黃 越,周春暉,黃惠華,*

(1.華南理工大學食品科學與工程學院,廣東廣州 510640;2.廣東太陽神集團有限公司,廣東廣州 510665)

不同提取方法猴頭菇粗多糖的表征及其抗氧化活性的比較

黃 越1,周春暉2,黃惠華1,*

(1.華南理工大學食品科學與工程學院,廣東廣州 510640;2.廣東太陽神集團有限公司,廣東廣州 510665)

為探究不同提取方法對猴頭菇粗多糖提取效果及抗氧化活性的影響。以猴頭菇子實體為原料,通過熱水、超聲、堿液提取法分別提取猴頭菇多糖,得到猴頭菇粗多糖提取物:W-HeP、U-HeP和A-HeP;研究和比較了不同提取工藝對多糖得率、理化性質(zhì)和抗氧化活性的影響。結(jié)果表明:粗多糖得率依次為A-HeP(4.66%)>U-HeP(3.92%)>W-HeP(3.29%)。紅外光譜分析表明3種粗多糖均呈現(xiàn)出典型的吡喃型葡聚糖和β-型糖苷鍵吸收;紫外光譜分析表明3種粗多糖組分中均含有蛋白質(zhì),而β-消除反應(yīng)表明3種粗多糖組分中均存在O-糖肽鍵,說明3種粗多糖中的蛋白質(zhì)為含有糖鏈和蛋白質(zhì)殘留的糖蛋白。對3種粗多糖組分的還原力和DPPH·、·OH、ABTS+·清除效果分析表明3種粗多糖均具有一定的抗氧化能力,其中A-HeP對DPPH·、·OH和ABTS+·均有較好的清除效果,其清除率分別可達到72%(5 mg/mL)、75%(5 mg/mL)和85%(0.5 mg/mL)左右。由此可見,堿液提取效果較好,堿提猴頭菇粗多糖A-HeP具有較好的清除自由基能力,可作為天然抗氧化劑開發(fā)利用。

猴頭菇,粗多糖,提取,表征,抗氧化

猴頭菇(Hericiumerinaceus)屬擔子菌綱、多孔菌目、齒菌科、猴頭屬,又名猴頭、猴頭菌、猴頭蘑、刺猬菌等,是我國傳統(tǒng)的食藥兼用菌,因其子實體形狀像猴子頭部而得名猴頭菇[1]。猴頭菇子實體中含有多糖、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、猴頭菌酮、猴頭菌堿、植物凝集素等多種化學成分,其所含的營養(yǎng)成分普遍高于目前人工栽培的其他食用菌,其中猴頭菇多糖是被研究得最多的成分之一。眾多研究表明猴頭菇多糖具有抗氧化[2]、降血脂[3]、提高免疫力[4]、抗腫瘤[5]、抗衰老[6]等生物活性,而猴頭菇多糖制成的多種藥物和保健品也為人們所青睞。

多糖是機體內(nèi)天然大分子之一,是由多個相同或不同的單糖通過糖苷鍵聚合成的高分子碳水化合物,廣泛存在于高等植物、動物、真菌等體內(nèi)。多糖具有多種生物活性,如抗氧化、抗輻射、抗凝血、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫力、抗疲勞、降血糖血脂等[7]。目前多糖的提取方法主要有熱水提取、酸堿提取、超聲提取、微波提取、酶提取、超臨界萃取、超高壓提取及兩種或多種方法聯(lián)合提取[8]。其中熱水提取法條件溫和、操作簡單,是最傳統(tǒng)的提取方法,但多糖得率較低、能耗高、提取的多糖活性較低。而堿提法有利于提高多糖得率和生物活性,適合提取酸性或含有糖醛酸的多糖,但是過高的堿液濃度會破壞多糖的結(jié)構(gòu)而影響多糖的性質(zhì)。超聲提取具有時間短、操作簡便、效率高、節(jié)能的特點,多與熱水提取聯(lián)用,是近年來研究較多的一種提取方法。

