王奕允，任 娟，李樹(shù)奇，孔祥蕾,2*

(1.南開(kāi)大學(xué) 元素有機(jī)化學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300071;2.天津化學(xué)化工協(xié)同創(chuàng)新中心，天津 300071)

氨基酸-磷酸非共價(jià)復(fù)合物離子的電噴霧電離質(zhì)譜研究

王奕允1，任 娟1，李樹(shù)奇1，孔祥蕾1,2*

(1.南開(kāi)大學(xué) 元素有機(jī)化學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300071;2.天津化學(xué)化工協(xié)同創(chuàng)新中心，天津 300071)

分子間的非共價(jià)相互作用對(duì)于理解分子復(fù)合物的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)有著非常重要的意義。而電噴霧電離質(zhì)譜(ESI-MS)是團(tuán)簇化學(xué)研究的一種重要工具，廣泛用于重要生物分子復(fù)合物的形成和性質(zhì)研究，包括氨基酸、多肽和核糖等。該文將一定化學(xué)劑量比的磷酸分別與L型精氨酸和L型色氨酸混合，通過(guò)電噴霧電離的方法，利用傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜儀對(duì)精氨酸-磷酸以及色氨酸-磷酸的非共價(jià)復(fù)合物離子進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示，精氨酸和色氨酸均可與磷酸分子產(chǎn)生種類豐富、價(jià)態(tài)為+1和+2的復(fù)合物離子。而對(duì)不同體系的生成離子分布進(jìn)行分析，則顯示出不同體系間的差別。

非共價(jià)復(fù)合物;電噴霧電離(ESI);精氨酸；色氨酸；磷酸

分子間相互作用是分子識(shí)別和組裝的基礎(chǔ)。因此,非共價(jià)復(fù)合物的檢測(cè)、分析和相關(guān)研究近年來(lái)已成為被廣泛關(guān)注的科學(xué)問(wèn)題[1-12]。其中，軟電離方法在一定條件下可使非共價(jià)復(fù)合物離子在氣相中直接被檢測(cè),從而可得到與化學(xué)計(jì)量比、結(jié)合能等相關(guān)的分子復(fù)合物信息[1-3]。由于氣相中生成非共價(jià)化合物，不受溶劑作用的影響，因此相關(guān)體系中的內(nèi)在氫鍵、靜電相互作用和疏水相互作用可以得到更加清楚的顯示。作為一種非常重要的軟電離方法，電噴霧電離(ESI)是研究分子相互作用的一種重要工具，近年來(lái)已被廣泛用于重要生物分子復(fù)合物的形成和性質(zhì)研究[1-12]。ESI在研究生物分子非共價(jià)相互作用的過(guò)程中，面臨的一個(gè)重要問(wèn)題是如何盡可能使非共價(jià)相互作用在離子化的過(guò)程中得以保留和最大程度上不被破壞。盡管當(dāng)前學(xué)術(shù)界對(duì)此問(wèn)題仍存在爭(zhēng)議[1-2]，但被普遍接受的觀點(diǎn)是：一方面，溶劑的組成、表面張力以及pH 值均會(huì)對(duì)分子間的相互作用有較大影響；另一方面，電噴霧電離過(guò)程中使用的實(shí)驗(yàn)參數(shù)(如電場(chǎng)強(qiáng)度、溫度等)也會(huì)有所影響。為使實(shí)驗(yàn)中所獲得的復(fù)合物離子更接近于其溶液狀態(tài)，一般采用兩種相對(duì)應(yīng)的方法：①使電噴霧溶劑的條件盡可能接近于生理?xiàng)l件，以及盡量減少有機(jī)溶劑的比例，避免過(guò)低或過(guò)高的pH值；②盡量采用溫和的ESI實(shí)驗(yàn)條件，如相對(duì)較低的加熱溫度，以及避免使用過(guò)高的電壓等。

