楊靜，趙博，張雪寧(天津港口醫(yī)院，天津300456；天津醫(yī)科大學第二醫(yī)院)

放射性腦損傷大鼠腦組織細胞間黏附分子-1表達觀察

楊靜1，趙博2，張雪寧2
(1天津港口醫(yī)院，天津300456；2天津醫(yī)科大學第二醫(yī)院)

目的 觀察放射性腦損傷大鼠腦組織細胞間黏附分子1(ICAM-1)表達變化。方法 取40只SD大鼠隨機分為觀察組和對照組各20只，觀察組制備放射性腦損傷模型，對照組大鼠不做任何處理。觀察組及對照組分別于照射第1、2、3、5、7天各取4只大鼠，斷頭取腦組織，觀察兩組大鼠腦組織內神經細胞及毛細血管內皮細胞、血管的改變。采用Western blotting法檢測兩組腦組織ICAM-1總蛋白。采用免疫組化法結合計算機視圖處理軟件檢測兩組腦膠質細胞與神經細胞、腦血管內皮細胞ICAM-1蛋白。結果 照射第1、2、3、5、7天觀察組ICAM-1總蛋白的相對表達量分別為4.260±0.032、6.760±0.047、14.150±0.057、5.950±0.047、4.310±0.037，對照組為1.980±0.076，隨時間延長，觀察組ICAM-1總蛋白的相對表達量升高(P均<0.05)；不同時間觀察組ICAM-1總蛋白的相對表達量均高于對照組(P均<0.05)。不同時間觀察組腦膠質細胞與神經細胞、腦血管內皮細胞ICAM-1蛋白的相對表達量均高于對照組(P均<0.05)。照射第3天時觀察組腦膠質細胞與神經細胞、腦血管內皮細胞ICAM-1蛋白的相對表達量最高(P均<0.05)。結論 放射性腦損傷大鼠腦組織ICAM-1呈高表達，腦血管內皮細胞、膠質及神經細胞高表達ICAM-1蛋白，可能參與了急性期內誘導水腫、血管通透性增加、形成血栓等相關事件。

腦損傷；放射性腦損傷；細胞間黏附分子1

放射性腦損傷是頭頸部腫瘤及非腫瘤性病變放射治療后的一種常見且嚴重的并發(fā)癥，也是臨床上提高放射治療療效的重要障礙之一。對于亞急性期和晚期放射性腦損傷的一些影像學和組織學變化已比較明確，但早期放射性腦損傷的發(fā)生機制尚不明確。細胞間黏附分子1(ICAM-1)是中樞神經系統(tǒng)中表達最廣泛的黏附分子，它與以系列炎癥性疾病和狀態(tài)有關。我們觀察了放射性腦損傷大鼠腦組織ICAM-1的表達，旨在探討放射性腦損傷的可能機制?，F將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、試劑及儀器 成年健康雄性SD大鼠40只，由中國軍事科學院提供，體質量(200±50)g。采用國標準嚙齒類動物干飼料喂養(yǎng)，自由飲水進食。Bradford蛋白定量試劑盒、山羊抗小鼠二抗(江蘇碧云天公司)；過硫酸銨、丙烯酰胺、亞甲雙丙烯酰胺、SDS、Tris堿(美國Amersham公司)，PVDF膜(美國Milliproe公司)，小鼠抗大鼠ICAM-1單克隆抗體(美國Abcam公司)。

1.2 大鼠分組及放射性腦損傷模型制備方法 取40只SD大鼠隨機分為觀察組和對照組各20只，觀察組采用方法[3]制備放射性腦損傷模型，水合氯醛(3.0 mL/100 g)腹腔麻醉大鼠，將大鼠仰臥位固定于直線加速器治療床上進行放射照射。放射照射條件：6 MeV電子線，吸收劑量400 cGy/s，源皮距100 cm，照射野3 cm×3 cm。照射野大小包括全腦為準，避免呼吸道、消化道受到照射。對照組大鼠不做任何處理。

