李麗霞，羅學平，何春雷

（1.宜賓職業(yè)技術學院生物與化工工程系，四川宜賓644003；2.四川省茶業(yè)科學與工程重點實驗室，四川成都611130；3.四川農業(yè)大學園藝學院，四川成都611130）

速溶綠茶酶促氧化工藝試驗研究

李麗霞1，2，羅學平1，何春雷2，3，*

（1.宜賓職業(yè)技術學院生物與化工工程系，四川宜賓644003；2.四川省茶業(yè)科學與工程重點實驗室，四川成都611130；3.四川農業(yè)大學園藝學院，四川成都611130）

利用茶鮮葉制得的茶葉多酚氧化酶復合酶，開展速溶綠茶酶促氧化研究。以速溶綠茶中兒茶素轉化率為指標，采用單因素試驗，考察酶液濃度、底物濃度、pH值、溫度和時間5個因素對速溶綠茶酶促氧化效果的影響，并通過正交試驗法優(yōu)化最佳酶促氧化條件。結果表明，速溶綠茶較優(yōu)的酶促氧化條件為：酶促反應體系中茶葉復合酶濃度為2.0%，速溶綠茶濃度為0.5%，反應體系pH3.5，溫度45℃，反應時間2.5 h。在此工藝參數下，兒茶素轉化率為34.79%。速溶綠茶酶促氧化產物在265、300、380 nm和460 nm附近有最大吸收峰，與紅茶中的茶色素吸收光譜一致。速溶綠茶酶促氧化產物中茶黃素含量達14.68%，顯著高于紅茶提取物。

速溶綠茶；酶促氧化；茶葉復合酶；兒茶素；茶色素

速溶綠茶是茶葉深加工的重要產物[1]，由低檔綠茶熱水浸提噴霧干燥制得[2-3]，成本低廉。速溶綠茶是瓶裝茶飲料的主要原料，其應用范圍相對單一。數據顯示，速溶綠茶的內含成分豐富，含有大量的茶多酚、兒茶素、氨基酸、咖啡堿等，尤其是茶多酚含量可達53.40%～72.07%[4]，是普通綠茶的3倍～4倍，因此，開展速溶綠茶深度加工和應用具有重要的價值。

茶多酚的主要氧化產物是茶黃素、茶紅素以及茶褐素等，總稱為茶色素[5-6]，具有重要的生理活性。研究表明，茶色素具較強的抗氧化功能和清除自由基的能力[7-8]。此外，茶色素能防治心臟病、高血壓、高血脂等心血管疾病[9-10]，還有較強的抗癌、抗腫瘤等作用[11-12]，已在臨床中應用[13]。

茶色素主要從紅茶中提取[14-15]，但是紅茶中的茶黃素含量較低，茶色素得率較低；或化學氧化高純度的茶多酚制得[5-6，16-17]，但存在原料成本高及副產物多等不足；或采用酶促氧化，即利用多酚氧化酶催化高純度的兒茶素氧化[17-18]，成本較高。因此，獲取茶黃素含量高、副產物少的茶色素已經成為了茶學、醫(yī)學和食品科學研究的重要課題。

因此，本研究以速溶綠茶為原料，以鮮葉中的多酚氧化酶復合酶為催化劑，酶促氧化制備茶色素，并對酶促氧化條件進行優(yōu)化，以期為茶色素的低成本、高產出提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

速溶綠茶：四川省茶業(yè)科學與工程重點實驗室提供，兒茶素總量為29.88%；茶葉復合酶：宜賓職業(yè)技術學院生物工程系實驗室自制。

JJ-2組織勻漿機（常州金壇）、THZ-82恒溫水浴振蕩器（常州智博瑞）、723分光光度計（上海精科）、UV2300紫外分光光度計（上海天美）、DZF-6050電熱恒溫真空干燥箱（上海一恒）、SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水真空泵（河南予華）、RE-52A旋轉蒸發(fā)儀（上海亞榮）。

香蘭素、乙酸乙酯、乙醇、濃鹽酸、無水硫酸鈉、檸檬酸鈉、檸檬酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、丙酮：均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 茶葉復合酶的制備

茶葉復合酶按如下方法制備。

所得的丙酮干粉即為茶葉復合酶，其主要作用部分是多酚氧化酶。稱取丙酮干粉10.00 g，用pH5.6的檸檬酸緩沖液配制成8%左右的濃度，密封，25℃條件下于震蕩器上震蕩45min后抽濾，濾液用pH5.6的檸檬酸緩沖液定容到100mL，即為10%的粗酶液，測定多酚氧化酶活性為2.1U。

