羅昊翔，顧隆，賀禮紅，姜文敏，李佳佳(黔西南民族職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)藥系，貴州興義562400)

轉(zhuǎn)染HBV Creg DNA的小鼠肝細(xì)胞表面干性分子表達(dá)觀察

羅昊翔，顧隆，賀禮紅，姜文敏，李佳佳
(黔西南民族職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)藥系，貴州興義562400)

目的 觀察轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-HBV Creg DNA質(zhì)粒的小鼠肝細(xì)胞表面干性分子CD44、CD90、CD133的表達(dá)變化。方法 從含有pcDNA3.1-HBV Creg DNA質(zhì)粒的Ecoli DH5α菌株中提取pcDNA3.1-HBV Creg DNA質(zhì)粒。取SPF級(jí)正常小鼠的肝細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，加入50 μL pcDNA3.1-HBV Creg DNA混合轉(zhuǎn)染細(xì)胞。采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后小鼠肝細(xì)胞表面干性分子CD44、CD90、CD133表達(dá)。結(jié)果 轉(zhuǎn)染前，部分小鼠肝細(xì)胞CD90、CD133呈陽性，且陽性染色細(xì)胞都是圓形。未見有CD44陽性染色細(xì)胞。轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-HBV Creg DNA后，小鼠肝細(xì)胞表面干性分子CD44、CD90、CD133呈陽性染色。結(jié)論 轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-HBV Creg DNA質(zhì)粒的小鼠肝細(xì)胞表達(dá)CD44、CD90、CD133。HBV Creg DNA可能影響小鼠肝細(xì)胞表面干性分子CD44的表達(dá)。

肝癌；肝腫瘤；乙肝相關(guān)性肝癌；干細(xì)胞；干性分子

HBV Creg DNA(nt1087-nt2488)是存在于乙型肝炎病毒(HBV)基因組中一段DNA片段，包括HBV的核心基因、兩個(gè)增強(qiáng)子(Enh Ⅰ和EnhⅡ)、完整的X蛋白的啟動(dòng)子、核心啟動(dòng)子、反式調(diào)控序列(X蛋白編碼區(qū))、信號(hào)肽序列(前C編碼區(qū))，即包含了HBV核心基因及其上游的調(diào)控序列和包裝信號(hào)區(qū)(1853nt-1982nt)、順向重復(fù)序列1(DR Ⅰ)、順向重復(fù)序列2(DR Ⅱ)及其間的黏性末端區(qū)(1592nt-1836nt)。目前，腫瘤干細(xì)胞的研究領(lǐng)域尚存在較多爭(zhēng)議。Reya等[1]提出了腫瘤干細(xì)胞假說。也有研究認(rèn)為，腫瘤是由于干細(xì)胞發(fā)育異常導(dǎo)致的。目前，臨床尚無公認(rèn)的篩選腫瘤干細(xì)胞的特異性標(biāo)記分子。CD90、CD133和CD44是最常見的肝癌干細(xì)胞標(biāo)記分子，既往研究發(fā)現(xiàn)其在肝癌細(xì)胞中高表達(dá)[2]，但CD90、CD133和CD44不是特異性的肝癌干細(xì)胞標(biāo)記分子，正常組織和腫瘤組織中均可見其表達(dá)。乙肝相關(guān)性肝癌是我國常見的肝癌類型，HBV DNA可調(diào)節(jié)肝細(xì)胞基因的表達(dá)。但HBV是否會(huì)導(dǎo)致肝細(xì)胞表面干性分子的表達(dá)變化呢？我們觀察了觀察轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-HBV Creg DNA質(zhì)粒的小鼠肝細(xì)胞表面干性分子CD44、CD90、CD133的表達(dá)變化，旨在為乙肝相關(guān)性肝癌的分子靶向治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑及儀器 2～3周齡SPF級(jí)正常小鼠1只，采用國標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物干飼料喂養(yǎng)，自由飲水進(jìn)食。RPMI1640(Invitrogen Corporation)，小牛血清(杭州四季青公司)，CD44抗體一抗、CD90抗體一抗、CD133抗體一抗、免疫組化試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)，胰蛋白酶(Biosharp)，質(zhì)粒提取試劑盒(AXYGEN)，LipofectamineTM2000(Invitrogen Corporation)，菌株Ecoli DH5α(Fermentas)，瓊脂，胰蛋白胨，酵母提取物。

