楊軍++薛芳++王海鳳++郭濤++金桂秀++王佳+陳峰++張士永

摘要：水稻稻瘟病是由稻瘟菌（Magnaporthe girsea）引起的一種真菌性病害，可對(duì)水稻生產(chǎn)造成巨大損失。稻瘟菌的頻繁變異易導(dǎo)致抗病品種抗性喪失，抗病育種家需每年對(duì)稻瘟菌變化情況進(jìn)行監(jiān)測(cè)。如何快速有效獲得純化菌株是監(jiān)測(cè)稻瘟菌變化的前提。結(jié)合多年實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，本文詳細(xì)介紹了稻瘟菌單孢分離技術(shù)以及分離過(guò)程中遇到的一些常見(jiàn)問(wèn)題。這些研究結(jié)果可以指導(dǎo)育種家快速有效地獲得純化稻瘟菌。

關(guān)鍵詞：稻瘟菌；單孢分離；常見(jiàn)問(wèn)題分析

中圖分類號(hào)：S435.111.4+1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2017）02-0132-04

由稻瘟菌（Magnaporthe grisea）引起的水稻稻瘟病是水稻的首要病害[1]。該病在水稻各個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期均可發(fā)生[2]，其中穗頸瘟危害最為嚴(yán)重，直接影響水稻的產(chǎn)量和質(zhì)量。由于稻瘟病菌生理小種容易發(fā)生變異，在抗病水稻品種對(duì)稻瘟病菌的選擇壓力下，會(huì)導(dǎo)致田間稻瘟病菌群的毒力基因組成發(fā)生變化，產(chǎn)生新的致病小種，從而使抗病品種在種植幾年后喪失抗病性[3，4]。這對(duì)于抗病育種而言是個(gè)很大的挑戰(zhàn)。育種家在關(guān)注水稻品種（系）其他性狀的同時(shí)，亦要對(duì)每年的稻瘟菌生理小種動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行監(jiān)測(cè)分析[5，6]，避免育成的水稻品種（系）短時(shí)間內(nèi)喪失抗瘟性。因此，如何快速有效獲得純化菌株是育種家抗病育種首先要面對(duì)的一個(gè)重要問(wèn)題。

單孢分離是分離純化稻瘟菌的常用方法，具體就是每次只取稻瘟菌的一個(gè)分生孢子，讓它萌發(fā)成菌絲體來(lái)獲得純菌株。目前常見(jiàn)的單孢分離方法主要有挑針?lè)?、毛?xì)管打孔法、眉毛挑針?lè)ǖ萚7]，但各有利弊。雖然國(guó)內(nèi)對(duì)稻瘟菌研究很多，但是對(duì)稻瘟菌單孢分離技術(shù)的詳細(xì)報(bào)道較少。本研究主要介紹利用自制簡(jiǎn)易挑針進(jìn)行稻瘟菌單孢分離的技術(shù)以及分離過(guò)程中遇到的一些問(wèn)題，以期幫助育種家快速有效地獲得純化稻瘟菌。

1材料與方法

1.1分離材料

病樣采自山東臨沂、濱州等地發(fā)生穗頸瘟的稻田。

1.2培養(yǎng)基配制

水瓊脂培養(yǎng)基（WA）：瓊脂30 g，蒸餾水1 000 mL，121℃高壓蒸汽滅菌20 min，備用。

馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基（PSA）：去皮馬鈴薯200 g，煮沸30 min，取濾液，加入蔗糖20 g，瓊脂粉20 g，加水定容至1 000 mL，121℃高壓蒸汽滅菌20 min，備用。

番茄燕麥培養(yǎng)基（TOA）：燕麥片30 g，加水煮沸約20 min，用紗布濾出燕麥汁。番茄榨汁后用紗布過(guò)濾，取汁液150 mL倒入燕麥汁液中，加入瓊脂粉20 g，定容至1 000 mL，調(diào)節(jié)pH值在7.0左右，121℃高壓蒸汽滅菌20 min，備用。

1.3病樣處理

在超凈工作臺(tái)內(nèi)將病樣切成1 cm左右小段，放在無(wú)菌水中浸泡10 min，期間用鑷子刮擦病樣表面，初步去除表面污物，之后在75%乙醇中浸泡60 s，無(wú)菌水沖洗60 s，移入有效氯含量4%的次氯酸鈉溶液中浸泡60 s， 然后無(wú)菌水沖洗3次，每次60 s。最后用無(wú)菌濾紙吸干水分，置于3% WA培養(yǎng)基平板上。28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d左右，直至病樣產(chǎn)生大量分生孢子。

1.4簡(jiǎn)易挑針的制備

將常用的不銹鋼昆蟲針（規(guī)格40 mm×0.38 mm）插入并固定于1 mL藍(lán)色槍頭前端，然后按照使用人習(xí)慣再套入3～4個(gè)藍(lán)色槍頭，用于顯微鏡下挑取分生孢子。

