柯曉靜，于宏偉，郭潤芳

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北保定071000）

“藏靈菇”酸乳中優(yōu)勢乳酸菌的分離鑒定

柯曉靜，于宏偉，郭潤芳*

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北保定071000）

利用碳酸鈣平板法從藏靈菇菌塊為發(fā)酵劑制備的發(fā)酵酸乳中分離到2株產(chǎn)酸細菌，對其進行形態(tài)、生理生化測定及16S rRNA序列分析。結(jié)果表明，發(fā)酵凝乳中的這兩株優(yōu)勢乳酸菌是乳酸乳球菌乳酸亞種。本研究結(jié)果為開發(fā)穩(wěn)定的優(yōu)良發(fā)酵劑提供菌種資源，并為進一步研究藏靈菇酸奶的保健功能奠定基礎(chǔ)。

藏靈菇；優(yōu)勢菌；乳酸菌；分離鑒定；16SrRNA

藏靈菇菌是一種民間廣為流傳的天然發(fā)酵劑，外形酷似米粒，乳白色、膠質(zhì)狀，上面棲息著多種微生物。將藏靈菇在牛奶中培養(yǎng)，體積會增大很多，形狀如盛開的雪蓮[1]，所以有人稱之為西藏雪蓮。長期飲用其泡過的牛奶，可以調(diào)整腸內(nèi)菌群，改善人體胃腸環(huán)境，增強免疫力，補充維生素。藏靈菇有良好的發(fā)酵特性，它與傳統(tǒng)的酸奶或用其他純種乳酸菌發(fā)酵劑制成的產(chǎn)品有很大不同，最顯著的特征是除乳酸發(fā)酵外，還伴有輕微的由酵母菌引起的酒精發(fā)酵，是一種集酸味、醇味為一體的新型發(fā)酵乳制品[2]。

“藏靈菇”雖然在民間流行很久，可是一直很少有專業(yè)人員對其進行研究，藏靈菇酸奶是一種自然發(fā)酵乳，菌相多樣，發(fā)酵原理跟開菲爾粒相似。在整個發(fā)酵周期中優(yōu)勢菌體是在變化的，由于發(fā)酵乳風(fēng)味獨特，所以不被有些人接受。因此，了解靈菇菌的構(gòu)成、發(fā)酵優(yōu)勢菌群以及發(fā)酵代謝產(chǎn)物，才能改進發(fā)酵方式，改善風(fēng)味，使靈菇酸奶走進市場。劉宇峰等研究了藏靈菇菌體中的菌相，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，藏靈菇菌是以2種真菌和3種乳酸菌為主體構(gòu)成的塊狀共生菌系，酵母假絲和營養(yǎng)體構(gòu)成菌塊中，乳酸菌分布在菌塊外周[3]。利用藏靈菇作為發(fā)酵劑，可能存在復(fù)雜的牛乳發(fā)酵過程。本研究以實驗室保存的“藏靈菇”做為發(fā)酵劑對脫脂奶進行發(fā)酵，并從發(fā)酵后的凝乳中分離出優(yōu)勢乳酸菌，，并進行生理生化和16SrRNA的分子檢測，為了解靈菇菌發(fā)酵凝乳過程，開發(fā)穩(wěn)定的酸奶優(yōu)良發(fā)酵劑，進行工業(yè)化生產(chǎn)靈菇酸奶提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 藏靈菇菌塊

藏靈菇菌塊為河北農(nóng)業(yè)大學(xué)發(fā)酵食品實驗室保藏。將藏靈菇用無菌水沖洗干凈后，整體菌塊呈乳白色，并有顆粒狀突起，用手捏有彈性，拉伸有絲狀物相連。

1.1.2 菌株培養(yǎng)條件

靈菇菌塊放置在10%脫脂乳培養(yǎng)基（115℃滅菌15min）中，37℃培養(yǎng)，用于活化菌株及制備發(fā)酵酸乳。乳酸菌分離采用含CaCO3的MRS培養(yǎng)基。大腸桿菌E.coli JM109生長在LB培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)。

1.1.3 試劑

生理生化檢測管：北京路橋公司；限制性內(nèi)切酶NotⅠ、EcoRⅠ、Taq DNA聚合酶、T4DNA連接酶、pMD18-T、DNA Marker2000、IPTG、X-Gal、gold view：TaKaRa公司產(chǎn)品；UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒、氨芐青霉素：北京天澤公司；PCR引物合成與測序由華大基因公司完成。

1.2 試驗方法

1.2.1 乳酸菌的分離純化

乳酸菌的分離參照《乳酸細菌分類鑒定及實驗方法》[4]。把藏靈菇接種到脫脂乳培養(yǎng)基中，凝乳后吸取1mL的凝固乳稀釋到10-9，取各稀釋度1mL采用傾注法接種于冷卻到60℃的含CaCO3的MRS培養(yǎng)基中，放于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至長出透明圈。

