侯紅瑞，陳 玲, 王春曉, 孫國勇, 張小鳳

（1. 茂名職業(yè)技術(shù)學(xué)院， 廣東 茂名 525000； 2. 華南理工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院， 廣東 廣州 510640）

山柰素對照品的制備研究

侯紅瑞1，陳 玲2, 王春曉1, 孫國勇1, 張小鳳1

（1. 茂名職業(yè)技術(shù)學(xué)院， 廣東 茂名 525000； 2. 華南理工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院， 廣東 廣州 510640）

建立從高良姜中制備山柰素對照品的方法，結(jié)合吸附樹脂和制備型高效液相色譜對高良姜乙醇提取物進(jìn)行分離純化，通過 IR、MS 和 NMR 進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，分析型 HPLC 面積歸一化法進(jìn)行純度檢查和含量測定，得山柰素對照品純度符合國家藥典要求，質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于 99.8%，建立的制備方法簡單，對照品純度高，可作為山柰素藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究的標(biāo)準(zhǔn)對照品。

山柰素；高良姜；對照品；制備方法

高良姜(Alpinia officinarum Hance)為姜科多年生草本植物的干燥根莖，主要分布于福建、廣東、廣西、海南等省。具有溫胃、祛風(fēng)、散寒、行氣、止痛的功效，常用于脘腹冷痛，胃寒嘔吐，噯氣吞酸等癥狀的治療，收載于《中國藥典》2015 年版［1-3］。山柰素為高良姜中黃酮類化合物之一，具有抗癌[4]、抗菌、抗炎及減少皮膚細(xì)胞黑素合成[5]等藥理活性，可作為一個能反映高良姜部分功效的指標(biāo)成分進(jìn)行分析。由于高良姜中黃酮類化合物性質(zhì)相近，導(dǎo)致山柰素單體的分離難度較大，且文獻(xiàn)檢索尚無對山柰素對照品的制備，這給山柰素的藥理活性研究造成極大不方便。本文在系統(tǒng)研究了大孔吸附樹脂分離純化高良姜總黃酮工藝的基礎(chǔ)上，采取制備型高效液相色譜（preparative highperformance liquid chromatography，PHPLC）制備山柰素對照品。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

高良姜藥材，市售; HPD-600 樹脂（河北滄州寶恩化工有限公司）;95%乙醇、無水乙醇均為分析純;二甲基亞砜、甲醇、乙腈均為色譜純;山奈素標(biāo)準(zhǔn)品（上海友思生物技術(shù)有限公司，批號 150212）。

法國 Gilson GX-281制備/分析型高效液相色譜儀，Gilson 156 UV/VIS 檢測器，六通進(jìn)樣閥，TRILUTION?LC 色譜工作站，Tensor37 紅外光譜儀，Esquire HCTpLUS 質(zhì)譜儀，UV-2102pC 型紫外可見分光光度計，BT00-100M 恒流泵，BSZ-100 自動收集器。

1.2 實驗方法

1.2.1 黃酮供試液制備工藝

稱取 1kg 干燥的高良姜藥材，粉碎至 10～20目，加 80%乙醇 500 mL 溶解超聲提取，提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，真空烘干，加 50%乙醇稀釋到 0.9 mg/mL 即得黃酮供試液，冷藏備用。

1.2.2 高良姜總黃酮純度及得率計算

式中：X ——洗脫液中黃酮濃度；

V ——洗脫液體積；

G ——洗脫液濃縮烘干后得固形物重量。

式中：X ，X樣——分別為洗脫液和上樣液中黃酮濃度；

V， V樣——分別為洗脫液體積和上樣液體積。

1.3 色譜條件

1.3.1 分析型 HPLC

色譜柱：Venusil XBP-C18 液相色譜柱（250 mm ×4.6 mm，5.0 μm）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：367 nm；進(jìn)樣量：20 μL；柱溫：常溫；流動相：甲醇- 0.5%(v/v)磷酸水溶液（58:42，v/v）。

1.3.2 制備型 HPLC

色譜柱：Venusil XBP-C18 液相色譜柱（250 mm ×21mm，5.0 μm）；流速：5.0 mL/min；檢測波長：367 nm；柱溫：常溫；流動相：甲醇- 0.5% (v/v)磷酸水溶液（58:42，v/v）[6]。