1.5單孢分離

將培養(yǎng)7 d左右的病樣放在超凈工作臺(tái)內(nèi)的10倍顯微鏡下觀察，找到產(chǎn)生的分生孢子。然后用制備的簡(jiǎn)易挑針挑取多個(gè)分生孢子到PSA培養(yǎng)基上，每個(gè)分生孢子之間保持一定距離。28℃培養(yǎng)12 h左右，在10倍顯微鏡下將萌發(fā)的分生孢子轉(zhuǎn)移到新的PSA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，即可獲得純化的稻瘟菌。

1.6分生孢子懸浮液的制備

參考劉任等[8]的方法制備分生孢子懸浮液。將純化的稻瘟菌接種到TOA培養(yǎng)基平板上，于28℃培養(yǎng)4～5 d。菌落直徑約5 cm時(shí)，向培養(yǎng)皿內(nèi)加入1 mL無(wú)菌水，用接種環(huán)打碎菌絲，吸取約600 μL懸浮液接種到新的TOA培養(yǎng)基平板上，涂布均勻，自然晾干培養(yǎng)基平板，于28℃黑暗培養(yǎng)36～48 h。待有一層致密的氣生菌絲長(zhǎng)出，用棉簽擦去氣生菌絲，再用自來(lái)水洗去培養(yǎng)基表面上殘留的菌絲段與分生孢子，自然晾干培養(yǎng)基，蒙上2層無(wú)菌紗布，于28℃光照培養(yǎng)36～48 h至有大量分生孢子產(chǎn)生。用0.025% （W/V） Tween 20水溶液洗下分生孢子，即制成分生孢子懸浮液。

1.7產(chǎn)孢能力觀察

取一滴分生孢子懸浮液于40倍顯微鏡下鏡檢，觀察純化菌株的產(chǎn)孢能力。

2結(jié)果與分析

2.1單孢分離

在超凈工作臺(tái)內(nèi)的顯微鏡下觀察，可以看到培養(yǎng)7 d左右的病樣產(chǎn)生的分生孢子（圖1a）。分生孢子成簇排列，呈梨形，由兩橫隔分成三個(gè)細(xì)胞（圖1b）。分生孢子萌發(fā)見(jiàn)圖1c。PSA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)5 d左右的稻瘟菌菌落直徑約為4～5 cm，菌絲生長(zhǎng)致密，菌落內(nèi)側(cè)顏色呈深灰色，外側(cè)顏色為灰白色（圖1d）。

2.2純化菌株產(chǎn)孢能力觀察

由于獲得純化菌株最終目的是為了檢測(cè)其致病性，因此需要對(duì)其產(chǎn)孢能力進(jìn)行觀察。40倍顯微鏡下鏡檢發(fā)現(xiàn)，獲得的純化菌株可以產(chǎn)生大量分生孢子（圖1e）。調(diào)節(jié)懸浮液濃度至40倍鏡下每個(gè)視野有50個(gè)左右分生孢子（2×105個(gè)/mL）即可用于后續(xù)稻瘟菌接種試驗(yàn)。

a： 病樣產(chǎn)孢情況，10倍鏡；b： 分生孢子梗及分生孢子形態(tài)，40倍鏡；

c： 分生孢子萌發(fā)，箭頭所指為菌絲，40倍鏡；d： 稻瘟菌菌落形態(tài)；e： 孢子懸浮液鏡檢，40倍鏡。

2.3單孢分離過(guò)程中的常見(jiàn)問(wèn)題

2.3.1有些孢子無(wú)法萌發(fā)或繼續(xù)生長(zhǎng)獲得純化菌株的重要一環(huán)是挑取分生孢子。筆者在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)并非所有挑取的分生孢子都能萌發(fā)，并且從病樣上挑取的已萌發(fā)分生孢子轉(zhuǎn)移到PSA培養(yǎng)基上，往往菌絲也不再繼續(xù)生長(zhǎng)。為了查明原因，40倍顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)這些不能萌發(fā)或萌發(fā)后菌絲不再繼續(xù)生長(zhǎng)的分生孢子的膈膜已經(jīng)消失，內(nèi)部的原生質(zhì)體形成了顆粒狀囊泡，最后整個(gè)分生孢子降解（圖2a、b）。

筆者分析認(rèn)為WA培養(yǎng)基屬于無(wú)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，雖然利于誘發(fā)產(chǎn)生分生孢子，但是不能提供孢子萌發(fā)或萌發(fā)后繼續(xù)生長(zhǎng)所需營(yíng)養(yǎng)，從而導(dǎo)致有些孢子無(wú)法萌發(fā)或繼續(xù)生長(zhǎng)，啟動(dòng)了細(xì)胞程序性凋亡。

經(jīng)過(guò)摸索，筆者采用震蕩法，敲擊含有病樣的培養(yǎng)皿，可促使剛成熟的分生孢子從孢子梗上脫落下來(lái)，然后將脫落的分生孢子挑取到PSA培養(yǎng)基上進(jìn)行萌發(fā)培養(yǎng)獲得純化菌落，大大提高了試驗(yàn)效率。

