王風青,梁金鐘,畢明月,肖 瑋

(哈爾濱商業(yè)大學食品工程學院,黑龍江省高等學校食品科學與工程重點實驗室,黑龍江哈爾濱 150076)

王風青,梁金鐘*,畢明月,肖 瑋

(哈爾濱商業(yè)大學食品工程學院,黑龍江省高等學校食品科學與工程重點實驗室,黑龍江哈爾濱 150076)

γ-聚谷氨酸(γ-poly glutamic acid,γ-PGA)特殊的分子結(jié)構(gòu),使其具有很好的乳化、增稠、抗凍等特性,可作為添加劑廣泛應用于食品當中。實驗以枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis115基因組為模板,通過PCR技術(shù)成功克隆到γ-PGA合成酶系基因pgsBCA,并進行測序,利用ExPASy-ProtParam tool、Server 3.0 SignalP,TMHMM Server和Tmpred,PSORTB,PredictProtein,Swiss-Model Workspace軟件,分別對蛋白質(zhì)的生物信息進行了分析和預測,針對γ-PGA合成關(guān)鍵酶基因pgsB構(gòu)建了表達體系,結(jié)果表明:pgsB,pgsC和pgsA基因分別含1182、450和1143個核苷酸,分別編碼393、149和380個氨基酸,其對應蛋白均不存在信號肽,屬于非分泌型蛋白;PgsB、PgsC和PgsA分子量分別為44016.7、16302.9、42759.8 Da;PgsB為親水性不穩(wěn)定的酸性蛋白質(zhì),二級結(jié)構(gòu)以α-螺旋為主;PgsC 是疏水堿性的膜結(jié)合蛋白,存在4個強跨膜區(qū);PgsA為親水穩(wěn)定的堿性蛋白,在N端存在1個強跨膜區(qū)域。經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測,pgsB基因被成功表達,目的蛋白相對分子質(zhì)量約為45 kDa,與預測值基本相符。

Bacillussubtilis115,γ-PGA,pgsBCA基因克隆,生物信息分析,誘導表達

γ-聚谷氨酸(γ-poly glutamic acid,γ-PGA)是一種生物安全的親水性大分子聚合物,具有乳化、增稠、成膜、保濕、絮凝、黏合、無毒等性能,可廣泛應用于日用品[1]、環(huán)境治理[2-3]、生物醫(yī)學[4-6]等領(lǐng)域,有很好的商業(yè)價值[7]。在食品方面,它最早發(fā)現(xiàn)于日本發(fā)酵食品納豆中,具有食品安全性,可作為凍干保護劑用于益生菌粉或發(fā)酵劑的制備[8-10],油炸面食中的油脂抑制因子[11],礦物吸附劑[12-13],增稠劑[14],苦味掩蓋劑等。

γ-PGA是一種由微生物合成的高分子聚合物,由D-Glu和L-Glu以γ-羧基與α-氨基以酰胺鍵的形式縮合而成[15-16],其可能的合成機理如下[17]:階段(A),磷酸化,將ATP的磷酸基轉(zhuǎn)移至聚合物鏈上的C末端羧基,生成 ADP;階段(B),通過攻擊磷酸化羧基的D-或L-谷氨酸上的氨基形成一個酰胺鍵;階段(C),通過階段(A)和階段(B)聚合后,輸出DL-PGA。原則上說,PGA在各個階段,均不是以共價鍵與膜相關(guān)酶結(jié)合。而目前的研究認為DL-PGA合成酶是一個膜相關(guān)的蛋白復合物(viz.,PgsBCA),含有典型Rossmann型的酰胺鍵合成酶成分PgsB[18-20]。

本實驗對枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis115的γ-PGA合成酶基因簇pgsBCA進行了克隆,并利用相關(guān)軟件對其生物信息進行了分析,以期初步了解相關(guān)基因的功能,同時對酰胺鍵形成的關(guān)鍵酶基因pgsB進行了原核異源表達,為開發(fā)新的酶制劑及胞外高效合成相關(guān)聚合物提供參考及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Bacillussubtilis115 哈爾濱商業(yè)大學發(fā)酵工程實驗室分離并保藏;克隆載體pMD18-T 大連寶生物工程有限公司;Taq@HiFi DNA聚合酶、T4 DNA連接酶 北京全式金生物技術(shù)有限公司;限制性內(nèi)切酶BamHI和HindШ 美國NEB公司;質(zhì)粒小提試劑盒、細菌基因組DNA抽提試劑盒、普通DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒 北京天根生化科技有限公司;其他試劑 均為國產(chǎn)分析純。

