歐瑞明，周長華，譚友平，劉爽，鐘啟，張青，杜苑苑，鄭麗玲(廣東省第二人民醫(yī)院，廣州 510317)

青蒿琥酯對耐地塞米松的多發(fā)性骨髓瘤細胞株增殖及NF-κB p65、P-gp表達影響

歐瑞明，周長華，譚友平，劉爽，鐘啟，張青，杜苑苑，鄭麗玲
(廣東省第二人民醫(yī)院，廣州 510317)

目的 探討青蒿琥酯對耐地塞米松人多發(fā)性骨髓瘤(MM)細胞株MM.1R增殖的影響，并探討其可能作用機制。方法 取對數(shù)生長期MM.1S、對塞米松敏感的MM細胞株MM.1R，各分為空白對照組、地塞米松組、青蒿琥酯組、地塞米松+青蒿琥酯組，分別加入等量培養(yǎng)液、20 ng/mL的地塞米松、25μg/mL的青蒿琥酯、20 ng/mL的地塞米松+25μg/mL的青蒿琥酯，觀測各組細胞增殖情況，計算細胞增殖抑制率。取MM.1R細胞加入終濃度為25μg/mL的青蒿琥酯，分別于給藥前、給藥24 h、給藥48 h檢測細胞核轉錄因子κB (NF-κB) p65蛋白、P糖蛋白(P-gp)蛋白的表達。結果 給藥24 h時，MM.1S細胞地塞米松組、青蒿琥酯組、地塞米松+青蒿琥酯組的細胞增殖抑制率分別為20.41%±2.75%、29.07%±2.71%、68.92%±4.12%，組間兩兩比較，P均<0.05；給藥24 h，MM.1R細胞地塞米松組、青蒿琥酯組、地塞米松+青蒿琥酯組的細胞增殖抑制率分別對為4.13%±3.10%、27.43%±2.67%、60.14±3.24%，組間兩兩比較，P均<0.05；青蒿琥酯給藥前、給藥24 h、給藥48 h， MM.1R細胞NF-κB p65蛋白的相對表達量分別為0.89±0.21、0.42±0.13、0.23±0.08；P-gp蛋白的相對表達量分別為0.86±0.19、0.43±0.13、0.25±0.09，隨干預時間增加，MM.1R細胞NF-κB p65、P-gp蛋白的相對表達量均降低(P均<0.05)。結論 青蒿琥酯可抑制MM.1S以及MM.1R細胞的增殖，與地塞米松聯(lián)用有協(xié)同效應。青蒿琥酯抑制MM.1R細胞增殖的機制可能為下調NF-κB p65、P-gp蛋白的表達。

青蒿琥酯；多發(fā)性骨髓瘤；細胞增殖；核轉錄因子κB p65蛋白；P糖蛋白

多發(fā)性骨髓瘤(MM)約占血液系惡性腫瘤10%，近年發(fā)病率逐年上升?；?、造血干細胞移植是MM的主要治療方法，地塞米松是常用的MM化療藥物。硼替佐米、來那度胺等新藥及大劑量化療藥物聯(lián)合自體造血干細胞移植是新興的MM治療方法，大大提高了MM患者的病情緩解率及患者生存期。但MM細胞易產(chǎn)生耐藥性，多數(shù)患者治療后容易發(fā)生MM復發(fā)(或難治)[1]。發(fā)掘能克服MM耐藥的新藥物或治療新方案，提高復發(fā)(或難治)MM的療效是目前的研究熱點。青蒿琥酯是我國傳統(tǒng)抗瘧中藥,最新研究發(fā)現(xiàn)其具有廣泛的抗腫瘤活性，對肝癌、結腸癌、乳腺癌等實體瘤以及白血病、淋巴瘤、骨髓瘤等血液系統(tǒng)腫瘤細胞均有一定的增殖抑制作用，并具與傳統(tǒng)抗腫瘤藥物無交叉耐藥，且能逆轉腫瘤細胞多藥耐藥的優(yōu)點[2，3]。目前關于青蒿琥酯對地塞米松耐藥的人MM細胞株抗腫瘤作用的相關報道較少。本研究探討了青蒿琥酯對地塞米松耐藥(MM.1R)、地塞米松敏感(MM.1S)的人MM細胞株細胞增殖的影響，并探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞、材料及試劑 地塞米松耐藥(MM.1R)、地塞米松敏感(MM.1S)性人多發(fā)性骨髓瘤細胞株來源于ATCC細胞庫，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3～4天換液傳代1次。核轉錄因子κB (NF-κB)p65蛋白、P糖蛋白(P-gp)、GAPDH抗體購自美國Santa Cruz公司；注射用青蒿琥酯為桂林南藥股份有限公司生產(chǎn)(批號H10930195)。

