王可++劉昭華++崔緒奎++楚惠民+張玉玉+韓紅

摘要：選擇位于不同染色體上、具有較高多態(tài)性的12個微衛(wèi)星標記，對濟寧青山羊群體的遺傳多樣性進行研究。結果表明，CSRD247等12個微衛(wèi)星標記共檢測到97個等位基因，每個標記都檢測到5個以上的等位基因，平均為8.08個，有效等位基因數(shù)為3.1957～6.2113個，基因頻率最高的是CSRD247 標記的235 bp 片段（0.4583）；12個微衛(wèi)星標記多態(tài)信息含量（PIC）都在 0.630以上，均為高度多態(tài)標記，遺傳多樣性豐富，其中 SRCRSP5 標記的多態(tài)信息含量（PIC）最高，為 0.828，各標記的觀測雜合度在0.4286～0.9048之間，期望雜合度在0.5981～0.8397之間，平均期望雜合度為0.7574，屬于高度雜合標記和高度雜合品種，遺傳變異大。本研究可為濟寧青山羊品種的選種、選育及保種工作奠定基礎。

關鍵詞：濟寧青山羊；微衛(wèi)星標記；多態(tài)性；遺傳多樣性

中圖分類號：S827.2文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2017）02-0142-05

濟寧青山羊（Jining grey goat）是我國著名的地方山羊品種，2006年被列為國家級畜禽遺傳資源保護品種[1]，主要分布在山東省西南地區(qū)的濟寧、菏澤等地，具有高繁多胎、肉質鮮美、青猾皮輕柔薄暖等優(yōu)良的種質特性[2]。近年來，濟寧青山羊由于受體型瘦小、生長速度緩慢等缺點的限制，與其他品種廣泛雜交，純種處于瀕危狀態(tài)[3]。

微衛(wèi)星DNA又稱簡單序列重復，廣泛存在于原核和真核生物的基因組中。微衛(wèi)星DNA 兩端的序列多是相對保守的單拷貝序列，尤其在親緣關系相近的物種間是保守的，在一些緊密相關的物種中，微衛(wèi)星DNA的重復單位和重復次數(shù)具有一定的相似性[4]，因此，可以利用微衛(wèi)星DNA作為PCR擴增的靶基因，來鑒定物種之間親緣關系的遠近。同時，在同一物種的不同基因型個體間，微衛(wèi)星DNA的重復單位數(shù)目變異大，因而其長度具有高度的多態(tài)性，包含大量豐富的信息，可以作為遺傳多樣性分析的有效手段。微衛(wèi)星DNA 標記呈共顯性孟德爾式遺傳，能夠鑒別雜合體，對隱性性狀的選擇十分有利，不受環(huán)境條件和其它因素的影響，表現(xiàn)為中性標記。與其它分子標記（如等位酶、RFLP、RAPD 等）相比，微衛(wèi)星DNA 標記可檢測出更多的等位基因，能夠提供更細致的基因變化分析范圍，具有極顯著的優(yōu)越性[5]。近年來，微衛(wèi)星DNA在山羊群體多樣性分析、群體遺傳結構分析、保種效果評價等方面得到了廣泛應用[6-9]，為山羊遺傳育種提供了重要依據(jù)。為了解濟寧青山羊群體的遺傳多樣性，本研究選擇12個微衛(wèi)星標記對濟寧青山羊群體進行檢測，統(tǒng)計分析標記的多態(tài)性、基因雜合度等，以期了解濟寧青山羊群體的雜合程度，為品種提純復壯、繁殖更新、擴大群體規(guī)模奠定基礎。

1材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗樣本采自黃河青山羊保種場（山東省梁山縣），隨機取12月齡左右濟寧青山羊耳組織，每只取5 g，置于裝有70%乙醇的滅菌離心管中，-20℃保存?zhèn)溆谩９?4個樣本，試驗羊個體間無血緣關系。

血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒、DNA Marker、PCR Mix等均購自天根生化科技（北京）有限公司。

儀器有Eppendorf PCR擴增儀、BIO-RAD凝膠成像儀及電泳系統(tǒng)、ABI 3100-Avant全自動基因序列分析儀、Eppendorf高速臺式離心機、NanoDrop 2000分光光度計、電熱恒溫水槽。

1.2基因組DNA提取

采用血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒提取羊基因組DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3引物合成與PCR反應體系

參照聯(lián)合國糧農組織（FAO）及國際遺傳學會（ISAG）的推薦，共篩選出12對熒光標記微衛(wèi)星引物（表1），由魯生生物技術有限公司合成。5′FAM為藍色熒光標記，5′HEX為綠色熒光標記，5′TAMRA為紅色熒光標記。以羊樣本基因組DNA為模板，利用各種微衛(wèi)星引物進行PCR反應。PCR反應體系為：PCR Mix 6.25 μL，10 mmol/L上下游引物各1 μL，模板DNA 1 μL，補水至12.5 μL。PCR反應條件為：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，相應溫度退火30 s，72℃延伸30 s，30個循環(huán)；最后72℃延伸5 min。反應結束后，取PCR擴增產物5 μL于1.5%的瓊脂糖凝膠中電泳，使用凝膠成像系統(tǒng)進行檢測并拍照。

1.4微衛(wèi)星DNA多態(tài)性分析

本研究的微衛(wèi)星多態(tài)性分析采用ABI3100-Avant全自動基因序列分析儀進行。

具體操作步驟：（1）分別取PCR產物、去離子甲酰胺、內標0.5、10、0.5 μL混合，95℃變性5 min，之后用ABI 3100進行分析。（2）其結果用3100 Data Collection軟件分析微衛(wèi)星基因型。其中內標為粉紅色。