粗酶液鈍化：取粗酶液100mL于100mL容量瓶中，置于100℃水浴鍋中煮沸2min，冷卻后定容至刻度即可。

1.2.2 速溶綠茶酶促氧化工藝參數優(yōu)化

1.2.2.1 單因素試驗

在100mL速溶綠茶溶液中添加一定體積的酶溶液，以兒茶素氧化轉化率為指標，分別就酶液濃度、底物濃度、pH、溫度和酶促反應時間等因素開展單因素實驗，重復3次。

在單因素試驗基礎上，綜合考慮各因素，選取底物濃度、pH值、溫度和酶促反應時間4個因素，以兒茶素氧化轉化率為指標，進行L9（34）正交表進行試驗設計，見表1。

表1 正交試驗因素水平表Table1 The designs of orthogonal experiment factor and level

1.2.3 茶色素的制備

將優(yōu)化工藝參數下的反應液鈍化酶活性后過濾，濾液用2倍體積的乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯層再用等體積的pH8.0磷酸鹽緩沖液洗滌1次，乙酸乙酯層經旋轉蒸發(fā)儀濃縮、真空干燥后即為速溶綠茶酶促氧化產物。同時，以紅茶茶湯為對照，按上述方法制備紅茶中的茶色素。

1.2.4 兒茶素氧化轉化率的計算兒茶素酶促氧化轉化率按如下公式計算：

式中：C0為反應前溶液中的兒茶素濃度，mg/L；C1為反應結束后溶液中的兒茶素濃度，mg/L；C2為對照溶液（鈍化后的酶液代替酶液）反應結束后的兒茶素濃度，mg/L。

1.2.5 檢測方法

取待測氧化產物樣品0.05 g，溶于100mL乙酸乙酯溶液中，于250 nm～500 nm處測定其吸收光譜。

式中：表示徑流量觀測值；表示BP神經網絡對徑流量的模擬值；表示該場洪水徑流量的平均值；N表示觀測值的個數。NSE的取值為-,1，NSE的值越接近1則表示模型的模擬度越高，模型的可信度越高。

茶葉復合酶中PPO活性采用文獻[19]的方法測定，兒茶素測定方法采用鹽酸香蘭素顯色法[20]，茶多酚含量測定采用酒石酸鐵比色法[21]，咖啡堿含量測定采用紫外分光光度法[22]，茶黃素、茶紅素含量測定采用系統(tǒng)分析法[23]。

2 結果與分析

2.1 不同因素對酶促氧化效果的影響

影響酶促氧化的因素很多，本實驗僅從酶液濃度、底物濃度、pH值、溫度和酶促反應時間5個方面對速溶綠茶酶促氧化效果進行探討。

2.1.1 酶液濃度

稱取0.5g速溶綠茶于一系列三角瓶中，加入40mL水，再分別加入不同體積的酶溶液，用pH4.0檸檬酸緩沖液調整體積至100mL，使溶液中酶濃度分別為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%和3.5%，然后在40℃水浴中反應2 h。酶濃度對兒茶素氧化轉化率的影響見圖1。

圖1 酶液濃度對酶促氧化效果的影響Fig.1 The influence of enzyme liquid concentration on enzymatic oxidation

統(tǒng)計表明，不同酶液濃度對酶促氧化效果影響差異極顯著（F=942.424＞F0.01(5，12)=5.064，P≤0.01），當酶液濃度低于2.0%時，酶液濃度與酶促氧化效果具有量效關系，但當酶液濃度超過2.0%時，兒茶素的氧化轉化率不再增加。因此，酶液濃度以2.0%為宜。

2.1.2 底物濃度

兒茶素酶促氧化底物包括速溶綠茶濃度和氧氣濃度，其中氧氣源自空氣，因此底物濃度僅考慮速溶綠茶濃度。稱取0.1 g～1.0 g速溶綠茶于一系列三角瓶中，加入40mL水，再分別加入20mL濃度為10%的酶液，用pH4.0檸檬酸緩沖液調整體積至100mL，然后在40℃水浴中反應2 h。底物濃度對兒茶素酶促氧化效果的影響見圖2。

在不同底物濃度的酶促氧化體系中，茶湯顏色隨濃度變化為黃、橙黃、橙紅，表明兒茶素氧化轉化成了紅色物質。統(tǒng)計表明，底物濃度對酶促氧化效果影響差異極顯著（F=265.539＞F0.01(5，12)=5.064，P≤0.01）。當底物濃度在0.1%～0.5%時，兒茶素氧化轉化率在26.37%～ 30.18%之間，但當底物濃度達到0.6%時，兒茶素氧化轉化率顯著下降，這可能是體系中多酚類濃度較高而抑制酶活性所致[19]。因此，酶促氧化體系中底物濃度以0.5%較為適宜。