本文以猴頭菇子實體為原料,分別采用熱水提取法、超聲提取法、堿液提取法得到猴頭菇多糖,并對其得率、紅外圖譜、紫外圖譜和糖肽鍵進行分析。同時以還原能力和清除DPPH·、·OH、ABTS+·的能力為指標,比較不同提取方法對猴頭菇多糖體外抗氧化活性的影響,篩選出獲得抗氧化活性高的提取方法,以期為猴頭菇多糖的開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

猴頭菇子實體 產(chǎn)自吉林省長白山二道白河;1,1-二苯基-2-苦基肼(1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl,DPPH)、2,2′-氨基-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(2,2′-azino-bis(3-ethylbmzothiazoline-6-sulfonic acid),ABTS)、鄰二氮菲、抗壞血酸(VC) 均購自美國Sigma公司;考馬斯亮藍G-250 購自上海伯奧生物科技有限公司;葡萄糖、牛血清蛋白、苯酚、鐵氰化鉀、三氯化鐵等 均為分析純。

HK-08B型流水式中藥粉碎機 廣州市旭朗機械設(shè)備有限公司;TDL-5-A型低速臺式離心機 上海安亭科學儀器廠;UV-1800型紫外分光光度計 日本島津公司;SB-4200DT超聲波清洗機 寧波新芝生物科技股份有限公司;VECTOR33型傅立葉紅外光譜儀 德國Bruker公司;RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠;LGJ-10型冷凍干燥機 北京松源華興科技發(fā)展有限公司。

1.2 三種猴頭菇粗多糖的提取方法

原料預(yù)處理:選取新鮮的猴頭菇子實體,在50 ℃條件下烘干16 h,然后用中藥粉碎機進行粉碎,80目篩分,得猴頭菇干粉,置于-20 ℃條件下儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1 熱水提取法 稱取一定量的猴頭菇干粉,按照料液比1∶20 g/mL加入蒸餾水,于85 ℃水浴浸提5 h,將提取液于3000 r/min離心10 min,上清液50 ℃下真空濃縮至原體積的1/4,4 ℃條件下蒸餾水中透析48 h,3000 r/min離心10 min,取上清液真空濃縮至一定體積,冷凍干燥得猴頭菇水提粗多糖(Hericiumerinaceuswater-extracted polysaccharides,W-HeP),-20 ℃下儲存?zhèn)溆肹9]。

1.2.2 超聲提取法 稱取一定量的猴頭菇干粉,按照料液比1∶20 g/mL加入蒸餾水,在功率400 W下超聲35 min,超聲溫度60 ℃,將提取液于3000 r/min離心10 min,取上清液,濾渣按上述方法重復(fù)提取一次,合并上清液,50 ℃下真空濃縮至原體積的1/4,4 ℃條件下蒸餾水中透析48 h,3000 r/min離心10 min,取上清液真空濃縮至一定體積,冷凍干燥得猴頭菇超聲提取粗多糖(Hericiumerinaceusultrasonic-extracted polysaccharides,U-HeP),-20 ℃下儲存?zhèn)溆肹10]。

1.2.3 堿液提取法 稱取一定量的猴頭菇干粉,按照料液比1∶20 g/mL加入濃度為0.3 mol/L的NaOH溶液,在50 ℃條件下水浴加熱2 h,將提取液在3000 r/min離心10 min,取上清液,2.0 mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)上清液pH至中性,真空濃縮至原體積的1/4,4 ℃條件下蒸餾水中透析48 h,3000 r/min離心10 min,取上清液真空濃縮至一定體積,冷凍干燥得猴頭菇堿提粗多糖(Hericiumerinaceusalkaline-extracted polysaccharides,A-HeP),-20 ℃下儲存?zhèn)溆肹9]。