1.5數(shù)據(jù)分析

所獲數(shù)據(jù)經(jīng)前期處理，用POPGEN 1.32計算等位基因數(shù)（No）、有效等位基因數(shù)（Ne）、基因頻率、觀測雜合度（Ho）、期望雜合度（He）。多態(tài)信息含量（PIC）用PIC分析軟件計算。

2結果與分析

2.1微衛(wèi)星DNA多態(tài)性分析

對12個微衛(wèi)星基因座進行PCR 擴增，將其擴增產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，結果顯示，12個微衛(wèi)星標記的PCR 擴增產物條帶均為一條或兩條，符合微衛(wèi)星標記的基本特征，可用于后續(xù)的遺傳信息分析。CSRD247檢測結果見圖1。

利用ABI 3100-Avant全自動基因序列分析儀對PCR擴增產物進行12個微衛(wèi)星位點共64個樣本的分型測定，部分結果見圖2。由圖2可知，12個微衛(wèi)星位點的電泳圖具有典型性峰形，易于判型，保證了試驗數(shù)據(jù)的可靠性。

2.2微衛(wèi)星標記的等位基因分析

微衛(wèi)星位點上的等位基因類型和等位基因頻率能夠反映群體內的變異程度。經(jīng)統(tǒng)計得知，CSRD247 等12個微衛(wèi)星標記共檢測到97個等位基因（表2），每個標記都檢測到5個以上的等位基因，說明所選擇的微衛(wèi)星標記遺傳信息比較豐富。在所有微衛(wèi)星標記中，以TCRVB6 標記檢測到的等位基因數(shù)目最多，為11個，其片段大小為 229～252 bp；INRA063檢測到的等位基因數(shù)目最少，只有5個，片段大小為170～178 bp。

在所有檢測到的等位基因中，以CSRD247標記235 bp片段的基因頻率最高，為 0.4583，其次是INRA063標記172 bp片段的基因頻率（0.4362）；而SRCRSP8標記的 248 bp片段、TGLA53標記的 151 bp片段的基因頻率最低，均為0.0104。

2.3多態(tài)信息含量與群體雜合度

多態(tài)信息含量（PIC）用來描述微衛(wèi)星標記的變異程度，可用于估計群體內的遺傳變異程度，當 PIC>0.50時為高度多態(tài)標記，0.25

由表3可知，本研究中的12個微衛(wèi)星標記均為高度多態(tài)標記， 多態(tài)信息含量在0.631～0.828之間，說明基因變異較大，濟寧青山羊群體遺傳多樣性豐富，各位點相關性狀均未受到強大選擇壓力的影響，選擇潛力較大。

有效等位基因數(shù)（Ne）反映了群體遺傳變異大小。如果有效等位基因數(shù)接近所檢測到的等位基因的絕對數(shù)，表明等位基因分布均勻。根據(jù)表2、表3中的數(shù)據(jù)，等位基因觀察數(shù)和有效等位基因數(shù)都相差較大，說明在這些基因座上，群體的等位基因分布不均勻，遺傳差異較大，這可能是由地理隔離以及人工選擇所造成。

3討論與結論

微衛(wèi)星DNA主要分布于非編碼區(qū)，與分布于編碼區(qū)的序列相比，由于選擇壓力較小而變異程度更大。微衛(wèi)星標記多態(tài)性能夠反映物種的進化歷史，群體中頻率最高的等位基因是該物種中最原始、最保守的，其余的等位基因是在進化過程中由該基因突變形成的[10]。如濟寧青山羊SRCRSP8基因座的230 bp和232 bp片段就有可能是原始基因，而236 bp和240 bp片段含量極少，極有可能是突變基因。

遺傳多樣性分析能夠反映群體內的遺傳變異情況，可以作為群體間遺傳關系的劃分依據(jù)。本研究選用了分布在不同染色體（12個微衛(wèi)星標記分別分布在 6 條染色體上）上、多態(tài)性較高的標記，以盡可能提供較多的遺傳信息，且擴增產物片段大小多在115～280 bp之間，便于獲得擴增產物和結果統(tǒng)計。12 個微衛(wèi)星標記均檢測到5個以上的等位基因，多態(tài)信息含量非常豐富，客觀地反映了濟寧青山羊的遺傳信息。本研究通過對64只濟寧青山羊個體12個微衛(wèi)星座位基因數(shù)據(jù)的多態(tài)信息含量（PIC）、觀測雜合度（Ho）、期望雜合度（He）的分析一致說明：該品種的遺傳多樣性信息豐富，提供的遺傳信息量大，反映出在品種的選育過程中，所用的親本材料來源廣泛，可能與導入了外血、選育時間短等有關。這一結果與近年來由于外來品種（波爾山羊、奶山羊、黑山羊等）引入導致濟寧青山羊群體部分遺傳資源散失、保種工作滯后致使品種處于瀕危狀態(tài)的現(xiàn)狀相吻合。

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山 東 農 業(yè) 科 學2017，49（2）：147～150Shandong Agricultural Sciences山 東 農 業(yè) 科 學第49卷第2期朱榮生，等：冷藏期間豬肌肉中肌苷酸沉積規(guī)律研究DOI：10.14083/j.issn.1001-4942.2017.02.031

收稿日期：2016-08-12

基金項目：國家自然科學基金項目（31501928）；山東省農業(yè)科學院青年基金項目（2014QNM41）；山東省科技發(fā)展計劃項目（2015GNC111011）；山東省自然基金項目（ZR2015CM007）

作者簡介：朱榮生（1976-），男，山東陽谷人，副研究員，碩士，主要研究方向：動物營養(yǎng)。E-mail：zrschevy@163.com

通訊作者：呼紅梅（1976-），女，山東冠縣人，副研究員，碩士，主要研究方向：動物營養(yǎng)。E-mail：huhongmeipatty@163.com