1.2 pcDNA3.1-HBV Creg DNA質(zhì)粒提取 將含有pcDNA3.1-HBV Creg DNA質(zhì)粒的Ecoli DH5α菌株接種于含100 μg/mL Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃電熱培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，取出試管，按AXKGEN質(zhì)粒提取試劑盒說明書提取質(zhì)粒。

1.3 小鼠肝細(xì)胞分離、培養(yǎng)與 pcDNA3.1-HBV Creg DNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染方法 取SPF級(jí)正常小鼠1只，頸椎脫臼處死，取出肝臟，使用解剖剪將小鼠肝臟充分剪碎，使小鼠肝細(xì)胞脫落，形成肝細(xì)胞懸液。吸取肝細(xì)胞懸液，加入25 mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5% CO2的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)的小鼠肝細(xì)胞在低倍鏡下觀察，細(xì)胞形態(tài)多種多樣，大部分細(xì)胞呈圓形、橢圓形，少數(shù)細(xì)胞呈梭形。細(xì)胞顏色深淺不一。細(xì)胞越幼稚，細(xì)胞越小，顏色越淺。待細(xì)胞貼壁后，棄上清，加入適量0.01 mmol/L PBS沖洗2～3次，直至倒置顯微鏡下觀察無懸浮細(xì)胞，將50 μL pcDNA3.1-HBV Creg DNA溶于500 μL無血清RPMI1640中，混勻，加入10 μL LipofectamineTM2000，混勻，室溫放置25 min，將混合物加入培養(yǎng)瓶中，再加適量RPMI1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至第二天胰蛋白酶消化傳代，傳代時(shí)，一部分傳于蓋玻片上，置于37 ℃、5%CO2的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，第2天將傳有細(xì)胞的蓋玻片置入10%甲醛溶液中固定12 h，備用。

1.4 轉(zhuǎn)染前后小鼠肝細(xì)胞表面干性分子CD44、CD90、CD133檢測(cè) 采用免疫細(xì)胞化學(xué)。從甲醛中取出轉(zhuǎn)染前、轉(zhuǎn)染后的傳有小鼠肝細(xì)胞的蓋玻片各3片，分別使用0.01 mmol/L PBS洗2 min×3次，分別滴加H2O2適量，室溫下靜置30 min、0.01 mmol/L PBS洗2 min×3次，滴加1滴5%BSA室溫封閉20 min，甩干蓋玻片多余液體，不洗，分別滴加一抗(鼠抗人CD44抗體、鼠抗人CD90抗體和鼠抗人CD133抗體)，37 ℃水浴2 h，取出，0.01 mmol/L PBS洗2 min×3次，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗鼠二抗，37 ℃水浴30 min，0.01 mmol/L PBS洗2 min×3次，滴加SABC試劑1滴，37 ℃水浴20 min，0.01 mmol/L PBS洗5 min×4次，顯色劑顯色后，普通光學(xué)顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染前、后小鼠肝細(xì)胞表面干性分子CD44、CD90、CD133的表達(dá)情況,陽性細(xì)胞可被染色劑染為藍(lán)綠色，陰性細(xì)胞不顯色。

2 結(jié)果

轉(zhuǎn)染前小鼠肝細(xì)胞表面干性分子CD44、CD90、CD133表達(dá)情況見圖1。轉(zhuǎn)染前鏡下可見部分細(xì)胞CD90、CD133呈陽性，且陽性染色細(xì)胞都是圓形，細(xì)胞個(gè)體較小。CD44的檢測(cè)結(jié)果一直都是陰性，未見有CD44陽性染色細(xì)胞。