1.3 多糖及其蛋白質(zhì)含量的測定

1.3.1 多糖含量測定 采用苯酚-硫酸法[11]測定多糖含量。精密稱取105 ℃下干燥至恒重的葡萄糖10 mg,用蒸餾水溶解定容至100 mL。精密吸取葡萄糖溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL于10 mL具塞試管內(nèi),補充蒸餾水至2.0 mL處,搖勻,另取1支具塞試管加入2.0 mL蒸餾水作為對照。各試管加入6%苯酚溶液1.0 mL,搖勻,迅速加入濃硫酸5.0 mL,混合均勻,室溫放置25 min,于490 nm波長處測定吸光度。稱取10 mg猴頭菇粗多糖,蒸餾水溶解定容得1.0 mg/mL粗多糖溶液,取1.0 mL按上述方法測定,根據(jù)標準曲線計算多糖含量。猴頭菇粗多糖得率按式(1)計算[12]:

式(1)

式中:0.9為葡萄糖的換算系數(shù);c為多糖質(zhì)量濃度(g/mL);V為提取液體積(mL);m為猴頭菇干粉質(zhì)量(g)。

1.3.2 蛋白質(zhì)含量測定 采用考馬斯亮藍法[13]測定蛋白質(zhì)含量。精密稱取牛血清蛋白10 mg,蒸餾水溶解定容得0.1 mg/mL蛋白質(zhì)標準溶液,精密吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于10 mL具塞試管內(nèi),補充蒸餾水至1.0 mL處,另取1支具塞試管加入1.0 mL蒸餾水作為對照。每只試管加入5.0 mL考馬斯亮藍G-250溶液,迅速混勻,室溫下靜置2～5 min,于595 nm波長處測定吸光度。稱取10 mg猴頭菇粗多糖,蒸餾水溶解定容得1.0 mg/mL粗多糖溶液,取1.0 mL按上述方法測定,根據(jù)標準曲線計算蛋白質(zhì)含量。

1.4 粗多糖的定性表征

1.4.1 紅外光譜分析 參考Nejatzadeh等[14]的方法。采用KBr壓片法。取2 mg干燥猴頭菇粗多糖樣品,加入100 mg干燥KBr粉末在瑪瑙研缽中混合研細均勻,在壓片機中壓成薄片,用VECTOR 33傅立葉紅外光譜儀在4000～500 cm-1區(qū)間范圍內(nèi)掃描。

1.4.2 紫外光譜分析 參考Cui等[15]的方法。取10 mg干燥猴頭菇粗多糖樣品,用蒸餾水溶解配制成1.0 mg/mL的猴頭菇多糖溶液,用UV-1800型紫外分光光度計掃描其在190～400 nm波長范圍內(nèi)的吸收光譜。

1.4.3 糖肽鍵特征分析 參考Dai等[16]的方法并稍作修改。取2 mg干燥猴頭菇粗多糖樣品,溶于4 mL 0.2 mol/L的NaOH溶液中,于45 ℃水浴反應(yīng)4 h,用UV-1800型紫外分光光度計掃描其在190～400 nm波長范圍內(nèi)的吸收光譜,同時對未經(jīng)堿處理的相同濃度猴頭菇粗多糖溶液在相同條件下進行掃描。

1.5 粗多糖體外抗氧化活性測定

1.5.1 粗多糖對DPPH·清除能力測定 參考Hua等[17]的方法并稍作修改。取1.0 mL不同質(zhì)量濃度的樣品溶液,加入無水乙醇配制的0.1 mmoL/L DPPH溶液3.0 mL,振蕩混勻后于室溫避光條件下反應(yīng)30 min,517 nm波長處測定吸光度。以VC作為陽性對照,按式(2)計算DPPH·清除率:

式(2)

式中:Ax為加入1.0 mL樣品溶液和3.0 mL DPPH溶液后的吸光度;Ax0為1.0 mL樣品溶液和3.0 mL無水乙醇的吸光度;A0為1.0 mL蒸餾水和3.0 mL DPPH溶液的吸光度。