2 結(jié)果與討論

2.1大孔吸附樹脂純化高良姜黃酮類化合物的工藝

2.1.1 動態(tài)泄露曲線的繪制

稱取 100 g HPD-600 大孔吸附樹脂，95%乙醇浸泡 24 h 預(yù)處理，濕法裝柱[7]（直徑×高度： 400 mm ×26 mm，柱體積：200 mL），以 1.7 BV/h 上樣流速將濃度為 0.9 mg/mL 的高良姜黃酮粗提液進(jìn)柱，收集流出液，每 200 mL（1BV）為一份，紫外分光光度法在 367 nm 處測定流出液吸光度 A，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算流出液中高良姜總黃酮的濃度，繪制樹脂的泄漏曲線，考察樹脂動態(tài)吸附性能，確定泄漏點(圖 1)。

圖1 高良姜黃酮類化合物動態(tài)吸附泄漏曲線Fig.1Leak curve of dynamic adsorption

由圖1可見，高良姜黃酮類化合物流出液濃度變化呈 S 形曲線，在曲線的下拐點 12 BV 之前，流出液中高良姜總黃酮含量濃度小于 0.05 mg/mL 且基本保持不變。12 BV 之后，隨著高良姜黃酮類化合物流出液體積不斷增大，流出液的濃度也不斷增加，到達(dá)上拐點 23 BV 時，收集流出液中高良姜總黃酮含量濃度為 0.36 mg/mL，此時，樹脂吸附趨于飽和。通常將下拐點稱為泄漏點，上拐點稱為飽和點（吸附液流出濃度達(dá)到上樣濃度的95%的點確定為飽和點）。在實際生產(chǎn)中，為確保生產(chǎn)效益，吸附柱有效工作區(qū)一般控制在泄漏點之前，因此，本實驗確定流出液濃度達(dá)到 0.05 mg/mL 時為吸附泄漏點。

2.1.2 洗脫流速的選擇

將高良姜供試液 0.9 mg/mL，體積為 3 000 mL以上樣流速為 1.7 BV/h 進(jìn)行動態(tài)吸附，待吸附達(dá)到泄漏點，靜置 5 min 后用蒸餾水洗脫 30 min，除去蛋白質(zhì)、多糖等雜質(zhì)。對吸附達(dá)到泄漏點的吸附柱用 85%的乙醇水溶液進(jìn)行洗脫[8]，洗脫流速分別為1.5 BV/h，1.0 BV/h，0.5 BV/h，洗脫液每 20 mL 收集一份，利用紫外分光光度法在 367 nm 處測定收集液吸光度 A，并計算解析率(圖 2)。

圖2 不同洗脫流速動態(tài)洗脫曲線Fig.2 Dynamic elution curve of different eluted flow rate

洗脫流速一般都要求較慢，這是因為流速過快，洗脫性能差，洗脫帶寬，且拖尾現(xiàn)象嚴(yán)重，造成洗脫不完全，但流速過慢，會使周期延長。常用的洗脫流速是吸附流速的 1/3～1/2，故本實驗用 85%乙醇溶液，洗脫流速分別為 1.5 BV/h，1.0 BV/h，0.5 BV/h 來考察洗脫流速對洗脫效果的影響，結(jié)果如圖2 所示。從圖 2 可以看出，以 0.5 BV/h 的洗脫流速進(jìn)行洗脫得到的洗脫峰峰形最窄，且峰高最高，而1.0 BV/h 和 1.5B V/h 洗脫流速進(jìn)行洗脫的洗脫峰峰高較低，有拖尾現(xiàn)象且拖尾峰出現(xiàn)較早，因此選擇洗脫流速以 0.5 BV/h 為宜。

采用上述優(yōu)化后的工藝參數(shù)對高良姜黃酮粗提物進(jìn)行大孔吸附樹脂分離純化驗證實驗，即HPD-600 型大孔吸附樹脂在上樣濃度為 0.9 mg/mL，上樣流速為 1.7 BV/h，洗脫劑乙醇濃度為 85%，洗脫流速為 0.5 BV/h 的工藝參數(shù)下分離純化高良姜黃酮類化合物，純化后獲得高良姜黃酮純化品，純度為 93.56%，得率為 52.70%。

2.2 對照品的制備

取經(jīng)大孔吸附樹脂純化的高良姜黃酮溶于甲醇溶液配制濃度為 20.0 mg/mL，用制備高效液相色譜法分離，進(jìn)樣量為 600 μL，采用自動餾分收集器收集，收集保留時間為 40 min 后的流出液，每 1min收集一管，合并收集液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)進(jìn)行濃縮，將濃縮液冷凍干燥得黃色針狀結(jié)晶，185 mg(圖 3)。

圖3 山柰素對照品的制備 HPLC 圖譜Fig. 3preparative HPLC chromatogram of Kaempferide reference substance

2.3 對照品純度檢測

對照品經(jīng)分析型高效液相色譜檢測，歸一化法定量，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于 99.8%，見圖 4。