圖2 底物濃度對酶促氧化效果的影響Fig.2 The influence of substrate concentration on enzymatic oxidation

2.1.3 反應體系pH值

稱取0.5 g速溶綠茶于一系列三角瓶中，加入40mL水，再分別加入20mL濃度為10%的酶液，用pH3.5～pH7.0檸檬酸緩沖液調整體積至100mL，然后在40℃水浴中反應2 h。不同pH值對兒茶素酶促氧化效果的影響見圖3。

圖3 pH值對酶促氧化效果的影響Fig.3 The influence of pH on enzymatic oxidation

統(tǒng)計表明，pH對酶促氧化效果影響差異極顯著（F=31.906＞F0.01(5，12)=5.064，P≤0.01），其中當反應體系為pH4.0時，兒茶素轉化率最高，當pH值低于4.0或高于4.5時兒茶素的轉化率都趨于下降。因此，速溶綠茶酶促氧化體系以pH4.0較為適宜。

2.1.4 反應溫度

稱取0.5 g速溶綠茶于一系列三角瓶中，加入40mL水，再分別加入20mL濃度為10%的酶液，用pH4.0檸檬酸緩沖液調整體積至100mL，然后在30℃～55℃水浴中反應2 h。不同反應溫度對酶促氧化效果的影響見圖4。

圖4 溫度對酶促氧化效果的影響Fig.4 The influence of temperature on enzymatic oxidation

酶對不同底物有不同的最適溫度，一般植物中酶的最適溫度在40℃～50℃之間[14]。在本試驗中，兒茶素酶促氧化轉化率隨溫度升高而增加，其中以45℃時達到最高值；當溫度高于50℃時，兒茶素酶促氧化轉化率逐漸下降。因此速溶綠茶溶液酶促氧化的最適溫度是45℃。

2.1.5 反應時間

稱取0.5 g速溶綠茶于一系列三角瓶中，加入40mL水，再分別加入20mL濃度為10%的酶液，用pH4.0檸檬酸緩沖液調整體積至100mL，然后在40℃水浴中氧化1 h～5 h。不同反應時間對酶促氧化效果的影響見圖5。

圖5 反應時間對酶促氧化效果的影響Fig.5 The influence of reaction time on enzymatic oxidation

從圖可知，當速溶綠茶酶促氧化2 h以后，兒茶素轉化率區(qū)域平緩，這可能與酶活力下降有關。因此，速溶綠茶酶促氧化時間以2 h為宜。

2.2 酶促氧化工藝參數優(yōu)化

為了進一步優(yōu)化速溶綠茶酶促氧化工藝條件，在單因素試驗的基礎上，在反應體系中酶液濃度為2.0%的條件下，選取底物濃度（0.4%～0.6%）、反應體系pH（3.5～4.5）、反應溫度（40℃～50℃）和反應時間（1.5 h～2.5 h）4個因素進行正交試驗。試驗結果見表2，方差分析結果見表3。

表2 速溶綠茶酶促氧化工藝正交試驗結果Table2 The orthogonal experiment results

表3 正交試驗結果方差分析Table3 The variance analysis of orthogonal experiment results

由極差值R來看，正交試驗所考查的4個因素對兒茶素轉化率的影響程度依次為A（底物濃度）＞B（pH）＞D（反應時間）＞C（反應溫度）。

由k值可知，在反應體系中酶液濃度為2.0%的條件下，速溶綠茶酶促氧化最佳工藝組合為A2B1C2D3，即：底物濃度0.5%，反應體系pH為3.5，溫度45℃，酶促氧化時間為2.5 h。

經方差分析表明（表3），在不考慮交互效應的情況下，底物濃度、pH和反應時間3個因素對兒茶素轉化率的影響達極顯著水平（P≤0.01），反應溫度對兒茶素轉化率的影響達顯著水平（P≤0.05）。

在獲得正交試驗結果后，按照最佳工藝組合進行3次驗證試驗，兒茶素的轉化率分別為34.38%、34.95%、35.05%，平均為34.79%。

2.3 酶促氧化產物吸收光譜與成分分析

對速溶綠茶的酶促氧化產物乙酸乙酯萃取液真空干燥后，所得產品為粉紅色固體粉末，色澤均勻，溶解性能良好。該產物在250 nm～500 nm處的吸收光譜與紅茶中的茶色素吸收光譜相似，在265、300、380 nm和460 nm附近有最大吸收峰（圖6），且該吸收光譜與李立祥等[14]試驗結果一致，說明酶促氧化速溶綠茶能生成茶色素。在紫外部分，茶色素呈馬鞍型的吸收光譜。