1.5.2 粗多糖還原力的測定 參考Liu等[18]的方法并稍作修改。取2.0 mL不同質(zhì)量濃度的樣品溶液,加入2.0 mL磷酸鹽緩沖液(0.2 mol/L,pH6.6)和2.0 mL 1%鐵氰化鉀溶液混合均勻,50 ℃水浴保溫20 min,加入2.0 mL 10% 三氯乙酸溶液,振蕩混勻,離心(3000 r/min,5 min),取2.0 mL上清液,與2.0 mL蒸餾水、0.4 mL 0.1% FeCl3溶液混合均勻,50 ℃水浴10 min,于700 nm波長處測定吸光度?？瞻讓φ找哉麴s水代替樣品溶液,以VC作陽性對照。

1.5.3 粗多糖對·OH清除能力測定 參考Mao等[19]的方法并稍作修改。取1.0 mL不同質(zhì)量濃度的樣品溶液與1.0 mL 0.75 mmol/L鄰二氮菲溶液、2.0 mL磷酸鹽緩沖液(0.15 mol/L,pH7.4)混合均勻,然后加入1.0 mL 0.75 mmol/L FeSO4溶液,最后加入1.0 mL 0.01% H2O2溶液混勻,37 ℃水浴60 min,于536 nm波長處測定吸光度。以VC作陽性對照,按式(3)計算·OH清除率:

式(3)

式中:A1為加入樣品及H2O2時測得的吸光度;A0為以蒸餾水代替樣品時測得的吸光度;A2為以蒸餾水代替樣品及H2O2時測得的吸光度。

1.5.4 粗多糖對ABTS+·清除能力測定 參考Li等[20]的方法并稍作修改。將等量的7 mmol/L ABTS溶液與2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液混合反應(yīng),在室溫、避光條件下靜置12～16 h以制備ABTS+·儲備液。然后將ABTS+·儲備液以磷酸鹽緩沖液(10 mmol/L,pH7.4)稀釋,使其吸光度在734 nm波長處達到0.70±0.02,得到ABTS+·測定液。取1.0 mL不同質(zhì)量濃度的樣品溶液加入2.0 mL ABTS+·測定液,室溫避光放置6 min后測定其在734 nm波長處的吸光度。以VC作為陽性對照,按式(4)計算ABTS+·清除率:

式(4)

式中:Ai為加入樣品溶液和ABTS+·測定液后的吸光度;Aj為樣品溶液與磷酸鹽緩沖液的吸光度;A0為蒸餾水與ABTS+·測定液的吸光度。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 多糖和蛋白質(zhì)標準曲線

采用苯酚-硫酸法測定的葡萄糖標準曲線方程為:Y=0.0142X+0.008,相關(guān)系數(shù)R2=0.9916,線性關(guān)系良好。其中X為溶液中葡萄糖含量(μg/mL),Y為反應(yīng)溶液在490 nm處的吸光值;采用考馬斯亮藍法測得的牛血清蛋白標準曲線方程為:Y=0.0062X+0.1348,相關(guān)系數(shù)R2=0.9914,線性關(guān)系良好。其中X為溶液中蛋白質(zhì)含量(μg/mL),Y為反應(yīng)溶液在595 nm處的吸光值。

2.2 猴頭菇粗多糖中多糖與蛋白質(zhì)含量

熱水提取、超聲提取和堿液提取得到的猴頭菇粗多糖提取物經(jīng)過冷凍干燥后均為棕黃色粉末狀,其中堿提法得到的猴頭菇粗多糖A-HeP的顏色最深,水提粗多糖W-HeP次之,超聲提取粗多糖U-HeP的顏色較淺,3種多糖均有較好的水溶性,也可溶于稀堿溶液,而A-HeP在稀酸溶液中會有較多沉淀生成。3種多糖均不溶于乙醇、乙醚、丙酮等有機溶劑。不同提取方法得到猴頭菇粗多糖中多糖的含量差別較大,其中A-HeP多糖含量最高,達到41.49%;其次為U-HeP和W-HeP,多糖含量分別為36.41%和33.49%。堿液提取法的猴頭菇多糖得率最高,達到4.66%,超聲提取和熱水提取分別為3.92%和3.29%。根據(jù)Wu等[21]的報道,某些多糖尤其是含有糖醛酸的多糖及酸性多糖,采用堿液提取會有更高的提取率。另外,與熱水提取和超聲提取相比,堿液提取得到的猴頭菇粗多糖A-HeP中含有較多蛋白質(zhì),含量達到19.27%,顯著高于W-HeP(5.87%)和U-HeP(3.62%),這主要是因為蛋白質(zhì)易溶于偏離其等電點的稀堿溶液中[22]。