1.3 兩組腦組織ICAM-1總蛋白檢測 兩組分別于照射第1、2、3、5、7天各取4只大鼠，麻醉大鼠，經左心室灌注多聚甲醛，于大鼠右心耳處剪開一小口，使灌注液流出，至肺組織顏色變白，腦組織灌注完成。斷頭取腦，取部分腦組織放入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫糠帜X組織制作石蠟切片，蠟塊包埋后行HE染色，取觀察組照射第1、2、3、5、7天及對照組照射第7天時腦組織，采用Westem blotting法觀察腦組織ICAM-1總蛋白,采用Gelpro軟件觀察ICAM-1目的條帶的灰度值，以β-actin作為內參，以目的蛋白與β-actin灰度值之比作為蛋白的相對表達量。實驗重復3次，取平均值。

1.4 兩組腦膠質細胞與神經細胞、腦血管內皮細胞ICAM-1蛋白檢測 采用免疫組化法結合計算機視圖處理軟件檢測兩組腦膠質細胞、神經細胞、腦血管內皮細胞ICAM-1蛋白。取“1.3”中兩組腦組織，免疫組織化學染色后，將切片置于高倍顯微鏡下觀察受照后大鼠腦組織中神經細胞、內皮細胞及膠質細胞表達ICAM的情況及定位。運用Image Pro Plus 9.0軟件選擇腦血管內皮細胞、神經細胞和膠質細胞的存在區(qū)域，應用軟件計算出所選擇區(qū)域的面積、細胞漿及細胞間隙陽性染色的程度，對每張切片選取10個高倍視野(400倍)，計算定量指標為積分光密度值，分別計算兩者10個視野IOD總和的算術均值。運用Image Pro Plus9.0分析軟件進行印跡分析，β-actin作為內參。以目的蛋白與β-actin灰度值之比作為蛋白的相對表達量。實驗重復3次，取平均值。

2 結果

2.1 兩組腦組織ICAM-1總蛋白相對表達量比較 照射第1、2、3、5、7天觀察組ICAM-1總蛋白的相對表達量分別為4.260±0.032、6.760±0.047、14.150±0.057、5.950±0.047、4.310±0.037，對照組為1.980±0.076，隨時間延長，觀察組ICAM-1總蛋白的相對表達量升高(P均<0.05)；不同時間觀察組ICAM-1總蛋白的相對表達量均高于對照組(P均<0.05)。

2.2 兩組腦膠質細胞與神經細胞、腦血管內皮細胞ICAM-1蛋白相對表達量比較 兩組腦膠質細胞與神經細胞、腦血管內皮細胞ICAM-1蛋白相對表達量比較見表1。

表1 不同照射時間兩組腦膠質細胞與神經細胞、腦血管內皮細胞ICAM-1蛋白相對表達量比較±s)

注：與對照組同時段比較，#P<0.05；與本組照射第1、2、5、7天比較，＊P<0.05。

3 討論

隨著當今三維適形調強放療以及立體定向放療等放射治療技術的日益發(fā)展，放射治療的準確性不斷提高，但在治療頭頸部腫瘤時，病灶周圍正常腦組織還是會不可避免地受到照射。放射性腦損傷的發(fā)病機制目前尚不明確。主要有以下幾種假說[2～7]：血管損傷學說、膠質細胞損傷學說、自身免疫學說和神經元損傷學說。目前認為血管損傷在放射性腦損傷的發(fā)生機制中起著主要作用。

ICAM-1屬于黏附分子中免疫球蛋白超家族(IGSF)中的成員，是介導黏附反應重要的一個黏附分子[8]。ICAM-1可以分為sICAM-1(可溶型)和mICAM-1(膜型)2種，ICAM-1在細胞外的存在形式是可溶性細胞間黏附分子(sICAM-1)，sICAM-1是由mICAM-1經蛋白酶裂解后由細胞外的成分脫落進入血液而來，在正常成熟腦組織中鮮有表達，在缺氧、缺血、外傷、腫瘤、脫髓鞘病變等病情情況下，腦組織中ICAM-1蛋白表達顯著升高[9]。

