李靖坤，王珊珊，林云良, 王曉利, 陳相峰

（山東省分析測(cè)試中心，山東 濟(jì)南 250014）

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定對(duì)甲苯磺酸脂類基因毒性雜質(zhì)的方法學(xué)驗(yàn)證

李靖坤，王珊珊，林云良, 王曉利, 陳相峰＊

（山東省分析測(cè)試中心，山東 濟(jì)南 250014）

用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法對(duì)吉非替尼中的對(duì)苯磺酸酯類（對(duì)甲苯磺酸甲酯、對(duì)甲苯磺酸乙酯、對(duì)甲苯磺酸異丙酯）的含量進(jìn)行測(cè)定。該方法對(duì)對(duì)甲苯磺酸甲酯、對(duì)甲苯磺酸乙酯的檢出限均為 0.50 mg/kg，對(duì)甲苯磺酸異丙酯的檢出限為 1.2 mg/kg；三種化合物在 5～200 ng/mL 的濃度范圍內(nèi)均成良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù) R2＞0.99；回收率在 88.3%～111.6%之間；相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）＜4.67%，符合檢測(cè)要求。該方法可以很好的應(yīng)用于吉非替尼中對(duì)苯磺酸酯類雜質(zhì)的檢測(cè)。

氣相色譜-質(zhì)譜法；吉非替尼；對(duì)苯磺酸酯類

吉非替尼（易瑞沙）是一種表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑，它是一種新型抗癌藥物，可以通過(guò)抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中細(xì)胞信號(hào)的傳導(dǎo)來(lái)抑制惡性腫瘤細(xì)胞的增生，目前已在多個(gè)國(guó)家批準(zhǔn)上市用于癌癥的治療［1］。然而，在藥物生產(chǎn)制備過(guò)程中，容易造成痕量或微量的溶劑殘留，這些具有一定的毒性和致癌作用的溶劑殘留已引起醫(yī)藥界廣泛的關(guān)注［2，3］。為保護(hù)患者免受藥品中溶劑殘留的傷害，對(duì)藥品中溶劑的殘留量進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)定非常必要［4］。

在吉非替尼藥物的制備過(guò)程中涉及到對(duì)苯磺酸酯類。對(duì)苯磺酸酯類是一種潛在的基因毒性雜質(zhì)［5，6］，這些物質(zhì)可與 DNA 發(fā)生烷基化反應(yīng)［7,8］從而誘發(fā)癌癥，因此對(duì)藥物中該類雜質(zhì)的毒理學(xué)關(guān)注閾值水平進(jìn)行控制至關(guān)重要［9,10］。目前，已有用氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)［11］和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)［12］對(duì)藥物中對(duì)苯磺酸酯類雜質(zhì)進(jìn)行測(cè)定的報(bào)道。本文建立了用GC-MS 對(duì)吉非替尼中對(duì)甲苯磺酸乙酯類殘留量的定量測(cè)定方法，并進(jìn)行了相應(yīng)方法學(xué)研究。

1 試驗(yàn)部分

1.1儀器與試劑

Agilent 7890A-7000B 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，KQ2202 型數(shù)控超聲波清洗機(jī)，離心機(jī)，電子天平（0.0001g）。

吉非替尼，丙酮，甲苯磺酸甲酯，對(duì)甲苯磺酸乙酯，對(duì)甲苯磺酸異丙酯，均為色譜純。

1.2 色譜質(zhì)譜條件

色譜柱：毛細(xì)管柱( DB-624 30 m×0.25 mm× 1.4 μm)，固定相為 6% 氰丙基苯、94% 二甲基聚硅氧烷。

載氣：氦氣。流速：1.0 mL/min。

程序升溫：起始溫度為 80 ℃，維持 0 min，以30 ℃每分鐘的速率升溫至 210 ℃，維持 10 min，20℃每分鐘的速率升至 250 ℃，保持 1min。