2.3 紅外光譜分析

圖1為3種不同方法提取得到的猴頭菇粗多糖W-HeP、U-HeP和A-HeP的紅外光譜圖。從圖1可以看出,3種粗多糖紅外光譜圖基本相似,均含有典型的多糖特征吸收峰,說明3種粗多糖在化學結(jié)構(gòu)上類似[23]。W-HeP、U-HeP和A-HeP在3400～3450 cm-1左右均有較強吸收峰,為糖類-OH的伸縮振動吸收峰,在2800～2900 cm-1左右是由糖類中-CH3、-CH2、-CH等C-H伸縮振動引起的,這兩個峰是糖類化合物的典型特征吸收峰。其中A-HeP的吸收峰比W-HeP和U-HeP強,說明A-HeP中有較多的-CH2結(jié)構(gòu)。1650～1700 cm-1附近的吸收峰是由酰胺I帶中C=O非對稱伸縮振動引起的。1540～1570 cm-1附近的吸收峰是由酰胺II帶中C-N伸縮與N-H彎曲振動引起的,其中該處A-HeP、W-HeP的吸收顯著強于U-HeP,說明A-HeP和W-HeP含有較多的仲酰胺結(jié)構(gòu)。1080～1000 cm-1附近出現(xiàn)的強吸收峰是糖環(huán)中C-O-C伸縮振動吸收峰,是糖類的特征吸收峰,也是葡聚糖的典型吸收光譜信號,該處A-HeP、U-HeP的吸收強于W-HeP[24]。在糖類的環(huán)振動吸收區(qū)930～700 cm-1,W-HeP、U-HeP和A-HeP分別在884、879和891 cm-1處出現(xiàn)吸收峰,呈現(xiàn)了典型的吡喃型葡聚糖和β-型糖苷鍵吸收。

圖1 猴頭菇粗多糖紅外光譜圖Fig.1 IR spectrum of crude polysaccharides from Hericium erinaceus extracted by different methods

2.4 紫外光譜分析

圖2為猴頭菇粗多糖W-HeP、U-HeP和A-HeP的紫外光譜圖。從圖2可以看出,3種粗多糖紫外光譜圖基本相似,并且都在280 nm波長處有弱吸收峰,說明3種粗多糖均含有蛋白質(zhì),可能為糖蛋白,這與Cui等[15]的研究結(jié)果一致。此外,A-HeP在280 nm波長處的吸光度顯著高于W-HeP、U-HeP,說明A-HeP蛋白質(zhì)含量最高,這與前文蛋白質(zhì)含量測定結(jié)果一致。在220～250 nm范圍類,A-Hep具有較高的吸收,其中220 nm左右處的強吸收峰表明其含有α,β-不飽和酮結(jié)構(gòu)[25],這可能與A-Hep中含有較多的蛋白質(zhì)有關(guān)。

圖2 猴頭菇粗多糖紫外光譜圖Fig.2 UV spectrum of crude polysaccharides from Hericium erinaceus extracted by different methods

2.5 糖肽鍵特征分析

多糖復(fù)合物糖蛋白中糖鏈和肽鏈的連接鍵稱為糖肽鍵,可分為N-糖肽鍵和O-糖肽鍵,糖蛋白中糖肽鍵的類型可通過β-消除反應(yīng)來判斷[26],因為參與形成O-糖肽鍵的絲氨酸和蘇氛酸在堿溶液中不穩(wěn)定,在堿的作用下可分別變成α-氨基丙稀酸和α-氨基丁稀酸,這兩種不飽和氨基酸均在240 nm波長處有特征紫外吸收。而參與形成N-糖肽鍵的天冬酰胺在堿溶液中比較穩(wěn)定。由圖3可知,W-HeP、U-HeP和A-HeP在堿處理一段時間后,在240 nm波長處的紫外吸收明顯增強,證實了β-消除反應(yīng)的發(fā)生,表明W-HeP、U-HeP和A-HeP中均含有O-糖肽鍵,也證明了W-HeP、U-HeP和A-HeP中糖蛋白的存在,這與3種粗多糖的紫外掃描圖譜在280 nm波長處有吸收峰的結(jié)果一致。