1.2.2 顯微形態(tài)、生理生化測定

挑取產(chǎn)生透明圈的菌落在MRS培養(yǎng)基中劃線純化，觀察純化后單菌落的特征與個體顯微形態(tài)，并做H2O2酶試驗、革蘭氏染色及生理生化實驗測試，以河北農(nóng)業(yè)大學(xué)發(fā)酵食品實驗室保存的嗜熱鏈球菌保加利亞乳桿菌做對照。

生命體征（體溫、心率、呼吸、血壓）及實驗室檢查（血常規(guī)、尿常規(guī)、肝腎功能及心電圖）的組間比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，實驗室相關(guān)的異轉(zhuǎn)率的組間比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。

1.2.3 乳酸菌16s rRNA基因的擴增

采用液氮凍融-CTAB法提取乳酸菌基因組DNA[5]。以提取的基因組DNA為模板，以通用引物為特異性上下游引物進行PCR擴增。正向引物為PLs：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；反向引物為PLa：5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3'。

PCR反應(yīng)體系為：10×PCR緩沖液（含Mg2+）2.5μL，dNTP混合物（2.5mmol/L）2μL，PLs（10mmol/L）1.0μL，PLa（10mmol/L）1.0μL，基因組DNA 1.0μL，Taq酶（2.5U/μL）0.5μL，補充ddH2O至25μL反應(yīng)總體積。

PCR循環(huán)條件為：94℃5min，94℃30 s，55℃30 s，72℃90 s，30個循環(huán)后，于72℃延伸10min。

用UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒回收并純化PCR產(chǎn)物，將回收純化后的PCR基因片段與pMD-18T載體連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入JM109感受態(tài)細胞中，并利用藍白斑篩選出陽性克隆，并對其進行菌液PCR和質(zhì)粒雙酶切驗證。

將驗證為陽性的質(zhì)粒送去華大基因公司進行測序，將測序結(jié)果在NCBI上進行比對，并下載相似序列做同源樹[6]。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的分離

2.2 乳酸菌的顯微形態(tài)

革蘭氏染色后油鏡觀察（圖1）。

圖1 菌株的顯微形態(tài)觀察Fig.1 Cell morphologies of strain

由圖1可知，菌株SNR-6和SNR-8均為革蘭氏染色陽性，圓形或球桿細胞直徑為0.7μm，成對或成串存在。二者顯微形態(tài)一致。

2.3 乳酸菌基因組16s rRNA擴增與序列比對

以提取的乳酸菌SNR-6和SNR-8的基因組DNA為模板，以16s rRNA通用引物為特異性上下游引物進行PCR擴增，擴增結(jié)果見圖2。瓊脂糖電泳顯示PCR擴增產(chǎn)物條帶為1 500 bp左右，大小與目的條帶一致。

圖2 16s rRNA的擴增片段Fig.2 Fragment of 16S rRNA

提取陽性克隆質(zhì)粒，并進行酶切驗證，酶切結(jié)果如圖3所示，質(zhì)粒DNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和NotⅠ消化后，酶切產(chǎn)物出現(xiàn)兩條片段（圖3），較小的一條為目的帶（大約1 500 bp），較大的為載體帶（大約2 700 bp），可以確定目的基因已經(jīng)插入載體中。

圖3 重組質(zhì)粒的酶切驗證Fig.3 Restriction analysis of recombinant plasmid

將質(zhì)粒送到華大基因公司進行測序，將所擴增SNR-6號和SNR-8號乳酸菌16S rRNA序列在Gen－Bank（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）中與乳酸菌已發(fā)表的16SrRNA基因序列進行同源序列搜索，以比較試驗菌株與已知菌株在相應(yīng)區(qū)域序列同源性。根據(jù)同源序列比對結(jié)果，下載相關(guān)菌種的16SrRNA基因序列，與試驗菌株一起用DNAMAN6.0軟件進行分析并做同源樹，測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)這兩株菌16SrRNA序列完全一致。

圖4 分離的乳酸菌與其它乳酸菌的同源樹Fig.4 Homologous tree of SNR-6with other Lactobacillus sp.

將結(jié)果遞交Genebank進行Blast，結(jié)果顯示與乳酸乳球菌的同源性最高，達100%；而與其它乳球菌和乳桿菌的同源性分別為99%、86%。因此可以初步判斷為乳酸乳球菌。乳酸乳球菌有3個亞種，分別為乳酸亞種，乳脂亞種和霍氏亞種，進一步做同源進化樹分析（圖4），結(jié)果發(fā)現(xiàn)分離得到的SNR-6和SNR-8菌株與3個亞種的同源性都高達100%。

