賈世良, 王珊珊，陳相峰＊，朱 文，林云良，李 磊

（1. 山東省分析測(cè)試中心, 山東 濟(jì)南 250014； 2. 山東省科技統(tǒng)計(jì)分析研究中心, 山東 濟(jì)南 250014）

維格列汀基因毒性雜質(zhì)的氣相色譜—質(zhì)譜分析方法學(xué)驗(yàn)證

賈世良1, 王珊珊1，陳相峰1＊，朱 文2，林云良1，李 磊1

（1. 山東省分析測(cè)試中心, 山東 濟(jì)南 250014； 2. 山東省科技統(tǒng)計(jì)分析研究中心, 山東 濟(jì)南 250014）

報(bào)道了一種測(cè)定維格列汀中的氨基甲酸脂類和對(duì)甲苯磺酸脂類基因毒性雜質(zhì)的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)方法。采用選擇離子監(jiān)測(cè)（SIM）模式，在 0.2～2 μg/mL 濃度范圍內(nèi)，四種目標(biāo)化合物線性相關(guān)系數(shù)均大于 0.996 0，樣品的加標(biāo)回收率在 86.94%～113.11%之間，通過方法精密度實(shí)驗(yàn)，方法精密度（RSD%）在 5.37%～7.96%之間，精密度良好。該方法能完全滿足維格列汀基因毒性雜質(zhì)氨基甲酸脂類和對(duì)甲苯磺酸脂類的檢測(cè)。

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用；氨基甲酸脂類；對(duì)甲苯磺酸脂類；選擇離子模式；方法精密度

近年來，隨著人們生活水平的提高，我國糖尿病患病率迅速增加[1]。糖尿病嚴(yán)重危害著人類健康，最近的一項(xiàng)研究顯示，我國 20 歲以上人群中男性和女性的糖尿病患病率分別為 10. 6%和 8. 8%，總體患病率為 9. 7%[2-4]。雖然目前有大量治療藥物，但長期血糖控制仍不理想，導(dǎo)致了大量的糖尿病并發(fā)癥，如心臟病，中風(fēng)，截肢，失明，腎病，周圍神經(jīng)病變等[5-7]。研究顯示，二肽基肽酶-4( DPP-4)抑制劑維格列汀可以有效控制血糖，同時(shí)具有減少胰島 β 細(xì)胞凋亡，促進(jìn) β 細(xì)胞新生的作用[8]。尤其 2型糖尿病患者口服維格列汀通常耐受性良好，大多數(shù)不良反應(yīng)為輕到中度，且與劑量無相關(guān)[9]。老年患者（大于 65 歲）對(duì)維格列汀的耐受性也較好[10]，維格列汀引起低血糖的風(fēng)險(xiǎn)較低，且不增加體重[11]。已廣泛用于糖尿病治療。維格列汀基因毒性雜質(zhì)是指在維格列汀合成工藝?yán)锎嬖诘姆磻?yīng)副產(chǎn)物，根據(jù)維格列汀合成工藝路線[12,13]，確定維格列汀中可能存在氨基甲酸脂類和對(duì)甲苯磺酸脂類。本文建立了GC-MS 測(cè)定維格列汀基因毒性雜質(zhì)中的氨基甲酸脂類和對(duì)甲苯磺酸脂類。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料、試劑與儀器

維格列汀樣品購買于當(dāng)?shù)蒯t(yī)院、二氯甲烷(色譜純)、Agilent 6890N-5973N GC/MS 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用、Mettle AB265-S 型電子分析天平。

1.2 溶液配制

稀釋溶劑：二氯甲烷。對(duì)照品儲(chǔ)備液 1：分別取氨基甲酸甲酯、氨基甲酸乙酯、對(duì)甲苯磺酸甲酯、對(duì)甲苯磺酸乙酯 100 mg（精確到 0.000 1g）到 10 mL的棕色容量瓶中，用二氯甲烷定容到刻度，濃度為10 mg/mL，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液 1。對(duì)照品溶液：精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，配制成每 1mL 二氯甲烷分別含有 100 μg 氨基甲酸甲酯、氨基甲酸乙酯、對(duì)甲苯磺酸甲酯、對(duì)甲苯磺酸乙酯的溶液，濃度為100 μg/mL，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液 2；取該溶液 100 μL到 10 mL 的棕色容量瓶中，并用二氯甲烷定容到刻度，濃度為 1.0 μg/mL，作為對(duì)照品溶液。供試品溶液：精密稱取 200 mg 維格列汀樣品，到 25 mL 具塞刻度試管中，加入 10 mL 的二氯甲烷超生萃取 10 min，靜置，全部轉(zhuǎn)移到另一只刻度試管中，清洗樣品管 3 次，每次 1mL，全部轉(zhuǎn)移清洗液；并用氮吹儀將其濃縮至 3 mL 以下，最后用二氯甲烷定容到 3 mL，靜置，直接取上清液 1mL 于進(jìn)樣瓶中，待用。