基于氨基酸分子在生物體系中的重要性，氨基酸分子與多種藥物小分子、金屬離子以及氨基酸分子本身之間的相互作用已被廣泛研究[10-18]。如渠琛玲等[10]用電噴霧軟電離技術(shù)研究了人參皂苷與多種氨基酸的非共價(jià)相互作用,并研究了這些非共價(jià)復(fù)合物的解離常數(shù)。儲(chǔ)艷秋等[11]利用ESI質(zhì)譜對(duì)谷胱甘肽和L型芳香性氨基酸形成的非共價(jià)復(fù)合物進(jìn)行了細(xì)致的研究。申睿等[12]則利用電噴霧飛行時(shí)間質(zhì)譜研究了氨基化環(huán)糊精多種氨基酸所形成的包絡(luò)物，通過(guò)比較結(jié)合常數(shù)的大小,探討了氨基化環(huán)糊精與氨基酸的作用方式。本課題組也對(duì)氨基酸分子本身形成的非共價(jià)復(fù)合物離子的結(jié)構(gòu)和光譜進(jìn)行了比較系統(tǒng)的研究[13-17]。

本課題組的前期研究表明，磷酸分子極易與絲氨酸分子形成種類繁多的非共價(jià)復(fù)合物離子[18]。隨著復(fù)合物離子尺寸的變化，它們?cè)谂鲎草o助解離過(guò)程發(fā)生的解離通道也會(huì)發(fā)生變化。本文分別對(duì)精氨酸和色氨酸與磷酸分子在電噴霧電離過(guò)程中形成的復(fù)合物離子以及離子的分布進(jìn)行了研究，從而為進(jìn)一步理解磷酸分子在相關(guān)分子復(fù)合物的形成以及結(jié)構(gòu)研究提供了基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

精氨酸(Arg)、色氨酸(Trp)純度為99%，購(gòu)于Sigma公司；甲醇(J.T.Baker公司)，乙酸(色譜純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)。首先配制20×10-3mol/L的精氨酸/色氨酸溶液與100×10-3mol/L的磷酸溶液，實(shí)驗(yàn)前將其分別稀釋至1 mL的溶劑比為49∶49∶2的H2O∶MeOH∶CH3COOH混合溶液中，最終分別配成濃度為1×10-3mol/L精氨酸/色氨酸與5×10-3mol/L磷酸的混合溶液。

所有的質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)均在7.0T傅立葉變換離子回旋共振(FT ICR)質(zhì)譜儀上進(jìn)行(IonSpec,Varian,Lake Forest,CA,USA)。實(shí)驗(yàn)中所有離子均通過(guò)電噴霧電離(ESI)離子源產(chǎn)生。其中ESI源噴針的電壓為3.6 kV。為使ESI電離過(guò)程比較溫和，實(shí)驗(yàn)中源內(nèi)加熱溫度設(shè)置為60 ℃，低于一般ESI實(shí)驗(yàn)中采用的80 ℃。樣品溶液的流速為240 μL/h。ESI產(chǎn)生的離子經(jīng)過(guò)不同的真空區(qū)域后，最終被引入到FT ICR分析池中進(jìn)行檢測(cè)。質(zhì)譜檢測(cè)均采用正離子模式,探測(cè)范圍為：m/z200～2 500。

