莫啟進,卓梅芳,朱海軍

(1.梧州學院化學工程與資源再利用學院,廣西梧州 543002;2.梧州市產(chǎn)品質(zhì)量檢驗所,廣西梧州 543002)

分光光度法測定龜苓膏中總黃酮含量不確定度評定

莫啟進1,卓梅芳1,朱海軍2

(1.梧州學院化學工程與資源再利用學院,廣西梧州 543002;2.梧州市產(chǎn)品質(zhì)量檢驗所,廣西梧州 543002)

對分光光度法測定龜苓膏中總黃酮的含量進行不確定度評定。依據(jù)CNAS-GL06《化學分析中不確定度的評估指南》和JJF 1059-2012《測量不確定度評定與表示》的規(guī)定和實驗方法,建立數(shù)學模型,對檢測過程中可能引入的不確定度因素包括標準溶液配制、樣品處理、標準曲線擬合、樣品重復(fù)測定和儀器進行分析和評定。結(jié)果表明,標準曲線擬合和標準溶液配制引起的不確定度是不確定度的主要來源。

分光光度法,總黃酮,不確定度,龜苓膏

龜苓膏是以涼粉(淀粉、涼粉草提取液)、土茯苓(茯苓)、烏龜、蒲公英和金銀花為主要原料制作而成的一種嶺南傳統(tǒng)保健食品,主產(chǎn)于廣西梧州,具有清熱祛濕,旺血生肌,潤腸通便,滋陰補腎等眾多藥用價值[1],深受兩廣、港澳臺及東南亞人民的青睞。龜苓膏含有豐富的黃酮類化合物[2],黃酮類化合物對人體具有緩解疲勞、降血脂降血糖、促進毛細血管擴張、抗菌消炎、抗癌、抗衰老、雌性激素樣作用等功效[3-6]?？傸S酮作為龜苓膏主要的質(zhì)量控制指標,準確測定其在龜苓膏中的含量,對保障龜苓膏的品質(zhì)具有重要的現(xiàn)實意義。蘆丁有典型的黃酮類結(jié)構(gòu),且廉價易購,較多文獻報道以蘆丁作為對照品用于測定涼粉草、土茯苓、蒲公英和金銀花中的總黃酮含量[7-11]。

不確定度是體現(xiàn)被測量值合理分散性,是與測量結(jié)果相聯(lián)系的參數(shù),是當代誤差理論定量描述測量結(jié)果質(zhì)量的重要指標[12]。依據(jù)CNAS-GL06《化學分析中不確定度的評估指南》[12]和JJF 1059-2012《測量不確定度評定與表示》[13]的原理和方法,對采用分光光度法測定龜苓膏中總黃酮過程中不確定的來源進行評定分析,以保證總黃酮含量測定方法的可靠性及測定結(jié)果的可信程度。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

原味梧州龜苓膏 廣西梧州雙錢實業(yè)有限公司;亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、無水乙醇等試劑 均為分析純;蘆丁標準品 批號:100080-201408,含量測定用,純度為92.8%±0.5%,中國藥品生物制品檢定所;水 超純水。

UV-2450紫外-可見分光光度計 日本島津;XA205DU 十萬分之一電子天平 梅特勒-托利多;YP6002電子天平 常州衡正電子儀器有限公司;P300H超聲清洗器 德國Elmasonic;DZG-303A純水超純水系統(tǒng) 廣州品業(yè)儀器設(shè)備有限公司;TG16-WS臺式高速離心機 相儀離心機儀器有限公司;所有用到的玻璃儀器 均為天波牌A級。

1.2 實驗方法

本實驗方法參照相關(guān)標準[14],對試樣中總黃酮含量進行測定。

1.2.1 總黃酮標準溶液的配制及標準曲線繪制 精密稱取于120 ℃干燥至恒重的蘆丁標準品10.49 mg,置于10 mL容量瓶中,加60%乙醇溶液適量,超聲溶解,加60%乙醇至刻度,搖勻,精密量取5.0 mL置于25 mL容量瓶中,加60%乙醇溶液至刻度線,搖勻,此為標準品母液。精密量取標準品母液1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL置于25 mL容量瓶中,加入60%乙醇使容量瓶中溶液共10 mL,加5%亞硝酸鈉溶液1.0 mL,搖勻,放置6 min,加10%硝酸鋁溶液1.0 mL,搖勻,放置6 min,加1 mol/L氫氧化鈉溶液10 mL,再加水至刻度線,搖勻,放置15 min,以相應(yīng)的試劑做空白,在510 nm下測定吸光度,以濃度為橫坐標,吸光度為縱坐標,繪制標準曲線。