圖3 β-消除反應(yīng)前后W-HeP(a)、U-HeP(b)和A-HeP(c)的紫外光譜圖Fig.3 UV spectrum of W-HeP(a)、U-HeP(b) and A-HeP(c)before and after β-elimination reaction

2.6 猴頭菇粗多糖的體外抗氧化活性

2.6.1 三種粗多糖的DPPH·清除能力比較 DPPH·是一種有機氮自由基,在517 nm波長處有最大吸收峰,當DPPH·與抗氧化劑反應(yīng)后,會隨著還原而逐漸褪色,在517 nm波長處的吸光度降低[27],此法穩(wěn)定性好、靈敏度高、操作簡單,是評價體外抗氧化活性的常用方法。由圖4可知,粗多糖濃度在1～5 mg/mL范圍內(nèi),W-HeP、U-HeP和A-HeP對DPPH·的清除率隨著多糖濃度的升高逐漸增大,呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性,3種粗多糖對DPPH·的清除效果依次為A-HeP>U-HeP>W-HeP,但是均低于VC對DPPH·的清除效果。當粗多糖濃度為5 mg/mL時,A-HeP、U-HeP和W-HeP對DPPH·的清除率分別為71.67%、55.12%和47.91%。這可能是因為超聲、堿液處理提取降解了猴頭菇大分子多糖,使其溶解度增加,更多活性基團暴露,容易捕獲DPPH·。這與焦中高等[28]對紅棗堿提和水提多糖對DPPH·清除能力的研究結(jié)果一致。Hua等[17]對山桃草果實多糖清除DPPH·的能力進行研究,當質(zhì)量濃度為5 mg/mL 時,其清除率約為30%。劉楊等[29]通過超聲輔助堿提法得到的雨聲紅球藻多糖,在濃度為5 mg/mL時對DPPH·的清除率為62.78%。以上說明猴頭菇粗多糖具有良好的DPPH·清除活性,尤其是堿提猴頭菇粗多糖A-HeP。

圖4 猴頭菇粗多糖對DPPH·的清除效果Fig.4 Scavenging effect of crude polysaccharides from Hericium erinaceus extracted by different methods on DPPH·

2.6.2 三種粗多糖的還原力比較 還原能力是反映物質(zhì)抗氧化活性的一個重要指標,還原力與抗氧化活性呈正相關(guān),還原能力越大,抗氧化活性越高[30]。多糖的還原能力主要是通過多糖存在時Fe3+→Fe2+的轉(zhuǎn)化所測定的。Fe3+獲得多糖所提供的電子而被還原為Fe2+,使得反應(yīng)體系的顏色發(fā)生改變,在700 nm波長處的吸收增強,最終測定的700 nm波長處吸光值越大,還原力越強。由圖5可知,粗多糖濃度在1～5 mg/mL范圍內(nèi),W-HeP、U-HeP和A-HeP的還原力隨著粗多糖濃度的升高快速增強,呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性,其還原能力依次為A-HeP>U-HeP>W-HeP,堿提效果最佳。這與楊揚等[31]對小刺猴頭菌絲體多糖的的還原能力研究結(jié)果一致。當粗多糖濃度為5 mg/mL時,A-HeP、U-HeP和W-HeP在700 nm波長處的吸光度分別為1.48、1.29和1.21,但與VC相比較弱。Kozarski等[32]對靈芝多糖的還原能力進行研究,當濃度為5 mg/mL時,其在700 nm波長處的吸光度的僅為0.23;Zhang等[33]對金針菇多糖的還原能力進行研究,當濃度為5 mg/mL時,其在700 nm波長處的吸光度低于0.2。綜合分析說明猴頭菇粗多糖具有良好的還原能力,尤其是堿提猴頭菇粗多糖A-HeP。