2 結(jié)果與討論

2.1 精氨酸-磷酸復(fù)合物離子

圖1A顯示了磷酸與精氨酸混合溶液的電噴霧質(zhì)譜圖。從質(zhì)譜圖中可以看出混合溶液在電噴霧的過(guò)程中產(chǎn)生了多種豐富的復(fù)合物離子。其中豐度最高的離子峰來(lái)自于精氨酸三聚體Arg3H+(m/z523.333)。而在m/z為600～2 500內(nèi)產(chǎn)生的大量離子可歸屬為精氨酸-磷酸復(fù)合團(tuán)簇離子，其中豐度較高有[Arg4+(H3PO4)4+H1]1+(m/z1 089.360),[Arg4+(H3PO4)5+H1]1+(m/z1 187.337)和[Arg5+(H3PO4)6+H1]1+(m/z1 459.426)。借助FTICR質(zhì)譜儀的高分辨和高精度的測(cè)量，95%以上的離子峰均可被精確地指認(rèn)出來(lái)，均可表示為[Argm+(H3PO4)n+Hk]k+(簡(jiǎn)稱RmPnHkk+)的結(jié)構(gòu)形式。值得注意的是，一價(jià)復(fù)合物離子RmPnH11+與二價(jià)復(fù)合物離子R2mP2nH22+的單同位素峰具有相同的質(zhì)荷比。例如,質(zhì)荷比為1 187.337的峰，既可以認(rèn)為是R4P5H11+的同位素峰，也可歸為R8P10H22+的同位素峰。但利用離子的同位素分布和數(shù)據(jù)擬合可對(duì)其進(jìn)行分析和確認(rèn)。如圖2所示,通過(guò)數(shù)據(jù)擬合可以確認(rèn)實(shí)驗(yàn)中觀察到的質(zhì)荷比為1 187.337的峰實(shí)際上為R4P5H11+和R8P10H22+的混合峰，兩者所占的比例分別為82%和18%。

通過(guò)對(duì)圖1A中的數(shù)據(jù)進(jìn)行仔細(xì)分析、比對(duì)和歸屬，可將所觀察到的離子按照其電荷數(shù)進(jìn)行分類。圖3A和3B分別為其一價(jià)和二價(jià)復(fù)合物離子的分布圖。對(duì)于一價(jià)復(fù)合物離子，根據(jù)其精氨酸分子數(shù)的不同，將其分為7個(gè)系列。整個(gè)譜圖中存在R1-7PnH11+的信號(hào)，其中R4P1-8H11+,R5P1-9H11+與R6P1-12H11+三個(gè)系列具有較高的豐度。在不考慮精氨酸二聚體離子的情況下，這些系列的信號(hào)隨著磷酸數(shù)目的增加呈現(xiàn)近高斯分布。其中豐度最高的離子峰依次為R4P5H11+,R5P6H11+與R6P7H11+。這表明當(dāng)磷酸分子數(shù)比精氨酸分子數(shù)多1時(shí)，一價(jià)離子更穩(wěn)定。對(duì)于二價(jià)復(fù)合物離子，譜圖中可以看到7個(gè)系列的R8-14PnH22+(圖3B)。其中各系列相應(yīng)的最高峰依次為：R8P9H22+，R9P10H22+，R10P11H22+，R12P15H22+，R13P16H22+和R14P16H22+。值得注意的是，與之前報(bào)道的絲氨酸-磷酸復(fù)合物離子相比[18]，體系中產(chǎn)生的三價(jià)復(fù)合物離子信號(hào)非常弱，基本可以忽略。

圖2 實(shí)驗(yàn)中觀察到的m/z為1 187.337離子的峰圖及其同位素分布(A)，離子R4P5H11+的理論計(jì)算質(zhì)譜圖(B)，離子R8P10H22+的理論計(jì)算質(zhì)譜圖(C)，混合離子R4P5H11+(82%)與R8P10H22+(18%)的模擬質(zhì)譜圖(D)Fig.2 Experimental isotopic distribution of the ions with the isotopic peak at m/z 1 187.337(A),and theoretical isotopic distributions of R4P5H11+(B),R8P10H22+(C) and a mixture of R4P5H11+(82%) and R8P10H22+(18%)(D)