ICAM-1參與很多機體的功能，可促進炎癥的發(fā)生、發(fā)展；阻止腫瘤的轉移和惡化以及調節(jié)機體的免疫。內皮細胞上的細胞間黏附分子通過介導細胞與細胞間或細胞與基質間相互接觸和結合，從而參與細胞的信號轉導與活化、細胞阻止生長及分化、炎癥反應、血管生成、免疫應答和腫瘤轉移等生理病理過程[10]。在正常的生理狀態(tài)下，ICAM-1在白細胞和內皮細胞上僅呈低水平的表達。當出現某些應激或病理狀態(tài)時，其在內皮細胞、角質形成細胞、白細胞、上皮細胞和成纖維細胞的表達量可成倍增加。在中樞神經系統(tǒng)中，ICAM-1可以促進腦損傷部位周圍腦組織中的中性粒細胞的浸潤，而中性粒細胞是繼發(fā)性腦損害的主要介質。腦損傷發(fā)生后，在血管內聚集的中性粒細胞可以造成微血管機械性的阻塞并釋放血管收縮物質，從而使腦血流受阻；此外，活化的中性粒細胞可以釋放大量的蛋白水解酶和氧自由基，引起腦血管的損害，導致血管通透性增加進而造成組織水腫，而進入組織的中性粒細胞可進一步釋放上述毒性物質，破壞膠質細胞的神經元，從而進一步加重腦損傷；同時，白細胞還釋放一些細胞因子和炎癥介質，可以加重炎癥反應，而這又進一步吸引更多的白細胞進入腦組織，形成惡性循環(huán)。此外，白細胞的積聚還能促進血栓形成[11]。本研究中，對照組大鼠腦組織ICAM-1蛋白僅輕度表達，均低于觀察組各照射時間腦組織ICAM-1表達，結合病理觀察發(fā)現，隨ICAM-1表達量的增加，腦損傷程度增加，腦組織出現水腫，血管受損。說明腦組織ICAM-1高表達可導致繼發(fā)性腦損傷。

血管反應和滲出是炎癥過程的重要環(huán)節(jié)，而一些炎癥介質如IL-1和TNF-α可以對ICAM-1起到誘導作用[12]，在炎癥過程出現高表達的ICAM-1。本實驗中，隨時間延長，觀察組ICAM-1總蛋白的相對表達量升高；不同時間觀察組ICAM-1總蛋白的相對表達量均高于對照組。不同時間觀察組腦膠質細胞與神經細胞、腦血管內皮細胞ICAM-1蛋白的相對表達量均高于對照組。照射第3天時觀察組腦膠質細胞與神經細胞、腦血管內皮細胞ICAM-1蛋白的相對表達量最高。共同表明了ICAM-1在RBI急性期內發(fā)揮了促進血腦屏障破壞、誘導內皮細胞損傷以及加重血管源性水腫等作用。

以往研究[13～15]認為，ICAM蛋白可通過激活Gabl/cAMP/PKA通路促進內皮細胞小體的胞吐并向細胞表面釋放細胞因子，促進細胞黏附過程；促進內皮細胞中組織因子的表達參與凝血過程；此外，機體還可經NF-KB信號傳導途徑上調ICAM-1蛋白表達、促進白細胞黏附、微循環(huán)障礙。因此，內皮細胞所表達的ICAM蛋白可能經上述機制參與照射后腦毛細血管內血栓的形成。在照射第7天腦血管內皮細胞、膠質與神經細胞ICAM蛋白表達持續(xù)升高。有研究[16]認為ICAM可調節(jié)內皮細胞存活，促進內皮細胞遷移；上調內皮細胞增殖，因此，血管內皮細胞、膠質及神經細胞表達的ICAM蛋白在照射后亞急性期參與了血管修復再生、血栓消融等事件。本研究結果發(fā)現，照射第1天觀察組大鼠腦血管內皮細胞ICAM蛋白的相對表達量升高，并于照射第3天時到達高峰，HE染色結果提示血管內皮細胞損傷，并出現血栓形成，說明ICAM與血管內皮損傷及血栓的形成具有相關性，其作用機制可能是上述幾種機制聯(lián)合作用的結果。結合本研究中腦血管內皮細胞ICAM蛋白表達的變化及病理結果，發(fā)現ICAM蛋白表達的變化與腦內微循環(huán)障礙存在密切聯(lián)系。

綜上所述，放射性腦損傷大鼠腦組織ICAM-1呈高表達，腦血管內皮細胞、膠質及神經細胞表達的ICAM-1蛋白持續(xù)高表達，可能參與了急性期內誘導水腫、血管通透性增加、形成血栓等相關事件。

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天津市應用基礎與前沿技術研究計劃(13JCYBJC23800)；天津市衛(wèi)生局科技基金資助項目(2014KZ108)。

趙博(E-mail: doctor_zb@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.07.012

R818.74

A

1002-266X(2017)07-0040-03

2016-03-17)