1.2 青蒿琥酯對MM.1S、MM.1R細胞增殖的影響觀察 分別取對數(shù)生長期MM.1S、MM.1R細胞，胰酶消化，調整細胞懸浮液濃度為5×104/mL，100 μL/孔接種于96孔板，孵育24 h，將MM.1S、MM.1R細胞各分為對照組和觀察組(地塞米松組、青蒿琥酯組、地塞米松+青蒿琥酯組)，分別加入等量培養(yǎng)液、終濃度20 ng/mL的地塞米松、終濃度25 μg/mL的青蒿琥酯、終濃度20 ng/mL的地塞米松+終濃度25 μg/mL的青蒿琥酯，每組3個復孔，終體積為200 μL。采用MTT法檢測各組細胞增殖抑制情況。所有操作均嚴格按照使用說明書進行。采用酶標儀檢測570 nm波長處的吸光度值(A570)，重復3次，取平均值，計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率=(1-A觀察組/A對照組)×100%。

1.3 青蒿琥酯對MM.1R細胞p65、P-gp蛋白表達的影響 取對數(shù)生長期MM.1R細胞，分別于給藥前、給藥24 h、給藥48 h采用Western blotting法檢測細胞NF-κB p65、P-gp蛋白的表達。取各組細胞, 冰上裂解細胞，采用BCA法提取總蛋白，12%聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入一抗(NF-κB p65、P-gp、GAPDH抗體)4 ℃孵育過夜，加入二抗室溫孵育2 h，ECL顯色，膠片曝光，掃描成像。采用Gelpro軟件測量目的條帶的灰度值，以GAPDH作為內參，以目的蛋白與GAPDH灰度值之比作為目的蛋白的相對表達量。實驗重復3次，取平均值。

2 結果

2.1 各組細胞增殖抑制率比較 各組細胞增殖抑制率比較見表1、2。

表1 MM.1R細胞增殖抑制率比較(%，±s)

注：與地塞米松組比較，*P<0.05；與青蒿琥酯組比較，#P<0.05。

表2 MM.1S細胞增殖抑制率比較(%，±s)

注：與地塞米松組比較，*P<0.05；與青蒿琥酯組比較，#P<0.05。

2.2 不同給藥時間MM.1R細胞 p65、P-gp蛋白相對表達量比較 給藥前、給藥24 h、給藥48 h，MM.1R細胞p65蛋白的相對表達量分別為0.89±0.21、0.42±0.13、0.23±0.08。給藥前、給藥24 h、給藥48 h，MM.1R細胞P-gp蛋白的相對表達量分別為0.86±0.19、0.43±0.13、0.25±0.09。隨干預時間增加，MM1.R細胞NF-κB p65、P-gp蛋白相對表達量均降低(P均<0.05)。

3 討論

MM細胞容易發(fā)生耐藥。雖然來那度胺、硼替佐米等新藥與傳統(tǒng)化療藥物的聯(lián)合使用對克服MM耐藥有一定成效，但也面臨毒性作用加大、治療費用增加等諸多問題。研究表明，青蒿琥酯能夠抑制MM細胞的增殖并誘導其凋亡，不但對正常組織細胞的毒性很低，而且與傳統(tǒng)化療藥物無交叉耐藥，能增加MM細胞對化療藥物的敏感性，逆轉MM細胞多藥耐藥性[4]。地塞米松作為經(jīng)典的抗MM治療藥物，即使在目前MM治療的新藥時代，仍是各種MM治療方案中的基礎用藥之一。本實驗中選取的MM.1細胞株建株于一IgA型MM患者的外周血，其亞系糖皮質激素敏感的細胞系MM.1S和耐藥的細胞系MM.1R均來源于這一母系，分別代表了MM進展的不同階段，是研究MM疾病進展和耐藥的理想模型[5]。