2.2 色氨酸-磷酸復(fù)合物離子

圖1B為色氨酸與磷酸混合溶液的電噴霧質(zhì)譜圖。與精氨酸類似，圖中也顯示出許多色氨酸與磷酸團(tuán)簇離子的信號(hào)。豐度較高的是色氨酸與磷酸產(chǎn)生的團(tuán)簇離子[Trp3+(H3PO4)12+H1]1+(m/z1 789.073)(簡(jiǎn)寫(xiě)為W3P12H11+),W3P13H11+(m/z1 887.053)等。與精氨酸體系相比，未觀察到三價(jià)復(fù)合物離子。與精氨酸情況類似，其中一些離子峰是一價(jià)復(fù)合物離子WmPnH11+與二價(jià)復(fù)合物離子W2mP2nH22+的混合。例如:質(zhì)荷比1 495.134的同位素峰，是W3P9Hkk+(73%)和W6P18Hkk+(17%)的混合。為了使整個(gè)質(zhì)譜圖更易讀取，并便于分析和研究，對(duì)圖1B中的復(fù)合物離子也進(jìn)行了詳細(xì)歸類，其結(jié)果顯示在圖4中。圖4A和B分別展示了一價(jià)和二價(jià)的色氨酸與磷酸形成的復(fù)合物離子。根據(jù)色氨酸分子數(shù)的不同，將一價(jià)復(fù)合物離子分為3個(gè)系列W2-4PnH11+，其中強(qiáng)度最高的離子峰依次為：W2P11H11+,W3P12H11+,W4P9H11+。對(duì)于二價(jià)復(fù)合物離子而言，譜圖中可以看到5個(gè)系列的W2-6PnH22+，這些系列的信號(hào)隨著磷酸數(shù)目的增多呈現(xiàn)近似的高斯分布，相應(yīng)的最高峰依次為：W3P24H22+,W4P22H22+,W5P21H22+,W6P20H22+和W7P23H22+。

2.3 討 論

圖1的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與絲氨酸-磷酸混合溶液的質(zhì)譜相似[18]，精氨酸和色氨酸與磷酸混合溶液在電噴霧電離的過(guò)程中，也能產(chǎn)生豐富的基于氨基酸和磷酸分子的復(fù)合物離子。這些離子主要為一價(jià)離子和二價(jià)離子。這一結(jié)果反映了磷酸分子非常容易與多種氨基酸分子形成種類豐富的分子復(fù)合物。這主要?dú)w因于磷酸分子在形成氫鍵的過(guò)程中，既可以給予質(zhì)子，又可以成為質(zhì)子的受體，因此極易與氨基酸分子或它本身形成復(fù)雜的氫鍵網(wǎng)絡(luò)。

盡管如此，實(shí)驗(yàn)結(jié)果也反映了不同體系中存在一定的差別，主要體現(xiàn)在復(fù)合物離子的尺寸和組成分布上。對(duì)于一價(jià)復(fù)合物離子，絲氨酸-磷酸復(fù)合物離子中豐度較高的離子一般包含磷酸單元的數(shù)目約為絲氨酸單元數(shù)目的兩倍[18]。而精氨酸-磷酸復(fù)合物離子中豐度較高的離子一般包含數(shù)目接近的精氨酸單元和磷酸單元。對(duì)于色氨酸，其包含的磷酸單元也較多。如對(duì)于包含4個(gè)氨基酸離子的一價(jià)復(fù)合物離子，對(duì)于絲氨酸、精氨酸和色氨酸，觀察到相應(yīng)系列中最高豐度的離子分別為S4P9H11+，R4P5H11+和W4P9H11+。對(duì)于二價(jià)復(fù)合物離子，絲氨酸-磷酸復(fù)合物中豐度較高的離子一般包含磷酸單元的數(shù)目較絲氨酸單元數(shù)目多4個(gè)，但不及兩倍。而精氨酸-磷酸復(fù)合物中豐度較高的離子包含精氨酸單元和磷酸單元仍非常接近。但對(duì)于色氨酸，情況更不同，其包含的磷酸單元?jiǎng)t遠(yuǎn)大于色氨酸單元的數(shù)目。另一方面，從總體上看，無(wú)論是一價(jià)或二價(jià)離子，所形成的復(fù)合物中包含的色氨酸數(shù)目明顯少于絲氨酸和精氨酸。盡管實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)生的復(fù)合物離子會(huì)受實(shí)驗(yàn)條件(如溶液條件、電離源參數(shù))的影響，但考慮到以上實(shí)驗(yàn)均在一臺(tái)設(shè)備上利用相同(或非常接近)的實(shí)驗(yàn)條件完成，因此結(jié)果仍具有較好的可比性。這些區(qū)別體現(xiàn)了不同氨基酸分子與磷酸分子相互作用時(shí)形成的氫鍵的差別，同時(shí)也反映出庫(kù)侖相互作用也會(huì)對(duì)復(fù)合物結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，使得形成的復(fù)合物離子也與氨基酸分子本身的結(jié)構(gòu)和極性密切相關(guān)。