進(jìn)樣口溫度：260 ℃。分流模式：不分流進(jìn)樣。進(jìn)樣體積：1.0 μL。

離子源參數(shù)：電子轟擊電離源（EI 源），電子能量為 70 eV，離子源溫度為 230 ℃。掃描模式：選擇離子掃描，各目標(biāo)化合物的選擇離子（m/z）為對(duì)甲苯磺酸甲酯（91、155、186），對(duì)甲苯磺酸乙酯（91、155、200），對(duì)甲苯磺酸異丙酯（91、172、214）。

1.3 溶液的配制

供試品溶液：取吉非替尼 40 mg，精密稱定，置 10 mL 量瓶中，加丙酮稀釋溶解并定容至刻度，搖勻，超聲 2 min，作為供試品溶液。

對(duì)照品貯備液：取對(duì)甲苯磺酸甲酯 100.1mg，對(duì)甲苯磺酸乙酯 100.9 mg，對(duì)甲苯磺酸異丙酯 100.2 mg，精密稱定，置 10 mL 量瓶中，加丙酮溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為貯備液 1。精密量取 1.0 mL貯備液 1，置 100 mL 量瓶中，加丙酮溶解并稀釋至刻度，搖勻，貯備液 2。精密量取 1.0 mL 貯備液 2，置 100 mL 量瓶中，加丙酮溶解并稀釋至刻度，作為對(duì)照品貯備液，濃度為 1.0 μg/mL。

對(duì)照品溶液：精密量取對(duì)照品貯備液 2.0 mL，置 100 mL 量瓶中，加丙酮溶解并稀釋至刻度，作為對(duì)照品溶液，濃度為 20 ng/mL。

1.4 試驗(yàn)方法

待氣相色譜-質(zhì)譜儀開機(jī)穩(wěn)定后，取供試品溶液、對(duì)照品貯備液、對(duì)照品溶液進(jìn)行色譜分析，計(jì)算各組分的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 專屬性驗(yàn)證

單獨(dú)進(jìn)空白溶液，證明該溶液對(duì)被測(cè)物測(cè)試無(wú)干擾。取對(duì)照品貯備液 2，進(jìn)樣 0.5 μL，記錄色譜圖及質(zhì)譜圖。并取供試品含雜質(zhì)的混合溶液進(jìn)樣。測(cè)定色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 全掃描色譜圖Fig.1Chromatograms of full scan

結(jié)果表明：空白溶液對(duì)雜質(zhì)檢測(cè)無(wú)干擾，各目標(biāo)化合物峰分離良好，供試品中其他雜質(zhì)對(duì)目標(biāo)化合物的檢測(cè)無(wú)干擾，方法專屬性強(qiáng)。

2.2 系統(tǒng)適用性驗(yàn)證

取對(duì)照品溶液 1μL，連續(xù)進(jìn)樣 6 針，記錄各目標(biāo)化合物的峰面積，并計(jì)算峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差值（表 1）。

表1 系統(tǒng)適用性結(jié)果Table 1Results of the apparatus suitability test

結(jié)果表明：對(duì)甲苯磺酸甲酯、對(duì)甲苯磺酸乙酯、對(duì)甲苯磺酸異丙酯雜質(zhì)峰面積的 RSD 值分別為4.06%、4.56%、3.26%，均小于 5.0%，系統(tǒng)適用性良好。

2.3 定量限及檢測(cè)限

取對(duì)照品溶液適量逐級(jí)稀釋成 10、5、2 ng/mL的溶液并進(jìn)樣，其信噪比（S/N）在 3～5 的樣品濃度即為檢測(cè)限濃度，檢測(cè)限連續(xù)進(jìn) 3針；信噪比在10～15 的樣品的濃度即為定量限濃度，定量限連續(xù)進(jìn)樣6針；檢測(cè)限濃度與樣品理論濃度的比值即為檢測(cè)限；定量限濃度與樣品理論濃度的比值即為定量限。取空白溶液及上述溶液各 1.0 μL，分別注入氣質(zhì)色譜儀，記錄離子流圖。記錄被測(cè)物峰高并計(jì)算定量限連續(xù) 6針?lè)甯叩?RSD。定量限和檢測(cè)限測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表 2、表 3。