1.3 分析條件

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀及氣相條件：氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：Agilent 6890N-5973N GC/MS。

色譜柱： DB-624（30 m×0.25 mm i.d., 1.4 μm）；柱溫箱升溫程序：起始溫度 60oC，以 10oC/min 的速率升溫至 220oC，保持 10 min, 進(jìn)樣口溫度：280oC，分流模式采用脈沖不分流模式；載氣使用高純氦氣；流速為 1.0 mL/min；進(jìn)樣體積：1.0 μL；質(zhì)譜采集模式采用選擇離子監(jiān)測(cè)（SIM）模式，離子源溫度為 230oC。

2 結(jié)果與分析

2.1 專屬性實(shí)驗(yàn)

（1）空白溶劑：二氯甲烷。

（2）取 100 μg/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液 0.1mL，用二氯甲烷稀釋到 1mL，濃度為 10 μg/mL。用自動(dòng)進(jìn)樣器取 1.0 μL 進(jìn)行氣質(zhì)分析，記錄離子流圖，質(zhì)譜掃描模式為 Scan 模式。經(jīng)過質(zhì)譜分析得出四種物質(zhì)的出峰順序和保留時(shí)間。結(jié)果見表1。

表1 專屬性結(jié)果Table 1The result of the specific test

（3）空白樣品溶液：精密稱取 200 mg 精制維格列汀樣品，到 25 mL 具塞刻度試管中，加入 10 mL的二氯甲烷超生萃取 10 min，靜置，全部轉(zhuǎn)移到另一只刻度試管中，清洗樣品管 3 次，每次 1mL，全部轉(zhuǎn)移清洗液；并用氮吹儀將其濃縮至 3 mL 以下，最后用二氯甲烷定容到 3 mL，靜置，取 1μL 進(jìn)樣。

（4）樣品加標(biāo)溶液配制：精密稱取 200 mg 精制維格列汀樣品，到 25 mL 具塞刻度試管中，向樣品中加入 100 μL 對(duì)照品儲(chǔ)備液 2；然后，加入 10 mL的二氯甲烷超生萃取 10 min，靜置，全部轉(zhuǎn)移到另一只刻度試管中，清洗樣品管 3 次，每次 1mL，全部轉(zhuǎn)移清洗液；并用氮吹儀將其濃縮至 3 mL 以下，最后用二氯甲烷定容到 3 mL，靜置，取 1μL 進(jìn)樣。

從表可以得出：精制維格列汀樣品中不含有氨基甲酸甲酯、氨基甲酸乙酯、對(duì)甲苯磺酸甲酯、對(duì)甲苯磺酸乙酯；并且樣品中各雜質(zhì)峰對(duì)目標(biāo)化合物的檢測(cè)無干擾。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限及定量限

精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，分別配制成每 1mL二氯甲烷中含有目標(biāo)化合物（氨基甲酸甲酯、氨基甲酸乙酯、對(duì)甲苯磺酸甲酯、對(duì)甲苯磺酸乙酯）為 2、0.8、0.5、0.4、0.1μg 的溶液。按上述操作條件進(jìn)行測(cè)定，以質(zhì)量濃度(X)/(μg/mL)，對(duì)相應(yīng)的峰高(Y)進(jìn)行線性回歸。

精密量取上述溶液各 1.0 μL 注入氣質(zhì)色譜儀，記錄峰面積。以目標(biāo)物濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)作回歸曲線，計(jì)算回歸方程及相應(yīng)的線性回歸系數(shù)。獲得四種化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線及相關(guān)系數(shù)，并得到其檢出限和定量限(表 2)。

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 The result of the standard curve test

表3 對(duì)照品實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 The results of reference substance test