上述研究結(jié)果顯示了磷酸分子易于與精氨酸或色氨酸分子通過(guò)氫鍵網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建形成種類豐富的分子復(fù)合物。盡管這些復(fù)合物的具體結(jié)構(gòu)有待于進(jìn)一步研究，但可以預(yù)測(cè)的是質(zhì)子的轉(zhuǎn)移在復(fù)合物的構(gòu)建、分解和異構(gòu)化過(guò)程中將占有非常重要的作用。而對(duì)于不同的氨基酸，其動(dòng)力學(xué)過(guò)程也會(huì)有較大的區(qū)別。同時(shí)，當(dāng)氨基酸分子與多個(gè)磷酸分子形成復(fù)雜的復(fù)合物時(shí)，其氨基和羧基端均與磷酸分子形成較強(qiáng)的氫鍵，在一定程度上會(huì)對(duì)氨基酸分子的活性和反應(yīng)性有較大的影響。由于磷酸鹽的緩沖液被廣泛應(yīng)用于生物分子的研究中，這些研究結(jié)果也可為相關(guān)條件下氨基酸分子的物理化學(xué)性質(zhì)變化提供有價(jià)值的線索。

3 結(jié) 論

本文通過(guò)電噴霧電離的方法在傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜儀上得到了精氨酸/色氨酸與磷酸產(chǎn)生的復(fù)合物離子。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，精氨酸/色氨酸與磷酸可以產(chǎn)生豐富的多價(jià)態(tài)復(fù)合物離子RmPnHkk+和WmPnHkk+，通過(guò)對(duì)不同價(jià)態(tài)復(fù)合物離子的分析，歸納出各自的分布規(guī)律。但對(duì)這些復(fù)合物離子的結(jié)構(gòu)以及隨尺寸變化可能引起的結(jié)構(gòu)變化仍有待于進(jìn)一步的研究。

[1] Loo J A.Int.J.Mass.Spectrom.,2000,200:175-186.

[2] Hofstadler S A,Sannes-Lowery K A.NatRevDrugDiscov.，2006,5:585-595.

[3] Zhang R P,Abliz Z.J.Instrum.Anal.(張瑞萍,再帕爾·阿不力孜.分析測(cè)試學(xué)報(bào)),2005,24(1):117-122.

[4] Liu Q,Zhang S Z,Wu B D,Shen R,Yun L H,Xie J W.J.Chin.MassSpectrom.Soc.(劉勤,張淑珍,吳弼東,申睿,惲榴紅,謝劍煒.質(zhì)譜學(xué)報(bào)),2005,26(1):51-58.

[5] Li R,Ren H P,Sun Y T,Yao Y Y,Lu K,Ma L.Chin.J.Anal.Chem.(李銳,任海平,孫艷亭,姚英艷,盧奎,馬麗.分析化學(xué)),2006,34(12):1801-1806.

[6] Cao Y,Han F M,Chen Y.ActaPharm.Sin.(曹燚,韓鳳梅,陳勇.藥學(xué)學(xué)報(bào)),2007,4:408-412.