表2 定量限試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of LOQ

表3 檢測(cè)限試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of LOD

數(shù)據(jù)顯示：對(duì)甲苯磺酸甲酯和對(duì)甲苯磺酸乙酯的檢出限為 0.5ppm，對(duì)甲苯磺酸異丙酯的檢出限為1.25ppm；對(duì)甲苯磺酸甲酯和對(duì)甲苯磺酸乙酯的定量限均為 1.25ppm，對(duì)甲苯磺酸異丙酯的定量限為2.5ppm；其 RSD 均小于 10%。

2.4 線性范圍

分別精密量取對(duì)照品貯備液 0.05、 0.10、0.20、0.5、1.0、2.0 mL 于 10 mL 量瓶中，用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，配置線性溶液。取上述線性溶液各 1μL進(jìn)樣，記錄色譜圖。三種化合物的線性結(jié)果見(jiàn)表 4。

表4 對(duì)甲苯磺酸酯類線性結(jié)果Table 4 The linear results ofp-toluenesulfonate acid esters

結(jié)果顯示：在 5～200 ng/mL 的范圍內(nèi)，甲苯磺酸甲酯的線性方程為 y =185.73x-38.144，線性相關(guān)系數(shù) R2 = 0.998 2；對(duì)甲苯磺酸乙酯的線性方程為 y = 158.88x - 141.43 ，線性相關(guān)系數(shù) R2 = 0.997 4；對(duì)甲苯磺酸異丙酯的線性方程為 y = 28.713x - 73.955，線性相關(guān)系數(shù) R2 = 0.997 4；呈現(xiàn)出良好的線性相關(guān)關(guān)系。

2.5 方法精密度與準(zhǔn)確度

取吉非替尼稱樣并配制成含各目標(biāo)化合物100%的測(cè)試溶液，作為方法精密度測(cè)試溶液，共配制6份。計(jì)算各目標(biāo)化合物的含量，回收率及回收率的 RSD%。確定該色譜方法的測(cè)定結(jié)果與真實(shí)值（加入量）的差異。從而確認(rèn)是否該方法可以獲得準(zhǔn)確的測(cè)試結(jié)果。三種化合物的準(zhǔn)確度測(cè)試結(jié)果分別見(jiàn)表5。

表5 對(duì)甲苯磺酸酯類準(zhǔn)確度測(cè)試結(jié)果Table 5 Results of method accuracy ofp-toluenesulfonate acid esters

各基因毒性雜質(zhì)的精密度結(jié)果分別為：對(duì)甲苯磺酸甲酯 1.60%，對(duì)甲苯磺酸乙酯 1.96%，對(duì)甲苯磺酸異丙酯 4.67%，測(cè)定結(jié)果的 RSD 均≤10.0%；各雜質(zhì)的加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果良好。該方法準(zhǔn)確度和精密度良好。

2.6 實(shí)際樣品檢測(cè)

吉非替尼供試品溶液：精密稱定樣品 1～3 各 40 mg，置于 10 mL 的量瓶中，超聲 2 min，搖勻，進(jìn)樣測(cè)試。結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 樣品檢測(cè)結(jié)果Table 6 Results of sample test

結(jié)果表明：三種吉非替尼樣品中均未檢出對(duì)苯磺酸酯類基因毒性雜質(zhì)殘留。

3 結(jié) 論

本文用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定吉非替尼供試品中的對(duì)苯磺酸酯類，獲得了理想的結(jié)果。該方法準(zhǔn)確、可靠、操作便捷、符合基因毒性雜質(zhì)的檢測(cè)要求，可以廣泛的應(yīng)用于對(duì)苯磺酸酯類的檢測(cè)中。

［1］管忠震，張力，李龍蕓. 吉非替尼治療局部晚期或轉(zhuǎn)移性非小細(xì)胞肺癌在中國(guó)的臨床研究[J]. 癌癥，2005, 24（8）:980-984.