2.3.2菌株純化后長(zhǎng)期保存需冷凍對(duì)于分離的稻瘟菌，可在TOA培養(yǎng)基上短期保存；而長(zhǎng)期保存需要將其冷凍于-20℃冰箱內(nèi)。具體方法如下：將稻瘟菌接種于鋪滿無(wú)菌濾紙片的TOA培養(yǎng)基上，待菌絲覆蓋濾紙片后，將濾紙片放入無(wú)菌牛皮紙袋內(nèi)，無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)晾12 h左右，然后放入干燥器中1周，最后放入-20℃冰箱內(nèi)保存。待需要制備菌株接種前，取出濾紙片放置到TOA培養(yǎng)基上活化即可。-20℃冰箱內(nèi)長(zhǎng)期保存稻瘟菌時(shí)，必須確保濾紙片干燥，否則菌絲會(huì)失去活力，無(wú)法活化。為保持干燥可將牛皮紙袋與變色硅膠一起放入冰箱內(nèi)。

2.3.3常有污染菌混生在培養(yǎng)病樣時(shí)，發(fā)現(xiàn)常有一種污染菌會(huì)與稻瘟菌混合生長(zhǎng)（圖2c），在顯微鏡下觀察該菌外部形態(tài)初步確定為鏈隔孢（圖2d），利用rDNA-ITS方法獲得該菌序列后通過(guò)BLAST比對(duì)后確認(rèn)其為細(xì)極鏈格孢（Alternaria tenuissima）（數(shù)據(jù)未公開(kāi)）。細(xì)極鏈格孢可引起多種植物黑斑病[9]，但并未在水稻上有所報(bào)道。同時(shí)，該菌又是生物有益菌，對(duì)環(huán)境污染物具有較強(qiáng)的降解作用且能產(chǎn)生具有抗病增產(chǎn)功能的多種蛋白激發(fā)子[9]。對(duì)于該菌在病樣出現(xiàn)的原因，筆者推測(cè)其可能是稻瘟病菌的拮抗菌，后續(xù)將繼續(xù)研究。

a： 不能萌發(fā)的分生孢子，40倍鏡；b： 萌發(fā)后不能繼續(xù)生長(zhǎng)的分生孢子，40倍鏡；

c： 污染菌，10倍鏡；d： 污染菌孢子形態(tài)，40倍鏡。

3討論

山東地區(qū)屬于溫帶季風(fēng)性氣候，在水稻生長(zhǎng)的中后期，低溫陰雨或者多霧天氣發(fā)生頻繁，易造成稻瘟病的暴發(fā)流行。最近幾年山東稻區(qū)稻瘟病大面積發(fā)生，對(duì)水稻生產(chǎn)造成了較大損失[10]。由于水稻新品種審定中對(duì)稻瘟病抗性差的品種實(shí)行“一票否決”，如果選育的農(nóng)藝性狀優(yōu)良的品種因?yàn)榈疚敛】剐圆疃惶蕴瑫?huì)嚴(yán)重降低育種工作效率。因此掌握快速有效的稻瘟菌單孢分離技術(shù)，對(duì)區(qū)域稻瘟菌進(jìn)行監(jiān)測(cè)分析，掌握生理小種動(dòng)態(tài)變化，及時(shí)調(diào)整育種材料，對(duì)抗病育種工作很有必要。

獲取純化的稻瘟菌是及時(shí)掌握其動(dòng)態(tài)變化的前提，而利用簡(jiǎn)易挑針在顯微鏡下進(jìn)行單孢分離是最快捷有效的途徑，可消除多種稻瘟病菌混雜的可能。在試驗(yàn)中筆者發(fā)現(xiàn)WA培養(yǎng)基適合誘導(dǎo)稻瘟病菌產(chǎn)生分生孢子，但不適合分生孢子萌發(fā)，而且并非所有萌發(fā)的分生孢子都能夠繼續(xù)生長(zhǎng)。通過(guò)震蕩培養(yǎng)皿的方法可以提高獲得能萌發(fā)分生孢子的幾率。另外，在采集穗頸瘟病樣后，要于通風(fēng)處及時(shí)陰干，避免腐生菌滋生。

通過(guò)本研究筆者意在為廣大育種工作者提供稻瘟病菌單孢分離的詳細(xì)方法，并對(duì)分離過(guò)程中存在的一些問(wèn)題進(jìn)行分析，避免操作者走不必要的彎路，提高工作效率。對(duì)于試驗(yàn)中鑒定出的細(xì)極鏈隔孢，下一步將對(duì)其進(jìn)行相關(guān)拮抗試驗(yàn)，確定其是否是稻瘟病菌生物防治的潛在利用對(duì)象。

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收稿日期：2016-10-08

基金項(xiàng)目：中國(guó)氣象局預(yù)報(bào)員專項(xiàng)“渤海灣南部強(qiáng)對(duì)流天氣的多尺度特征研究”（CMAYBY2016-041）

作者簡(jiǎn)介：王曉立（1982-），女，山東濰坊人，本科，工程師，主要從事人工影響天氣工作。