基因擴增儀T100TM美國BIO-RAD公司;高速離心機H1650-W 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司;凝膠成像系統(tǒng)BIO-BEST135A 美國SIM公司;核酸及蛋白電泳儀 北京六一儀器廠;超聲破碎儀LDZX 50KB 上海申安醫(yī)療器械廠;制冰機LRH-70F 上海一恒科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1B.subtilis115基因組DNA的提取 用Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒提取B.subtilis115基因組。采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳,121 V電壓電泳20 min,凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳情況,基因組DNA保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 設(shè)計并合成引物 根據(jù)NCBI中B.subtilis168的pgsBCA基因序列,使用NTI 10.0軟件進行引物的設(shè)計,并在正反引物5′端分別引入BamH I和Hind Ⅲ限制性內(nèi)切酶酶切位點(下劃線部分),提交至蘇州金唯智生物科技有限公司合成兩對特異性引物,如表1所示。

表1 引物的設(shè)計Table 1 Primer design

1.2.3 基因PCR擴增 利用合成的pgsB-F/R和pgsBCA-F/R引物,以實驗菌株B.subtilis115基因組DNA為模板,采用50 μL反應體系對pgsB和pgsBCA基因片段進行擴增,條件為:94 ℃,5 min;94 ℃,30 s,55 ℃,30 s,72 ℃,60 s(擴增pgsBCA全長為180 s),30個循環(huán);72 ℃延伸10 min。

1.2.4 目的片段的克隆與序列測定分析 純化后的pgsB和pgsBCA基因片段,與pMD18-T載體連接,轉(zhuǎn)化克隆感受態(tài)細胞JM109,藍白斑篩選出陽性克隆,并通過菌落PCR驗證。將鑒定為陽性克隆的菌液及特異性引物送至蘇州金唯智生物科技有限公司,PCR擴增、純化后進行測序。測序結(jié)果采用PC機本地安裝的Vector NTI 10.0及Blast進行多序列比對及同源性分析;基于氨基酸序列的蛋白質(zhì)理化性質(zhì)、信號肽、跨膜區(qū)域和亞細胞定位分別用Prot-Param、SignaIP 3.0 Server、TMHMM Server和Tmpred及PSORTB軟件進行分析和預測;目的蛋白的二級結(jié)構(gòu)及三級結(jié)構(gòu)的建模分別用SOPMA和SWISSS MODEL軟件進行預測和實現(xiàn)。

1.2.5 重組表達載體的構(gòu)建及誘導表達 分別用限制性內(nèi)切酶BamH I和Hind Ⅲ對重組質(zhì)粒pMD18-pgsB和質(zhì)粒pET22b(+)進行雙酶切,在121 V的電壓下,用1%瓊脂糖凝膠電泳20 min,切膠后用膠回收試劑盒回收目的片段;用T4連接酶將酶切處理后目的基因片段和質(zhì)粒pET22b(+)片段進行連接,產(chǎn)物轉(zhuǎn)入E.coliBL21(DE3),用含有氨芐青霉素(50 μg/mL)的LB培養(yǎng)基進行陽性重組子的篩選及驗證;添加IPTG溶液至終濃度為1 mmol/L,對陽性表達重組子進行誘導表達。

1.2.6 SDS-PAGE電泳 將誘導表達及作為對照的菌液,12000 r/min離心10 min,棄上清,沉淀加入20 μL PBS溶液和5 μL 5×Loading Buffer,吹打混勻,沸水中煮10 min,之后12000 r/min離心5 min,取20 μL上清液進行電泳(濃縮膠濃度為5%,分離膠濃度為12%),考馬斯亮藍染色液染色15 min,多次更換脫色液至蛋白條帶清晰可見。

2 結(jié)果與討論

2.1 pgsBCA基因的PCR擴增

以B.subtilis115基因組DNA為模板,用合成的兩對pgsB-F/R和pgsBCA-F/R特異性引物分別對基因片段pgsBCA和pgsB進行擴增,產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖1所示,pgsB基因約1200 bp,pgsBCA基因約2800 bp,與預期結(jié)果相符。

圖1 pgsB和pgsBCA基因PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.1 PCR amplification of pgsB and pgsBCAgenes from B. subtilis 115

2.2 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化及菌落PCR驗證

將pgsB和pgsBCA基因片段電泳膠回收純化后,分別連接至pMD18-T載體,轉(zhuǎn)化至克隆感受態(tài)宿主細胞JM109中,涂布培養(yǎng)過夜,隨機挑選幾個陽性克隆子,用特異性引物進行菌落PCR驗證,結(jié)果如圖2所示,菌落PCR產(chǎn)物大小與預期一致。