青蒿琥酯作為我國擁有完全自主知識產(chǎn)權的傳統(tǒng)中藥衍生物，具有低毒、價廉的優(yōu)點，是一種理想的抗腫瘤藥物增敏劑，與常規(guī)抗骨髓瘤藥物聯(lián)合使用有可能進一步提高耐藥MM的療效。既往的研究顯示，青蒿琥酯能通過介導MM細胞G0/G1期阻滯、抑制MM細胞增殖并誘導其凋亡、抑制MM血管新生、逆轉MM細胞多藥耐藥等多種機制，抑制多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)生、發(fā)展[4]。本研究結果顯示，青蒿琥酯對MM.1R具有增殖抑制作用，能降低其NF-κB p65及P-gp的表達，并且其抑制率與MM.1S相近，提示其抗腫瘤效應與地塞米松不存在交叉耐藥，而青蒿琥酯與地塞米松聯(lián)合用藥，抑制率較單藥明顯升高，提示兩藥聯(lián)合有良好的協(xié)同效應，能克服MM細胞的耐藥性。MM細胞的耐藥機制較為復雜，且耐藥多表現(xiàn)為多耐藥反應(MDR)，目前認為主要與多藥耐藥基因(MDR1)的過度表達、凋亡調控基因介導機制等有關，其中最主要的耐藥機制是NF-κB通路的活化，使得受NF-κB調控的下游基因如MDR1、Bcl-2表達增加[6]。研究表明，NF-κB通過調節(jié)細胞周期促進細胞增殖、抑制細胞凋亡、促進血管新生等多種機制在MM的發(fā)生、發(fā)展中起關鍵作用，并與MM細胞多藥耐藥的發(fā)生密切相關[7]。細胞周期蛋白D1(CyclinD1)啟動子上含有兩個NF-κB結合位點，NF-κB可促進CyclinD1的表達，從而促使細胞由G0/G1期向S期轉化，加速細胞周期，促進腫瘤細胞增殖。此外，NF-κB還可以通過上調其下游抗凋亡因子的水平來發(fā)揮抗凋亡作用，其中包括Bcl-2蛋白家族，細胞凋亡抑制蛋白家族、腫瘤壞死因子受體相關因子家族等。研究還發(fā)現(xiàn)，NF-κB活化伴隨各種血管生成因子的活化，如成纖維生長因子、血管生成衍生生長因子、基質金屬蛋白酶等，能促進腫瘤血管的生成。耐藥的產(chǎn)生是導致MM治療失敗的重要原因，其中P-gp介導的多藥耐藥途徑是腫瘤細胞最為經(jīng)典的耐藥機制，由MDRl編碼的P-gp是一種跨膜蛋白，具有能量依賴性外排泵功能，能夠降低細胞內藥物濃度從而產(chǎn)生多藥耐藥。MDR1啟動區(qū)域的第1個外顯子包含1個純化的NF-κB結合序列(5′-CCTYTCGGGG-3′)，MDR1作為NF-κB的下游基因，能夠被NF-κB激活，使得基因轉錄增加，P-gp合成增加而導致耐藥的發(fā)生[8～10]。研究[11]還發(fā)現(xiàn)，青蒿琥酯能下調MM細胞抗凋亡蛋白Bcl-2表達，上調促凋亡蛋白Bax的表達，明顯抑制MM細胞的增殖并誘導其凋亡。研究[12，13]發(fā)現(xiàn)，青蒿琥酯還能通過下調VEGF的表達水平，抑制MM細胞誘導的的血管新生。進一步研究還發(fā)現(xiàn)，青蒿琥酯能下調耐藥蛋白P-gp的表達，逆轉對阿霉素、米托蒽醌、依托泊苷和甲氨蝶呤等多藥耐藥的MM細胞株的耐藥性[14]。

除了抑制NF-κB通路活化之外，青蒿琥酯的抗骨髓瘤作用還有多種機制參與，其中誘導自由基的產(chǎn)生及氧化應激方面值得關注。青蒿素類藥物中都含有獨特的過氧橋結構,在細胞內二價鐵離子的催化作用下，青蒿素類藥物中的過氧橋發(fā)生裂解，產(chǎn)生大量以青蒿素碳原子為中心的自由基和活性氧簇(ROS),這種獨特的作用機制可能其是殺傷具有耐藥性的瘧疾和腫瘤細胞的作用基礎[15，16]。Papanikolaou等[17]研究證實，青蒿琥酯能通過增加細胞內ROS的產(chǎn)生，促進線粒體膜間蛋白凋亡誘導因子及核酸內切酶G釋放及核轉位，誘導耐藥MM細胞株發(fā)生Caspase非依賴性的凋亡，其效應與細胞內二價鐵離子水平密切相關，提示青蒿琥酯通過ROS誘導的細胞凋亡亦可能是其克服MM細胞耐藥的重要作用機制之一。

綜上所述，青蒿琥酯可抑制MM.1S以及MM.1R細胞的增殖，下調MM.1R細胞NF-κB p65、P-gp蛋白的表達水平，抑制NF-κB活化、下調P-gp表達可能為青蒿琥酯克服MM細胞耐藥的機制之一，但其具體作用靶點以及對細胞凋亡相關信號通路的影響仍有待進一步研究。

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國家自然科學基金資助項目(81400168)；廣東省醫(yī)學科研基金資助項目(A2013128)；廣東省中醫(yī)藥局科研課題(20131104)；廣東省第二人民醫(yī)院人才引進基金項目(YY2014-002)。

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.07.010

R722.12

A

1002-266X(2017)07-0034-03

2016-09-17)