圖5 猴頭菇粗多糖的還原能力Fig.5 Reducing power of crude polysaccharides from Hericium erinaceus extracted by different methods

2.6.3 三種粗多糖的·OH清除能力比較 ·OH是已知活性最強、毒性最大的自由基,它可以與活細胞中任何分子發(fā)生反應(yīng)造成損害,且反應(yīng)速度極快,被破壞的分子遍及糖類、氨基酸、磷脂、核苷和有機酸等[29]。本實驗采用鄰二氮菲-金屬鐵離子-H2O2體系,通過Fenton反應(yīng)生成·OH,鄰二氮菲與Fe2+反應(yīng)生成Fe2+-鄰二氮菲配合物,該配合物在536 nm波長處有最大吸收。而當·OH氧化Fe2+-鄰二氮菲生成Fe3+-鄰二氮菲時,536 nm波長處最大吸收消失或減弱,而抗氧化物質(zhì)可抑制此氧化過程,降低536 nm波長處的吸光度減弱程度[34]。如圖6所示,粗多糖濃度在1～5 mg/mL范圍內(nèi),W-HeP、U-HeP和A-HeP對·OH的清除效果與粗多糖濃度正相關(guān),3種粗多糖對·OH的清除能力依次為A-HeP>U-HeP>W-HeP,但均低于VC。當粗多糖濃度為5 mg/mL時,A-HeP、U-HeP和W-HeP對·OH的清除率分別為75.33%、58.55%和54.30%,A-HeP效果最佳。Wu等[21]用堿提法得到的菌核側(cè)耳多糖對·OH的清除率為水提得到多糖的1.2倍;劉楊等[29]研究了雨聲紅球藻堿提和水提多糖對·OH的清除效果,在5 mg/mL時的清除率分別為6.85%和5.75%,堿提效果稍好但均顯著低于猴頭菇多糖;Liu等[18]研究了金錢菇多糖對·OH清除效果,質(zhì)量濃度為5 mg/mL時對·OH的清除率僅為24.30%。綜合以上分析表明猴頭菇粗多糖相較其它多糖有更好的·OH清除能力,其中堿提粗多糖A-HeP效果最佳。

圖6 猴頭菇粗多糖對·OH的清除效果Fig.6 Scavenging effect of crude polysaccharides from Hericium erinaceus extracted by different methods on ·OH

2.6.4 三種粗多糖的ABTS+·清除能力比較 ABTS+·是一種穩(wěn)定的有機自由基,通過ABTS原液與過硫酸鉀在室溫黑暗中反應(yīng)12～16 h產(chǎn)生,在抗氧化劑存在的情況下,ABTS+·將會減少。通過測定反應(yīng)液在734 nm波長處吸光度變化,可得到樣品對ABTS+·的清除效果[35]。如圖7所示,當粗多糖濃度在0.1～0.4 mg/mL范圍內(nèi),W-HeP、U-HeP和A-HeP對ABTS+·的清除能力隨質(zhì)量濃度的升高而增大,呈現(xiàn)良好的劑量效應(yīng),A-HeP的清除效果最佳,繼續(xù)增加粗多糖濃度,清除率增加較緩慢,A-HeP和U-HeP基本保持平衡。當濃度為0.5 mg/mL時,3種粗多糖對ABTS+·的清除效果差異較小,均達到85%以上,但是低于VC對ABTS+·的清除效果。Li等[20]對3種夏枯草多糖(PV-P1、PV-P2和PV-P3)的ABTS+·清除效果進行研究,濃度為0.5 mg/mL時對ABTS+·的清除率分別為6.2%、16.6%和12.8%;Liu等[18]對金錢菇多糖的ABTS+·清除效果進行研究,濃度為5 mg/mL時對ABTS+·的清除率為63.96%,顯著低于猴頭菇粗多糖。綜合以上表明猴頭菇粗多糖具有良好的ABTS+·清除活性,可作為良好的ABTS+·清除劑。