圖2 重組質(zhì)粒pMD18T-pgsB/pgsBCA菌落PCR驗證Fig.2 Colony PCR profile of recombinant plasmid pMD18T-pgsB/pgsBCA

2.3 γ-PGA合成酶pgsBCA基因的序列測定

陽性克隆測序結(jié)果如圖3所示:

圖3 pgsBCA基因序列Fig.3 The nucleotide sequence of pgsB,pgsC and pgsA gene

分析其序列表明:pgsB基因含1182個核苷酸,編碼393個氨基酸,與GenBank中Bacillussubtilissubsp. natto strain CGMCC 2108(CP014471.1)、Bacillussubtilissubsp. spizizenii TU-B-10(CP002905.1)和Bacillussubtilissubsp. globigii strain ATCC 49760(CP014840.1)等枯草芽孢桿菌的pgsB基因核苷酸同源性分別為 99%、97%和87%;與BacillusatrophaeusUCMB-5137(CP011802.1)、Bacillusamyloliquefaciensstrain S499(CP014700.1)、Bacillusmethylotrophicusstrain YJ11-1-4(CP011347.1)和Bacillusvelezensisstrain CBMB205(CP014838.1)pgsB基因核苷酸同源性分別為86%、83%、82%和82%。

pgsC基因含450個核苷酸,編碼149個氨基酸,測定序列與GenBank中Bacillussubtilissubsp. natto strain CGMCC 2108(CP014471.1)、Bacillussubtilissubsp. subtilis str. 168(CP010052.1)和Bacillussubtilissubsp. spizizenii TU-B-10(CP002905.1)的核苷酸同源性分別為100%、99% 和98%;與Bacillusatrophaeus1942(CP002207.1)、BacillusamyloliquefaciensCC178(CP006845.1)、Bacillusvelezensisstrain CBMB205(CP014838.1)和Bacilluspumilusstrain ku-bf1(CP014165.1)的核苷酸同源性分別為88%、84%、84%和80%。

pgsA基因含1143個核苷酸,編碼380個氨基酸,測定序列與GenBank中Bacillussubtilissubsp. natto strain CGMCC 2108(CP014471.1)、Bacillussubtilisstrain UD1022(CP011534.1)、Bacillussubtilissubsp. spizizenii TU-B-10(CP002905.1)和Bacillussubtilisstrain T30(CP011051.1)的核苷酸同源性分別為100%、99%、95%和90%。

2.4 γ-PGA合成酶系理化性質(zhì)分析

基于蛋白的氨基酸序列,使用ProtParam軟件對γ-PGA合成酶系PgsB、PgsC和PgsA蛋白的分子式、相對分子質(zhì)量、等電點以及不穩(wěn)定性等進行分析,結(jié)果如表2所示。

表2 γ-PGA合成酶系理化性質(zhì)分析Table 2 Analysis of physicochemical properties on γ-PGA synthetic enzymes proteins

PgsB等電點為5.31,是酸性蛋白質(zhì),所帶負電荷氨基酸(Arg+Lys)殘基數(shù)則多于所帶正電荷氨基酸(Asp+Glu)殘基數(shù),分別為57和45;而PgsC和PgsA等電點分別為8.89和9.43,均是堿性蛋白質(zhì),則所帶正電荷氨基酸(Arg+Lys)殘基數(shù)均多于所帶負電荷氨基酸(Asp+Glu)殘基數(shù),分別為9和5,52和47。分析結(jié)果顯示PgsC和PgsA蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)小于40,均屬于穩(wěn)定蛋白,而PgsB蛋白不穩(wěn)定系數(shù)大于40,屬于不穩(wěn)定蛋白。PgsB和PgsA蛋白的親水性平均系數(shù)均小于0,則均為親水性蛋白;PgsC蛋白的親水性平均系數(shù)均大于0,為疏水性蛋白。

2.5 γ-PGA合成酶系PgsBCA蛋白結(jié)構(gòu)與功能的預測分析

2.5.1 信號肽及跨膜結(jié)構(gòu)的分析 使用SignaIP 3.0 Server軟件預測PgsB、PgsC和PgsA均不存在信號肽,屬于非分泌性蛋白。