1.2.2 樣品前處理 取龜苓膏試樣適量攪拌成均勻的漿體,稱取試樣20.02 g(準確至0.01 g)于燒杯中,用25 mL無水乙醇稀釋后轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶,燒杯另用35 mL無水乙醇分多次清洗并轉(zhuǎn)移至該容量瓶中;超聲提取30 min,放冷,加水至刻度,搖勻,轉(zhuǎn)入離心試管,離心,取上清液作為供試品溶液。

1.2.3 樣品測定 精密量取1.2.2中的供試品溶液10.00 mL樣品溶液兩份,分別置于25 mL容量瓶中(處理步驟同1.2.1)。以空白溶液調(diào)零,在510 nm波長處測定樣品吸光度,代入標準曲線方程求出樣品溶液中總黃酮的濃度。

1.3 龜苓膏樣品中總黃酮含量計算數(shù)學模型

龜苓膏樣品中總黃酮含量計算:

式中:X為試樣中總黃酮含量(mg/kg);Cx為由標準曲線計算出的被測液中總黃酮質(zhì)量濃度(mg/mL);m為稱取的龜苓膏樣品質(zhì)量(g);V1為樣品提取液定容的總體積(mL);V2為從提取液V1中分取的體積(mL);V3為實驗被測液最終定容的體積(mL)。

1.4 不確定度來源分析

根據(jù)實驗方法和數(shù)學模型可知，影響總黃酮含量的不確定度的來源包括以下幾個方面:標準溶液配制引入的不確定度Urel(1);樣品處理過程引入的不確定度Urel(2);標準曲線擬合引入的不確定度Urel(3);樣品重復(fù)測定引入的不確定度Urel(4);儀器引入的不確定度Urel(5)。

2 結(jié)果與分析

2.1 總黃酮標準品溶液配制引入的不確定度

蘆丁標準溶液配制引入的不確定度包括標準品稱量、標準品純度、標準溶液配制體積引入的不確定度。

2.1.2 蘆丁的純度引入的相對不確定度 蘆丁的純度為P(C27H30O16)=92.8%±0.5%,假設(shè)是矩形分布[12],相對不確定度為:

標準溶液配制使用10 mL容量瓶、25 mL容量瓶、10 mL分度吸量管、5 mL單標液移液管和10 mL單標線移液管。由表1可得標準溶液配制體積引入的不確定為:

Urel(Vb)=[U(V1)2+U(V2)2+U(V4)2+U(V5)2+U(V6)2]1/2=[(8.94×10-4)2+(6.09×10-4)2+(2.07×10-3)2+(1.27×10-3)2+(8.94×10-4)2]1/2=2.80×10-3

2.1.4 合成標準溶液配制的相對不確定度 計算式如下:

Urel(1)=[(7.70×10-3)2+(3.11×10-3)2+(2.80×10-3)2]1/2=8.76×10-3

2.2 樣品處理過程引入的不確定度

樣品處理過程引入的不確定度包括樣品稱量引入的不確定度;樣品溶液制備體積引入的不確定度;樣品經(jīng)產(chǎn)生、轉(zhuǎn)移、離心等前處理引入的不確定度,可采用回收率實驗對其不確定度進行評定。

表1 玻璃量具引入的不確定度Table 1 Uncertainties aroused from error in calibration of volumetric flask and pipettes

表3 龜苓膏中總黃酮測定結(jié)果Table 3 Determination results of total flavonoids in guilinggao

2.2.2 樣品處理體積引入的不確定度 根據(jù)1.2.2和1.2.3對樣品進行處理和測定。使用100 mL容量瓶,10 mL單標線移液管,25 mL容量瓶,由表1中對應(yīng)玻璃器具引入的不確定度可得樣品處理體積引入的不確定度為:

Urel(Vy)=[U(V2)2+U(V3)2+U(V6)2]1/2=[(6.09×10-4)2+(5.47×10-4)2+(8.94×10-4)2]1/2=1.21×10-3

2.2.3 回收率實驗引入的不確定度 稱取同一試樣6份,進行加標實驗,按照樣品測量過程進行測定,6次回收率測定結(jié)果為100.69%、98.95%、99.86%、99.23%、97.25%、97.33%,平均值為98.89%,標準偏差為1.37%?；厥章蕦嶒炏鄬Σ淮_定度為:

2.2.4 合成樣品處理及測定過程引入的不確定度為:

Urel(2)=[(2.88×10-4)2+(1.21×10-3)+(5.66×10-3)2]1/2=5.79×10-3。

2.3 標準曲線擬合過程引入的相對不確定度

配制5個不同濃度的標準溶液,在510 nm波長下,每個濃度測定3次吸光度,結(jié)果見表2。

表2 標準曲線測定結(jié)果Table 2 Date for preparing standard curve

以表2中濃度為橫坐標,吸光度平均值為縱坐標,以最小二乘法進行擬合得標準曲線回歸方程及相關(guān)系數(shù)為:A=aC+b=13.903C-0.0191,r=0.9997。

將龜苓膏樣品分為樣品1與樣品2,每一樣品溶液重復(fù)測定三次吸光度,結(jié)果如表3所示。

由標準曲線求Cx時引入的相對不確定度Urel(3)為:

擬合曲線的標準偏差:

=3.30×10-2

2.4 樣品重復(fù)測定引入的不確定度

按照同一實驗方法對同一龜苓膏樣品進行6次平行測定,測得結(jié)果分別為113.9、113.4、113.6、113.4、114.4、114.7 mg/kg,測定結(jié)果的平均值為113.9 mg/kg,測定結(jié)果的標準偏差為0.544 mg/kg,相對標準不確定度為:

2.5 儀器引入的不確定度

分光光度計測定吸光度重現(xiàn)性引入的不確定度:對6份樣品溶液進行吸光度測定,每份測定3次,得到18個吸光度數(shù)據(jù),測得含量平均值為0.2278 mg,各次實驗的標準偏差為0.0019,則吸光度測量重現(xiàn)性引起的標準不確定度U2(UV)=0.0019。儀器引入的相對標準不確定度為:

2.6 合成標準不確定度

將以上各分量不確定度結(jié)果統(tǒng)計見表4。

表4 測量不確定度分量表Table 4 List of uncertainty components

由表4可得,相對合成標準不確定度為:

實驗測得某一龜苓膏樣品中總黃酮的平均含量為99.75 mg/kg,則測量結(jié)果的合成標準不確定度為:Urel(w)=99.75×3.48×10-2=3.47(mg/kg)

2.7 擴展不確定度

在95%的置信區(qū)間下,擴展不確定度包含因子k=2,則將合成標準不確定度乘以包含因子即得測量結(jié)果的擴展不確定度為:U(w)=2×3.47 mg/kg=6.94 mg/kg。該龜苓膏樣品中總黃酮含量可表示為(99.75±6.94) mg/kg,k=2。

3 結(jié)論

龜苓膏中總黃酮含量的測量不確定度由標準溶液配制、樣品處理、標準曲線擬合、樣品重復(fù)測定及儀器五部分組成。標準曲線擬合和標準溶液配制是不確定的主要來源,標準曲線擬合在不確定度合成中貢獻最大,而樣品處理、樣品重復(fù)測定、儀器對測定結(jié)果影響較小。在實際檢測過程中應(yīng)嚴格控制外標法定量,加強對標準曲線的擬合過程控制,加強標準操作訓練,減少人為因素對標準溶液配制和標準曲線校準過程的影響,在繪制標準曲線時,增加實驗點可降低分析結(jié)果的測量不確定度。

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Uncertainty evaluation for the determination of total flavonoids in guilinggao by spectrphotometry

MO Qi-jin1,ZHOU Mei-fang1,ZHU Hai-jun2

(1.College of Chemical Engineering and Resource Recycling,Wuzhou University,Wuzhou 543002,China;2. Wuzhou Institute of Product Quality Inspection,Wuzhou 543002,China)

The uncertainties evaluation of total flavonoids content in guilinggao was determined by spectrphotometry. Based on CNAS-GL06 guidance on evaluation the uncertainty in chemical analysis and JJF 1059-2012 evaluation of the uncertainty of deterrmination and expressin and the test method,a mathematical model was established to analyze and evaluate the possible uncertainties such as stock solution,sample treatment,standard curve fitting,measurement repeatability and instrument in the determination. The results showed that the major factors of uncertainty were the standard curve fitting and preparation of standard solution.

spectrphotometry;total flavonoids;uncertainty;guilinggao

2016-08-29

莫啟進(1982-)，男，博士，工程師，研究方向：食品質(zhì)量檢測與安全評價，E-mail：qjmo@qq.com。

廣西科學研究與技術(shù)開發(fā)計劃項目(桂科能14123006-25)。

TS207.3

A

:1002-0306(2017)04-0077-04

10.13386/j.issn1002-0306.2017.04.006