圖7 猴頭菇粗多糖對ABTS+·的清除效果Fig.7 Scavenging effect of crude polysaccharides from Hericium erinaceus extracted by different methods on ABTS+·

3 結(jié)論

熱水、超聲、堿液三種提取法所得猴頭菇粗多糖W-HeP、U-HeP和A-HeP的得率依次為3.29%、3.92%和4.66%,堿液提取得率最高。3種粗多糖的紅外光譜圖相似,均含有典型的多糖特征吸收峰并呈現(xiàn)吡喃型葡聚糖和β-型糖苷鍵吸收。紫外光譜圖顯示3種粗多糖均在280 nm處有弱吸收峰,說明3種粗多糖提取物中均含有蛋白質(zhì)。而糖肽鍵特征分析表明3種粗多糖中均存在O-糖肽鍵,說明3種粗多糖中存在的蛋白質(zhì)可能為糖蛋白。3種粗多糖的體外抗氧化活性大小依次為A-HeP>U-HeP>W-HeP,說明堿液提取有利于得到較高生物活性的猴頭菇粗多糖提取物。A-HeP對DPPH·、·OH和ABTS+·均有較好的清除效果,清除率分別可達到72%(5 mg/mL)、75%(5 mg/mL)和85%(0.5 mg/mL)左右,可作為一種良好的生物活性物質(zhì)被開發(fā)利用。

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Characterization and antioxidant activity analysis on the crudeHericiumerinaceuspolysaccharides extracted by different methods

HUANG Yue1,ZHOU Chun-hui2,HUANG Hui-hua1,*

(1.School of Food Science and Engineering,South China University of Technology,Guangzhou 510640,China;2.Guangdong Apollo Croup. Co.,Ltd,Guangzhou 510665,China)

To investigate the effects of various extraction methods on the crude polysaccharides fromHericiumerinaceusand their antioxidant activities,three different methods,including hot water extraction,ultrasonic extraction and alkali extraction,were applied to extract polysaccharides from the fruiting body ofHericiumerinaceusand three crude polysaccharides(W-HeP,U-HeP and A-HeP,respectively) were obtained. The yield,physicochemical characteristics and antioxidant activity of the three crude polysaccharides were investigated and compared. The results showed that 4.66% of the yield was obtained for A-HeP,while only 3.92% for U-HeP and 3.29% for W-HeP. IR spectrum analysis indicated that the three polysaccharides had typical absorption for pyran glucan andβ-glycosidic bond. UV spectrum andβ-elimination reaction further demonstrated the existence of protein and O-glycopeptide bond in these three polysaccharides,implying the existence of glycoprotein in these crude polysaccarides. Based on the analysis of the reducing power,scavenging abilities of DPPH,hydroxyl and ABTS+radicals,all of the three polysaccharides showed certain antioxidant activity,especially A-Hep,which exhibited about 72%(5 mg/mL) of scavenging effect for DPPH·,75%(5 mg/mL) for ·OH and 85%(0.5 mg/mL) for ABTS+·.These results indicated that the alkali extraction method possessed better extraction effect. Meanwhile,A-HeP had excellent scavenging radicals ability,showing the potential to be a type of natural antioxidant.

Hericiumerinaceus;crude polysaccharide;extraction;characterization;antioxidant activity

2016-08-01

黃越(1994-)，女，碩士研究生，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品深加工，E-mail:huangyuecn@163.com。

*通訊作者:黃惠華(1959-)，男，博士，教授，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏，E-mail:fehhuang@scut.edu.cn。

廣東省科技計劃項目(2013B090600008)；華南理工大學百步梯攀登計劃資助項目(DC30716034)。

TS201.1

A

:1002-0306(2017)03-0080-07

10.13386/j.issn1002-0306.2017.03.007