［2］陳日南. 藥物中有機(jī)溶劑殘留量測(cè)定法評(píng)述[J]. 中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜質(zhì)，1997，28（6）:275 -279.

［3］孫鵬. 藥物中有機(jī)溶劑殘的研究與檢測(cè)[J]. 科技創(chuàng)新，2014，3:32.

［4］王衛(wèi). 藥 品 中有機(jī)溶劑 殘 留 量 及 其測(cè)定[J]. 天津藥 學(xué) ，2001，13（3）:26-30.

［5］阮曉玲, 鄭項(xiàng)元, 徐潔, 丁黎, 鄭楓. 藥物中基因毒性雜質(zhì)分析方法的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2016，47(3):267-274．

［6］王萍,徐彩虹,陳仙,胡愛(ài)玲.原料藥中基因毒性雜質(zhì)控制的研究進(jìn)展[J].中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué),2015,32(1):119-126.

［7］Stopper H,Lutz W K. Induction of micronuclei in human cell lines andprimary cells by combination treatment with ?3-radiation and ethyl methanesulfonate[J]. Mutagenesis,2002,17:177-181.

［8］Garcíaa A,Rupéreza F J,Ceppa F,et al.Development of chromatographic methods for the determination of genotoxic impurities in cloperastine fendizoate[J]. Jpharm Biomed Anal,2012,61:230-236

［9］European Medicines Agency.Evaluation of medicines for human use, guideline on the limits of genotoxic impurities[S].CPMP/SWP/ 5199/02,EMEA/CHMP/ QWP/251344/2006(2007).

［10］張園園,李銀峰,王杰晶.藥物中痕量磺酸酯類物質(zhì)的檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展[J].藥物評(píng)價(jià)研究,2012:35（4）:304-307.

［11］霍立,劉艷妮.氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)對(duì)甲苯磺酸酯類雜質(zhì)[J].中國(guó)新技術(shù)新產(chǎn),2016,1:55.

［12］梁鍵謀,傅聰,陳悅.LC-MS/MS 測(cè)定草酸右旋西酞普蘭中對(duì)甲苯磺酸酯類基因毒性雜質(zhì)的含量[J].中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué) ,2016,33（11）：1436-1440.

Validation of GC-MS Method for Determining Genotoxic Impuritiesp-Toluene Sulfonic Acid Esters

LI Jing-kun, WANG Shan-shan, LIN Yun-liang, WANG Xiao-li, CHEN Xiang-feng*
（Shandong Analysis and Test Centre, Shandong Jinan 250014, China）

A gas chromatography-mass spectrometry method was developed to determinep-toluene sulfonic acid esters (methylp-toluenesulfonate, ethylp-toluenesulfonate and isopropylp-toluenesulfonate) in gefitinib. The test results show that developed method has good linearity (R2＞0.99) in the range of 5～200 ng/mL and good repeatability (RSD%, ＜4.67%, n=6). The detection limit of methylp-benzenesulfonate and ethylp-toluenesulfonate is 0.50 mg/kg and the detection limit of isopropylp-toluenesulfonate is 1.25 mg/kg. The recoveries of spiked samples are between 88.3% and 111.6%. The developed method can be applied in detection ofp-benzenesulfonic acid esters in real samples.

GC-MS; gefitinib;p-benzenesulfonic acid esters

O 657

： A

： 1671-0460（2017）02-0378-03

2017-01-09

李靖坤（1991-），男，山東省聊城人，助理研究員，2014 年畢業(yè)于濟(jì)南大學(xué)應(yīng)用化學(xué)，研究方向：藥物分析。

陳相峰（1981-），男，副研究員，博士，從事復(fù)雜體系質(zhì)譜分析研究。E-mail：xiangfchensdas@163.com。