還沒(méi)有看到相關(guān)組織培養(yǎng)的文獻(xiàn)，通過(guò)本次實(shí)驗(yàn)，篩選出千里香較為適宜的外植體生長(zhǎng)環(huán)境，將為千里香的無(wú)土栽培和進(jìn)一步的分子實(shí)驗(yàn)提供材料，也為其他植物的組織培養(yǎng)提供參考。

參考文獻(xiàn)

[1]黃成就.中國(guó)蕓香科植物資料[J].植物分類學(xué)報(bào)，1978，16（2）：85.

[2]Chakraborty DP，Roys，Chakraborty A，etal.Structure and synthesis of mexolide a new antibiotic dicoumarin from Murraya exotica synonym Murraya paniculata[J].Tetrahedron，1980，36：3563-3564.

[3]Yao Hua，Jin yongri，Shan Jing，etal.Two New Natural Methoxyflavonoids from leaves of Muray apaniculata（L）Jack.

[4] 閆江紅，馬彥冬，王曉中，等.HPLC法測(cè)定千里香葉中黃酮類成分的含量[J].藥物分析雜志，2008，28（10）：1630-1633.

[5] 林茜，高營(yíng)營(yíng)，韓曉華，等.四數(shù)九里香組織培養(yǎng)[J].亞熱帶科學(xué)，2015，44（1）：70-71.

[6]王小敏，蔣波，徐敏慧，等.兩面針的組織培養(yǎng)與快速繁殖[M].玉林師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2005，26（5）：70-73.

[7] 李鳳蘭，胡國(guó)強(qiáng)，胡寶忠.八種不同花色一串紅組織培養(yǎng)快繁的研究[J].生物技術(shù)，2005（4）：71-73.

[8] 陳菲，李黎，宮偉.植物組織培養(yǎng)的防褐化探討[J].北方園藝，2005（2）：69.

[9] 王棟，玉永雄，胡艷，等.植物組織培養(yǎng)中的褐化現(xiàn)象及其防止措施[M].生物技術(shù)，2008（1）：7-10.

[10] 劉蘭英.核桃的組織培養(yǎng)和快速繁殖[J].植物生理學(xué)通訊，2000（5）：434-435.

[11] 趙伶俐，葛紅，范崇輝，等.不同光照強(qiáng)度對(duì)蝴蝶蘭組培中外植體褐化的影響[J].北方園藝，2006（4）：160-161.

作者簡(jiǎn)介：徐紅紅（1988.03），女，黑龍江省鶴崗人，碩士，助教，從事千里香組織培養(yǎng)及遺傳轉(zhuǎn)化工作。Emall：476486500@qq.com

通訊作者：潘永玖，Emall：345090614@qq.com