用TMHMM Server和Tmpred工具預測PgsB、PgsC和PgsA的跨膜結(jié)構(gòu)域,結(jié)果如圖4所示:PgsB在N端有一個可信度比較低的跨膜區(qū),位于1-17(17);PgsA在N端有一個跨膜區(qū),位于25-44(20);PgsC在N端有四個跨膜區(qū),分別位于7～29(23),44～66(23),78～100(23),126～148(23)。

2.5.2 蛋白的亞細胞定位分析 PgsB、PgsC和PgsA蛋白的亞細胞的定位于細胞質(zhì)、細胞膜以及細胞壁上的可能性,采用PSORTB軟件對進行分析,結(jié)果見表3。

表3 γ-PGA合成酶系亞細胞定位分析Table 3 Subcellular location ofγ-PGA synthetic enzymes proteins

由表3可知:推測PgsB、PgsC和PgsA蛋白均定位于細胞質(zhì)膜上可能性較大,其中PgsC位于細胞膜上的可能性最高,為100%;PgsB位于細胞膜的可能性為87.8%,低于PgsA(95.1%),這與TMHMM Server和Tmpred工具預測的跨膜結(jié)構(gòu)結(jié)果具有一致性。

2.6 γ-PGA合成酶蛋白二級結(jié)構(gòu)預測與分析

蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)是指在形成立體結(jié)構(gòu)時,其多肽鏈或多核苷酸鏈間,主要由分子內(nèi)氫鍵所維系的α螺旋(α-helix)、β折疊(β-sheet)、無規(guī)則卷曲(coil)及模體(motif)等組件,了解蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)有助于了解蛋白的空間構(gòu)象,并進一步了解蛋白的功能。

用SOPMA軟件,對微生物發(fā)酵合成γ-PGA的酶系的二級結(jié)構(gòu)進行預測,結(jié)果表明:PgsB蛋白是由172個43.77% Hh(α-螺旋),73個18.58% Ee(β折疊),34個8.65%Tt(β轉(zhuǎn)角)和114個29.01%Cc(無規(guī)則卷曲)組成;PgsC蛋白是由61個40.94% Hh(α-螺旋),40個26.85% Ee(β折疊),26個17.45%Tt(β轉(zhuǎn)角)和22個14.77%Cc(無規(guī)則卷曲)組成;PgsA蛋白是由119個31.32%Hh(α-螺旋),98個25.79% Ee(β-折疊),39個10.26% Tt(β轉(zhuǎn)角)和124個32.63%Cc(無規(guī)則卷曲)組成。

2.7 γ-PGA合成酶蛋白三維結(jié)構(gòu)建模

蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)指多肽鏈在二級結(jié)構(gòu)或者超二級結(jié)構(gòu)甚至結(jié)構(gòu)域的基礎(chǔ)上,靠氨基酸側(cè)鏈之間的疏水相互作用,氫鍵,范德華力和靜電作用維持特定空間結(jié)構(gòu),它與其功能息息相關(guān)。將蛋白質(zhì)的氨基酸序列提交至SWISS-MODEL[21-23],進行分析,結(jié)果如圖5所示。

圖5 SWISS-MODEL 預測蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)圖Fig.5 The three dimensional structure modeling of protein were prediction by SWISS-MODEL

圖4 γ-PGA合成酶系蛋白跨膜結(jié)構(gòu)分析Fig.4 Analysis of transmembrane helices on γ-PGA synthetic enzymes proteins

由圖5可得,PgsB空間結(jié)構(gòu)的預測基于PDB:1e8c.1.A為模板,序列相似度為17.33%,模型質(zhì)量參數(shù)Z值為0.49;PgsC空間結(jié)構(gòu)的預測基于PDB:3txt.1.A為模板,序列相似度為11.76%,模型質(zhì)量參數(shù)Z值為0.16;PgsA空間結(jié)構(gòu)的預測基于PDB:3ive.1.A為模板,序列相似度為23.08%,模型質(zhì)量參數(shù)Z值為0.34。

2.8 pgsB基因原核表達載體的構(gòu)建及重組子的篩選

用T4 DNA連接酶將雙酶切處理后的目的基因片段和表達載體pET22b進行連接,轉(zhuǎn)入表達宿主菌感受態(tài)細胞E.coliBL21,涂布于含氨芐青霉素的LB平板37 ℃培養(yǎng)過夜,隨機挑取幾個菌落,用特異性引物進行菌落PCR,結(jié)果如圖6所示,菌落PCR幾乎均擴增出一段1200 bp左右的片段,證明所挑克隆均為陽性轉(zhuǎn)化子。