2.3 方法回收率及精密度

取對(duì)照品溶液平行 4 份，各取 1μL 進(jìn)樣，記錄色譜圖和峰面積，以其峰面積的平均值計(jì)算回收率見表3。

本品最大日劑量 100 mg，以 TTC 1.5 μg/d 計(jì)算，目標(biāo)物控制限度應(yīng)為 0.0015%(15ppm)。因此在

120%(18ppm)、80%(12ppm) 兩個(gè)濃度水平上測(cè)定回收率。精密稱取 200 mg 精制維格列汀樣品，到25 mL 具塞刻度試管中，向維格列汀中用 50 μL 進(jìn)樣針加入 100 μg/mL 對(duì)照品儲(chǔ)備液 36、24 μL。即高濃度加標(biāo)水平濃度為 1.2 μg/mL；低濃度加標(biāo)水平濃度為 0.8 μg/mL。向其中加入 10 mL 的二氯甲烷超生萃取 10 min，靜置，全部轉(zhuǎn)移到另一只刻度試管中，清洗樣品管 3 次，每次 1mL，全部轉(zhuǎn)移清洗液；并用氮吹儀將其濃縮至 3 mL 以下，最后用二氯甲烷定容到 3 mL，靜置，待用，每個(gè)濃度水平平行制備3份。

精密量取上述供試品溶液 1.0 μL 注入氣質(zhì)聯(lián)用色譜儀，記錄離子流圖。結(jié)果見表4。

表4 方法的加標(biāo)回收率Table 4 The recoveries of the spiked standard solutions

結(jié)論：樣品在2個(gè)加標(biāo)濃度水平下回收率在86.94 %～113.11%之間，平均回收率在 92.34%～107.25%之間，回收率良好。

精密稱取 200 mg 精制維格列汀樣品，到 25 mL具塞刻度試管中，向維格列汀中用 50 μL 進(jìn)樣針加入 100 μg/mL 對(duì)照品儲(chǔ)備液 30 μL。即精密度加標(biāo)水平濃度為 1.0 μg/mL。向其中加入 10 mL 的二氯甲烷超生萃取 10 min，靜置，全部轉(zhuǎn)移到另一只刻度試管中，清洗樣品管 3 次，每次 1mL，全部轉(zhuǎn)移清洗液；并用氮吹儀將其濃縮至 3 mL 以下，最后用二氯甲烷定容到 3 mL，靜置，待用，平行制備 5 份。分別進(jìn)樣 1.0 μL，記錄色譜圖和峰面積，以峰面積計(jì)算各相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表5。

表5 方法精密度試驗(yàn)結(jié)果Table 5 The results of theprecision test

結(jié)論：RSD 值在 5.37%～7.96%之間，符合方法學(xué)要求。

2.4 溶液穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取對(duì)照品溶液 1mL 于進(jìn)樣瓶中，每 4 h 進(jìn)樣一次，共進(jìn)樣5次，以目標(biāo)物以及雜質(zhì)峰的峰面積來評(píng)定溶液的穩(wěn)定性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表6。

表6 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)Table 6 Solution stability test

由表6看出各目標(biāo)化合物（氨基甲酸甲酯、氨基甲酸乙酯、對(duì)甲苯磺酸甲酯、對(duì)甲苯磺酸乙酯）的 RSD 值在 4.5%以內(nèi)，符合溶液穩(wěn)定性的要求。

2.5 樣品檢測(cè)

樣品均未檢出各目標(biāo)雜質(zhì)。中間體 1～3 樣品中檢出氨基甲酸乙酯。峰面積 A與濃度 C（ppm）之間結(jié)果見表 7。樣品檢測(cè)加標(biāo)譜圖見圖 1。

表7 中間體1-3批次樣品檢測(cè)結(jié)果Table 7 The detection result of the Intermediate 1-3

圖1 樣品加標(biāo)溶液的色譜圖Fig. 1The chromatogram of the spiked standard solution

3 結(jié) 論

本研究建立了維格列汀中氨基甲酸酯類和對(duì)甲苯磺酸脂類基因毒性雜質(zhì)的分析方法。分析方法的線性范圍、檢測(cè)限、平均加標(biāo)回收率和精密度等指標(biāo)均能滿足分析要求。此分析方法快速、準(zhǔn)確、靈敏度高，能夠滿足測(cè)定要求，可用于維格列汀基因毒性雜質(zhì)氨基甲酸酯類和對(duì)甲苯磺酸脂類的檢測(cè)。

［1］李艷玲，張星光，陳彬，等 . 維格列汀對(duì)新診斷 2 型糖尿病的療效及對(duì)血糖波動(dòng)的影響研究[J]．中國全科醫(yī)學(xué)，2014，17 ( 28) : 3350－3352.