圖4 山柰素對照品的 HPLC 圖譜Fig.4 HPLC chromatogram of Kaempferide reference substance

2.4 結(jié)構(gòu)鑒定

2.4.1 紅外光譜分析

將山柰素標(biāo)準(zhǔn)品和山奈素對照品分別在 50℃真空干燥箱干燥 12 h 后，采用 KBr壓片法，按 1%的比例與KBr充分混合、研磨、壓片后置于紅外光譜儀上測試。掃描波數(shù)范圍為 4 000～400 cm-1，分辨率為 4 cm-1，采用 DTGS 檢測器，以空氣為空白，掃描 64 次后區(qū)平均值得到山奈素標(biāo)準(zhǔn)品和山柰素對照品的紅外光譜圖，如圖5所示。

從圖5可以看到，山柰素對照品和山奈素標(biāo)準(zhǔn)品的紅外光譜特征吸收峰相同，3 288 cm-1為-OH特征峰；1665 cm-1為 C=O 特征吸收峰，1602 cm-1，1560，1511，1439 cm-1是芳環(huán)的骨架伸縮振動特征峰；1171cm-1為芳香醚特征吸收峰。

圖5 山柰素對照品和山柰素標(biāo)準(zhǔn)品的紅外光譜圖Fig.5 FTIR spectrum of Kaempferide reference substance and Kaempferide

2.4.2 質(zhì)譜和核磁共振分析

制備得山柰素對照品分別溶解于甲醇和氘代DMSO 中做質(zhì)譜分析（ESI-MS）和核磁共振分析，經(jīng) ESI-MS 檢測鑒定，得山柰素對照品相對分子質(zhì)量為 299.3，見圖 6 所示。

圖6 山柰素對照品的一級質(zhì)譜圖Fig.6 ESI-MS spectrum of Kaempferide reference substance

氫譜和碳譜核磁數(shù)據(jù)歸屬如下：1H-NMR(DMSO-d6)：3.8(3H，s，-OCH3)，6.2（1H，d，J=2.0Hz，H-6）6.4(1H，d，J=2.0Hz，H-8)，7.1(2H，d，J=9.5Hz，H-3′，5′)，8.1(2H，d，J=9Hz，H-2′，6′)，9.5（1H，s，OH-3），10.8（OH-7），12.4（1H，s，OH-5）。13C-NMR（DMSO-d6）：146.7（C-2），136.5（C-3），176.5（C-4），156.7（C-5），98.7（C-6），164.5（C-7），94.0（C-8），161.2（C-9），103.6（C-10），123.7（C-1′），129.8（C-2′），114.5（C-3′），160.9（C-4′），114.5（C-5′），129.8（C-6′），55.8（-OCH3）。

以上光譜數(shù)據(jù)與山柰素譜圖數(shù)據(jù)基本一致[9,10]，所得化合物為山柰素。

3 結(jié) 論

本文確立了利用大孔吸附樹脂和制備型高效液相色譜相結(jié)合從高良姜中制備山柰素對照品的方法，具有分離條件簡單，操作高效、快速等優(yōu)點，且樹脂可重復(fù)使用，降低生產(chǎn)成本。制備出的山柰素對照品純度高，該方法為制備山柰素對照品提供了一條可行的思路。

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Study onpreparation of Kaempferide Reference Substance From Alpinia officinarum Hance

HOU Hong-rui1, CHEN Ling2, WANG Chun-xiao1, SUN Guo-yong1, ZHANG Xiao-feng1
（1. Maomingpolytechnic, Guangdong Maoming 525000，China；2. School of Food Science and Engineering, South China University of Technology, Guangdong Guangzhou 510640，China）

Apreparation method of kaempferide reference substance from Alpinia officinarum Hance was established; the extract from Alpinia officinarum Hance was isolated andpurified by adsorption resin andpreparative HPLC. The structure of kaempferide reference substance was identified by IR, MS and NMR. Thepurity of theproduct was quantitated by analytical HPLC area normalization method, the mass fraction was above 99.8%. This method is effective forpreparation of kaempferide with highpurity. It can be used toprepare the reference substances for the quantitative analysis of Chinese materia medica.

Kaempferide; Alpinia- officinarum Hance; Reference substance;preparation

TQ 000

： A

： 1671-0460（2017）02-0243-03

茂名市科技計劃項目，項目號：[2015]14 號。

2016-10-12

侯紅瑞（1984-），女，寧夏固原市人，講師，碩士，2008 年畢業(yè)于華南理工大學(xué)制糖工程專業(yè)，研究方向：天然產(chǎn)物的研究與開發(fā)。E-mail：sherysky@163.com。