圖1 轉(zhuǎn)染前小鼠肝細(xì)胞表面干性分子CD44、CD90、CD133表達(dá)

轉(zhuǎn)染后小鼠肝細(xì)胞表面干性分子CD44、CD90、CD133表達(dá)情況見圖2。在肝細(xì)胞轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-HBV Creg DNA后，部分細(xì)胞CD44呈陽性染色。

3 討論

有研究人員認(rèn)為，腫瘤的發(fā)生是干細(xì)胞發(fā)育受阻，激活了異常分裂機(jī)制，導(dǎo)致細(xì)胞惡性增殖。也有研究人員認(rèn)為，腫瘤組織中存在突變的干細(xì)胞，這些不正常的干細(xì)胞只能發(fā)育為腫瘤細(xì)胞，而不能發(fā)育為正常組織細(xì)胞，這是腫瘤發(fā)生及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的根本原因[3]。正常組織的干細(xì)胞與腫瘤組織的干細(xì)胞到底有何不同呢？干細(xì)胞是一種前體細(xì)胞，細(xì)胞的某種干性分子不只是在一種組織存在，在很多種組織可能存在相同的干性標(biāo)記分子，如CD133在造血干細(xì)胞、肝臟干細(xì)胞、腎細(xì)胞癌、乳腺癌等均有表達(dá)，所以找到特異性的腫瘤干細(xì)胞表面分子標(biāo)記，對(duì)于腫瘤的分子靶向治療有重要意義。本實(shí)驗(yàn)研究主要通過將外源因素pcDNA3.1-HBV Creg DNA導(dǎo)入正常小鼠肝細(xì)胞，觀察正常小鼠肝細(xì)胞表面干性標(biāo)記分子的變化，從而找到乙肝相關(guān)性肝癌特異性的細(xì)胞表面分子標(biāo)記，為乙肝相關(guān)性肝癌的分子靶向治療提供理論依據(jù)。

圖2 轉(zhuǎn)染后小鼠肝細(xì)胞表面干性分子CD44、CD90、CD133表達(dá)

pcDNA3.1-HBV Creg DNA為我們實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的HBV DNA片段的表達(dá)載體，該HBV Creg DNA片段中，包含了HBV的核心基因、兩個(gè)增強(qiáng)子(Enh I和EnhⅡ)、完整的X蛋白的啟動(dòng)子、核心啟動(dòng)子、反式調(diào)控序列(X蛋白編碼區(qū))、信號(hào)肽序列(前C編碼區(qū))即包含了HBV核心基因及其上游的調(diào)控序列和包裝信號(hào)區(qū)(1853nt-1982nt)、順向重復(fù)序列1(DRⅠ)、順向重復(fù)序列2(DR Ⅱ)及其間的粘性末端區(qū)(1592nt-1836nt)。研究表明，HBV的該段DNA序列，與肝癌的發(fā)生密切相關(guān)。HBV X蛋白可以反式調(diào)控、激活細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路，引起表觀遺傳改變[3]，從而提高細(xì)胞干性表達(dá)，決定腫瘤轉(zhuǎn)化。HBV兩個(gè)直接重復(fù)序列區(qū)域可以同源重組等多種方式整合入人類肝細(xì)胞基因組[4]，通常整合入細(xì)胞基因組的HBV DNA序列還包括X基因、X基因的啟動(dòng)子、C基因、C基因的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子2(EnhⅡ)、S基因等。X基因的啟動(dòng)子是已證明了的強(qiáng)啟動(dòng)子，整合后能夠有效激活細(xì)胞基因的表達(dá)，EnhⅡ增強(qiáng)表面抗原和X基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性[5]，整合后導(dǎo)致HBV的X抗原和表面抗原持續(xù)表達(dá)，共同調(diào)節(jié)細(xì)胞基因的轉(zhuǎn)錄，激活干細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，使細(xì)胞表現(xiàn)出干性。此外，HBV基因整合入細(xì)胞基因組可能會(huì)導(dǎo)致p53基因失活，使干細(xì)胞基因過表達(dá)[6]。在小鼠肝細(xì)胞轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-HBV Creg DNA前后，細(xì)胞表面干性標(biāo)記分子發(fā)生了變化，轉(zhuǎn)染前，在小鼠肝細(xì)胞表面主要檢測(cè)出的細(xì)胞干性標(biāo)記分子為CD133和CD90部分細(xì)胞呈陽性表達(dá)，而CD44在轉(zhuǎn)染前一直未檢出。轉(zhuǎn)染后，在小鼠肝細(xì)胞表面也能檢出CD133和CD90部分細(xì)胞呈陽性表達(dá)，但CD44在轉(zhuǎn)染后，檢出大部分小鼠肝細(xì)胞呈陽性表達(dá)。CD133和CD90在正常組織和腫瘤組織均有實(shí)驗(yàn)研究檢出，而對(duì)于CD44的檢測(cè)，大部分實(shí)驗(yàn)研究都是檢測(cè)腫瘤組織[7～11]。