［2］戴夢(mèng)昭. 維格列汀聯(lián)用二甲雙胍治療 2 型糖尿病療效和安全性的Meta 分析[J]. 中國全科醫(yī)學(xué)，2013，16 ( 8) :2714 -2717．

［3］W. Yang, J. Lu, J. Weng, et al.prevalence of diabetes among men andwomen in China [J]. New England Journal of Medicine，2010，362( 12) : 1090 -1101

［4］蘇永，呂麗芳，李全忠，等.維格列汀與 A-糖苷酶抑制劑治療 2 型糖 尿 病 的 隨 機(jī) 對(duì) 照 臨 床 試 驗(yàn) [J]. 中 國 新 藥 雜 志 ， 2014 ， 23（22）:2655-2658.

［5 ］占美，吳逢波，徐珽 ，等.維格列汀與其他口服降糖 藥對(duì)照治療 2型 糖 尿 病 的 Meta 分 析 [J] .中 國 醫(yī) 院 藥 學(xué) 雜 志 ， 2011,31（21）:1824-1827

［6］L. Ryden, E. Standl, M. Bartnik, et al.Guidelines on Diabetes,pre-Diabetes, and Cardiovascular Diseases: Executive Summary: The Task Force on Diabetes and Cardiovascular Diseases of the European Society of Cardiology (ESC) and the European Association for the Study of Diabetes (EASD)[J]. European Heart Journal，2007，28（1）:88-136．

［7］A. Lee,p.patrick, J. Wishart, et al. The effects of miglitol on glucagon-likepeptide-1secretion and appetite sensations in obese type 2 diabetics[J]. Diabetes Obesity and Metabolism，2002，4（5）:329-335

［8］B. Ahren, A. Schweizer, S. Dejager, et al. Mechanisms of action of the dipeptidylpeptidase-4 inhibitor vildagliptin in humans[J]. Diabetes Obesity and Metabolism，2011，13（9）:775-783．

［9］W. D. Strain, L. Valentina,K. Wolfgang, et al.Individualised treatment targets for elderlypatients with type 2 diabetes using vildagliptin add-on or lone therapy (INTERVAL):a 24 week, randomised, double-blind,placebo-controlled study[J]. Lancet ， 2013 ， 382（9890）:409-416.

［10］A. Schweizer, S. Dejager, E. Bosi. Comparison of vildagliptin and metformin monotherapy in elderlypatients with type 2 diabetes: a 24-week, double-blind, randomized trial[J].Diabetes Obesity and Metabolism，2009，11（8）:804-812.

［11］安富榮，崔嵐，王勤. 治療型糖尿病新藥—維格列汀[J]. 中國新藥與臨床雜志，2012，31（10）:574-578.

［12］M. Eckhardt,E. Langkopf, H. Frank, et al. 8-(3-(R)-aminopiperidin-1-yl)-7-but-2-ynyl-3-methyl-1-(4-methyl-quinazolin-2-ylmethyl) -3,7-dihydropurine-2,6-dione (BI 1356), a highlypotent, selective, long-acting, and orally bioavailable DPP-4 inhibitor for the treatment of type 2 diabetes[J]. Journal of Medicinal Chemistry，2007， 50（26）:6450-6453.

［13］史嬌陽，吳雪松，岑均達(dá).維格列汀合成路線圖解[J]. 中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2013，44（2）:206-208.

Validation of GC-MS Method for Determining Genotoxic Impurities in Vildagliptin

JIA Shi-liang1, WANG Shan-shan1, CHEN Xiang-feng1*, ZHU Wen2, LIN Yun-liang1, LI Lei1
（1. Shandong Analysis and Test Centre, Shandong Jinan 250014，China; 2. Shandong Science and Technology Statistics Centre, Shandong Jinan 250014，China）

A gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) method was established to determine carbamic acid lipid andp-toluene sulfonic acid lipid in vildagliptin. Selective ion monitoring (SIM) mode was used for four genotoxic imputities in vildagliptin. The linear correlation coefficients were all above 0.996 0 in the range from 0.2 μg/mL to 2 μg/mL. The recoveries of the spiked samples were between 86.94% and 113.11%. Theprecision of method (RSD%) was from 5.37% to 7.96%. These results showed that the method was accurate, and was able to determine carbamic acid lipid andp-toluene sulfonic acid lipid in vildagliptin.

GC-MS; Carbamic acid lipid;p-toluene sulfonic acid lipid; Selected ion mode;precision

O 657

： A

： 1671-0460（2017）02-0370-04

2017-01-10

賈世良（1990-），男，河南省許昌人，助理實(shí)驗(yàn)師，碩士，2017 畢業(yè)于山東科技大學(xué)，研究方向：質(zhì)譜分析。E-mail：jia19900315@126.com。

陳相峰（1981-），男，副研究員，博士，研究方向：復(fù)雜體系質(zhì)譜分析研究。E-mail：xiangfchensdas@163.com。