圖6 重組子鑒定結(jié)果Fig.6 Identification of constructed plasmid

2.9 PgsB融合蛋白的原核表達

挑取已鑒定為陽性的克隆子轉(zhuǎn)接至含氨芐青霉素LB液體培養(yǎng)基中,用終濃度為1 mmol/L的IPTG進行誘導表達。分別將未誘導和誘導一定時間的菌體總蛋白進行SDS-PAGE蛋白電泳,結(jié)果見圖7。

圖7 表達產(chǎn)物SDS-PAGE分析Fig.7 SDS-PAGE profile of expressed products

重組子E.coliBL21(pET22b-pgsB)經(jīng)IPTG誘導后,與對照0 h相比較,1、2、3 h在約45 Da處均有明顯條帶,與理論值相符,表明pgsB基因被成功表達,且表達量隨時間的延長有所增加。

3 結(jié)論

實驗以B.subtilis115基因組為模板,成功克隆到B.subtilis115發(fā)酵合成γ-PGA過程中產(chǎn)物合成酶系基因pgsBCA,測序可知pgsB、pgsC、pgsA基因的開放閱讀框大小分別為1182、450、1143 bp,分別編碼 393個、149個、380個氨基酸。

以相應氨基酸序列為研究對象,借助特定軟件對相應蛋白進行生物信息分析。分析結(jié)果顯示:PgsB蛋白分子量約為44016.7 Da,為親水性不穩(wěn)定的酸性蛋白質(zhì),二級結(jié)構(gòu)以占43.77%的α-螺旋(Hh)為主;PgsC蛋白分子量約為16302.9 Da,蛋白保守性很高,其含有4個強跨膜區(qū)域,是疏水堿性的膜結(jié)合蛋白,二級結(jié)構(gòu)以占40.94%的α-螺旋(Hh);PgsA蛋白分子量約為42759.8 Da,為親水穩(wěn)定的堿性蛋白,在N端存在1個強跨膜區(qū)域,二級結(jié)構(gòu)以占31.32%的α-螺旋(Hh)和32.63%的β-折疊(Ee)為主。

微生物合成γ-PGA中負責γ-酰胺鍵形成的pgsB基因,構(gòu)建了表達載體pET22b-pgsB,轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3),在IPTG的誘導下成功得以表達,相對分子質(zhì)量約為45 kDa。

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Cloning and expression of a novel food additiveγ-PGA synthase gene

WANG Feng-qing,LIANG Jin-zhong*,BI Ming-yue,XIAO Wei

(Key Laboratory of Food Science and Engineering,College of Heilongjiang Province,College of Food Engineering,Harbin University of Commerce,Harbin 150076,China)

With special molecular structure,γ-poly glutamic acid(γ-PGA)has many characteristics,such as emulsification,thickening,antifreeze and so on. As an additive,γ-PGA can be widely used in food. The gene ofpgsBCA were cloned fromBacillussubtilis115 genome DNA by PCR. Biological information of PgsBCA were analyzed using the online software(ExPASy-ProtParam tool,Server 3.0 SignalP,TMHMM Server and Tmpred,PSORTB,PredictProtein,Swiss-Model Workspace)based on the amino acid sequence. As the key enzyme gene ofγ-PGA synthesis,expression system ofpgsB was constructed. The results showed that thepgsB,pgsC andpgsA genes contained 1182,450,1143 nucleotides and code 393,149,380 amino acids,respectively. PgsB,PgsC and PgsA did not exist signal peptide,belonged to the non secretory protein. The molecular weight of PgsB,PgsC and PgsA were 44016.7,16302.9 and 42759.8 Da,respectively. PgsB was hydrophilic,unstable acidic protein,its secondary structure was mainly alpha helical，PgsC protein containing four transmembrane domain,was highly conservative and hydrophobic alkaline membrane binding protein,PgsA was stable hydrophilic basic protein,which contained one transmembrane region in the N terminal. By SDS-PAGE test,the pgsB gene was expressed successfully and its relative molecular mass was about 45 kDa,was consistent with theoretical value.

Bacillussubtilis115;γ-PGA;pgsBCA genes cloning;biological information analysis;induced expression

2016-08-17

王風青(1984-)，女，在讀博士，研究方向：食品生物技術(shù)，E-mail：wangfengqing-100@163.com。

*通訊作者:梁金鐘(1957-)，男，本科，教授，研究方向：微生物學與發(fā)酵工程，E-mail：ljz2050@126.com。

國家支撐計劃項目(2012BAD32B08)；研究生創(chuàng)新科研資金項目(YJSCX2015-356HSD)。

TS202.3

A

:1002-0306(2017)03-0127-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.03.016