圖6 速溶綠茶酶促氧化產物吸收光譜圖Fig.6 Absorption spectrum curve of the enzymatic oxidation product of instant green tea

速溶綠茶酶促氧化產物的主要內含成分見表5。

表5 速溶綠茶酶促氧化產物內含成分Table5 The biochemical composition of the enzymatic oxidation product of instant green tea

從表5可知，速溶綠茶酶促氧化產物中茶黃素含量高達14.68%，顯著高于紅茶提取物，此外還富含茶多酚、兒茶素等重要成分。

3 結論與討論

速溶綠茶在茶葉復合酶的作用下，速溶綠茶中的兒茶素等首先被氧化成為鄰醌，鄰醌不穩(wěn)定，很容易發(fā)生非酶次級氧化。相同的兒茶素鄰醌或沒食子兒茶素鄰醌容易二聚合形成聯(lián)苯酚醌，聯(lián)苯酚醌進一步氧化、縮合形成茶黃素[1，24]。茶黃素是茶色素的主要功能成分，因此，利用茶葉復合酶，可催化氧化速溶綠茶制備茶色素。

通過單因素試驗，考察酶液濃度、底物濃度、pH值、溫度和時間5個因素對速溶綠茶酶促氧化效果的影響，并通過正交試驗法對最佳酶促氧化條件優(yōu)化。在酶促反應體系中，速溶綠茶較優(yōu)的酶促氧化條件為：茶葉復合酶濃度為2.0%，速溶綠茶濃度為0.5%，反應體系pH為3.5，溫度45℃，時間2.5 h。在此工藝參數下，兒茶素平均轉化率為34.79%。速溶綠茶酶促氧化產物在265、300、380 nm和460 nm附近有最大吸收峰，其紫外吸收光譜呈馬鞍形，與紅茶中的茶色素吸收光譜一致。速溶綠茶酶促氧化產物中茶黃素含量達14.68%，顯著高于紅茶提取物。

酶促氧化制取茶色素通常是在水介質中進行，其中兒茶素與氧是反應底物，而在水介質系統(tǒng)中的溶氧量很低（12mg/L～52mg/L）[25]，因而溶氧量低是茶色素形成的重要限制因子。此外，反應體系中的兒茶素濃度較低，但提高兒茶素濃度則其轉化率顯著降低，出現這種現象的原因可能是由于茶多酚、氨基酸、咖啡堿和蛋白質等物質達到一定濃度時，產生大量的疏水鍵，以致轉化率降低。因此，在增加底物濃度的情況下，如何提高兒茶素的轉化率和茶色素的得率還有待進一步探索。

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Experimental Study on the Enzymatic Oxidation of Instant Green Tea

LI Li-xia1，2，LUO Xue-ping1，HE Chun-lei2，3，*
（1.Department of Biological and Chemical Engineering，Yibin Vocational and Technical College，Yibin 644003，Sichuan，China；2.Key Laboratory of Tea Industry Science and Engineering of Sichuan Province，Chengdu 611130，Sichuan，China；3.College of Horticulture，Sichuan Agricultural University，Chengdu 611130，Sichuan，China）

The compound enzymes were prepared from fresh tea leaves，and instant green tea was enzymatic oxidized by the compound enzymes in this article. The oxidation degree of catechins in instant green tea was set as evaluation index，single factor experiment was used to analyze the influence of five factors including concentration of compound enzymes，concentration of substrate，pH，temperature and reaction time on the effect of enzymatic oxidation，and the best conditions of enzymatic oxidation were optimized by orthogonal test. The results showed that the optimal enzymatic oxidation conditions of instant green tea as follow：in the enzymatic reaction system，the concentration of compound enzymes was 2.0 %，concentration of substrate was 0.5 %，the pH of system was 3.5，the temperature was 45 ℃ and the reaction time was 2.5 h. Under the conditions，the oxidation degree of catechins was high to 34.79 %. There existed four maximum spectral absorption peaks at 265，300，380 nm and 460 nm in the enzymatic oxidation products of instant green tea，and that was similar to the absorption spectrum of tea pigment in black tea. The content of theaflavins in enzymatic oxidation products of instant green tea was high to 14.68 %，and it was higher than that of black tea extract.

instant green tea；enzymatic oxidation；tea compound enzymes；catechins；tea pigment

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.04.003

2016-04-25

四川省教育廳科技基金項目（15ZB-0496）；宜賓市自然科技基金項目（2014NY-019）

李麗霞（1983—），女（漢），講師，碩士研究生，從事茶葉深加工教學與研究工作。

*通信作者