2.4 乳酸菌的生理生化結(jié)果

為了進一步證實上述的結(jié)果并確定屬于哪個亞種，針對性地做了生長條件和生理生化測定，其最適生長溫度30℃，而45℃不生長，4.0%NaCl生長，6.0% NaCl不生長。糖發(fā)酵及其他生化指標結(jié)果見表1。經(jīng)生理生化進一步確定，SNR-6和SNR-8菌株測定結(jié)果一致，綜合形態(tài)、生理生化及16S rRNA比對結(jié)果，認為SNR-6和SNR-8菌株同為乳酸乳球菌乳酸亞種（Lactococcus lactis subsp.lactis）。

表1 鑒定乳酸乳球菌的生理和其它性狀Table1 Physiological-biochemistrical characteristics of SNR-6 and SNR-8

3 結(jié)論與討論

已有研究報道藏靈菇菌是以耐熱可魯維酵母、亞羅可魯維酵母和乳酸桿菌、嗜酸短乳桿菌和乳酸鏈球菌為主體構(gòu)成塊狀共生菌系，以酵母假絲和營養(yǎng)體構(gòu)成菌塊中心，乳酸菌分布在菌塊外周[7]。本研究從靈菇菌發(fā)酵凝乳后的酸奶中分離出優(yōu)勢乳酸菌為乳酸鏈球菌，說明凝乳過程中乳酸鏈球菌起了重要作用。這與其它報道的不盡相同，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院通過對150株分離自藏靈菇中的菌的PCR-DGGE指紋圖譜分析，獲得了8組乳酸菌和5組酵母菌，進一步的序列分析和相似性比較，確立了藏靈菇發(fā)酵奶中的優(yōu)勢菌為腸膜明串珠菌、乳酸乳球菌、開菲爾乳桿菌、干酪乳桿菌和克魯維酵母，單孢酵母、啤酒酵母、假絲酵母發(fā)酵后期成為優(yōu)勢菌[8]。分析本研究結(jié)果，推測優(yōu)勢乳酸菌數(shù)量較少的原因可能有兩個：第一，有些報道是從藏靈菇菌塊及其發(fā)酵乳中分離的，因此種類較多；第二，發(fā)酵凝乳過程中每個時期的優(yōu)勢菌體不一樣。本試驗只是對凝乳后的發(fā)酵乳進行了分離，屬于發(fā)酵后期，此時期發(fā)酵乳優(yōu)勢乳酸菌種類較少。下一步應(yīng)該對菌塊和整個發(fā)酵周期做認真的研究，這樣才能真正理解靈菇菌發(fā)酵凝乳過程，開發(fā)穩(wěn)定的酸奶優(yōu)良發(fā)酵劑，也可以盡早的將其進行產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。

[1]林麗萍,陳衛(wèi)平,羅秋水,等.藏靈菇增殖條件及發(fā)酵性能的研究[J].食品科技,2014,39(3):13-16

[2]羅章,陳歷俊,陳歷水,等.西藏乳及發(fā)酵乳制品中乳酸菌與酵母菌分布[J].食品工業(yè)科技,2013,34(11):392-395

[3]賀銀鳳.傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中乳酸菌和酵母菌的互作關(guān)系[J].中國乳品工業(yè),2010,38(10):43-45

[4]凌代文.乳酸細菌分類鑒定及實驗方法[M].北京:中國輕工業(yè)出版社,1999

[5]FM奧斯伯,RE金斯頓,JG塞德曼,等.精編分子生物學(xué)實驗指南[M].馬學(xué)軍譯.北京:科學(xué)出版社,2005:22-27

[6]王延祥,秦偉,李平蘭.利用16S rRNA序列鑒定分離自開菲爾粒的一株乳桿菌[J].中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2008,13(1):20-23

[7]夏菲.西藏靈菇復(fù)合發(fā)酵劑的研究[D].楊陵:西北農(nóng)林科技大學(xué), 2013

[8]周劍忠,董明盛,江漢湖.PCR-DGGE指紋技術(shù)與分離技術(shù)結(jié)合篩選藏靈菇奶發(fā)酵過程的優(yōu)勢菌[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2006,39(8): 1632-1638

Isolation and Identification of the Dominant Lactic Acid Bacteria in‘Tibetan Kefir’Yogurt

KE Xiao-jing，YU Hong-wei，GUO Run-fang*
（College of Food Science and Technology，Agricultural University of Hebei，Baoding071000，Hebei，China）

Two acid-producing bacteria were isolated from the yogurt prepared by fermentation agents of Tibetan kefir using calcium carbonate plate method.These two isolates were identified as Lactococcus lactis subsp. lactis based on the characterization of morphology，physiology and biochemistry，and 16S rRNA sequence analysis.The present research provide strain resources for fermentation agents，and also lay a foundation for further studying on health function of Tibetan kefir yogurt.

Tibetan kefir；dominant bacteria；lactic acid bacteria（LAB）；isolation and identification；16S rRNA

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.04.035

2016-05-23

柯曉靜（1980—），女（漢），助理研究員，博士，研究方向：食品科學(xué)。

*通信作者：郭潤芳（1969—），女，教授，主要研究方向：微生物資源開發(fā)與利用。