眾所周知，肝細(xì)胞屬于穩(wěn)定細(xì)胞。但是當(dāng)肝臟受到刺激時(shí)，肝細(xì)胞既表現(xiàn)出較強(qiáng)的再生能力，肝細(xì)胞的這種再生能力說明肝臟內(nèi)存在維持細(xì)胞更新的干細(xì)胞[12]。正常肝臟細(xì)胞可能不具有干性特征，但當(dāng)肝臟受到損傷刺激后，肝細(xì)胞則表現(xiàn)出干性特征，經(jīng)過損傷刺激，肝細(xì)胞表面出現(xiàn)干性標(biāo)記分子，而我們的研究是通過取出小鼠肝臟，然后進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，中間經(jīng)過肝臟損傷刺激的過程，所以在肝細(xì)胞傳代培養(yǎng)后，檢測(cè)肝細(xì)胞部分細(xì)胞干性標(biāo)記分子陽性。Rountree等[13]的研究表明分離出CD133+肝臟干細(xì)胞可以體外克隆擴(kuò)增，CD133是一個(gè)干細(xì)胞標(biāo)記分子[14]，CD90在胚胎肝臟和肝腫瘤中也是一個(gè)很重要的干性標(biāo)記[15]，但是我們研究表明，CD90和CD133分子在正常干細(xì)胞和pcDNA3.1-HBV Creg DNA轉(zhuǎn)染后的均有表達(dá)，說明CD90和CD133分子可能是正常肝臟干細(xì)胞表面的干性標(biāo)記分子。正常肝細(xì)胞在pcDNA3.1-HBV Creg DNA轉(zhuǎn)染前為檢測(cè)出CD44的表達(dá)，然而，在轉(zhuǎn)染后卻檢測(cè)出有大部分肝細(xì)胞呈陽性表達(dá)，說明帶有調(diào)控序列的HBV Creg DNA片段可影響小鼠肝細(xì)胞表面干性分子CD44的表達(dá)，CD44分子的陽性表達(dá)可能與乙肝相關(guān)性肝癌的發(fā)生有關(guān)，CD44分子可能是比較有特性的肝癌干細(xì)胞的表面干性標(biāo)記分子。

綜上所述，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-HBV Creg DNA質(zhì)粒的小鼠肝細(xì)胞表達(dá)CD44、CD90、CD133。HBV Creg DNA可可影響小鼠肝細(xì)胞表面干性分子CD44的表達(dá)。CD44可能是乙肝相關(guān)性肝癌干細(xì)胞的干性標(biāo)記分子，而CD90、CD133可能是正常肝臟干細(xì)胞的干性標(biāo)記分子。

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貴州省科技廳科學(xué)技術(shù)基金資助項(xiàng)目(2013-2268) 。

羅昊翔

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.07.011

R73

A

1002-266X(2017)07-0037-03

2016-06-12)