[7] Wang Z F,Song F R,Liu Z Q,Liu S Y.J.Chin.MassSpectrom.Soc.(王兆伏,宋鳳瑞,劉志強(qiáng),劉淑瑩.質(zhì)譜學(xué)報(bào)),2010,31(3):129-137.

[8] Hu W B,Wang F Y.J.Chin.MassSpectrom.Soc.(胡文兵,汪福意.質(zhì)譜學(xué)報(bào)),2010,31(6):354-361.

[9] Xu L S,Yang H M,Cui M,Song F R,Liu Z Q,Liu S Y.Chem.J.Chin.Univ.(徐牛生,楊洪梅,崔勐,宋鳳瑞,劉志強(qiáng),劉淑瑩.高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào)),2012,11:2430-2434.

[10] Qu C L,Zhang H Q,Zhang H R,Bai Y P,Wen H.Chem.J.Chin.Univ.(渠琛玲,張寒琦,張華蓉,白雨萍,溫慧.高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報(bào)),2008,9:1721-1726.

[11] Chu Y Q,Dai Z Y,Jiang G Y,Zheng S B,Chen X,Ding C F.Chem.J.Chin.Univ.(儲(chǔ)艷秋,戴兆云,蔣公羽,鄭松柏,陳璽,丁傳凡.高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào)),2009,5:869-875.

[12] Shen R,Wu B D,Liu Q,Gu M S,Xie J W.Chin.J.Anal.Chem.(申睿,吳弼東,劉勤,顧明松,謝劍煒.分析化學(xué)),2006,34(8):1153-1156.

[13] Kong X L.J.Am.Soc.Mass.Spectrom.,2014,25:422-426.

[14] Liao G H,Yang Y J,Li S Q，Kong X L.Mod.Sci.Instrum.(廖冠華，楊一潔，李樹(shù)奇，孔祥蕾.現(xiàn)代科學(xué)儀器),2014,156:29-32.

[15] Yin H,Kong X L.J.Am.Soc.MassSpectrom.,2015,26:1455-1461.

[16] Feng R X,Mu L,Yang S,Kong X L.Chin.Chem.Lett.,2016,27:593-596.

[17] Feng R X,Yin H,Kong X L.RapidCommun.MassSpectrom.,2016,30(S1):24-28.

[18] Kong X L.J.MassSpectrom.,2011,46:535-545.

Investigation of Noncovalent Complexions of Amino Acids and Phosphoric Acid by Electrospray Mass Spectrometry

WANG Yi-yun1,REN Juan1,LI Shu-qi1,KONG Xiang-lei1,2*

(1.State Key Laboratory and Institute of Elemento-Organic Chemistry,Nankai University,Tianjin 300071,China;2.Collaborative Innovation Center of Chemical Science and Engineering(Tianjin),Tianjin 300071,China)

Intermolecular noncovalent interaction is very important for understanding structures and properties of molecular complexes and clusters.Electrospray ionization mass spectrometry(ESI-MS) has demonstrated its powerful utility in the detection and research of weakly bound complex ions,including amino acids,peptides and proteins.In this paper,the noncovalent complex ions of arginine and tryptophan with phosphoric acid were investigated by ESI-MS method.The experiments were performed on a Fourier transform ion cyclotron resonance(FT ICR) mass spectrometer.The results showed that for both systems,wide varieties of noncovalent complex ions were generated and detected in the mass spectra.Most of these complex cations are singly or doubly charged,including both units of amino acid and phosphoric acid.The differences among different systems are also reflected by the distributions of the formed complex ions.

noncovalent complex;electrospray ionization(ESI);arginine;tryptophan;phosphoric acid

2016-10-04；

2016-11-15

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(21475065)

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.02.007

O657.63;O629.7

A

1004-4957(2017)02-0196-05

*通訊作者：孔祥蕾，博士，副研究員，研究方向：基于質(zhì)譜和紅光光譜的氣相離子化學(xué),Tel:022-23509564，E-mail:kongxianglei@nankai.edu.cn