王欣麗，陳 亮，姜紫凡，張樹風

（1.濰坊醫(yī)學院臨床醫(yī)學院，山東濰坊261041；2.濰坊中西醫(yī)結合醫(yī)院保健中心，山東濰坊261041；3.濰坊市人民醫(yī)院保健科，山東濰坊261041）

MTHFR C677T基因多態(tài)性與老年心力衰竭患者心室重構的相關性

王欣麗1，陳 亮2，姜紫凡1，張樹風3

（1.濰坊醫(yī)學院臨床醫(yī)學院，山東濰坊261041；2.濰坊中西醫(yī)結合醫(yī)院保健中心，山東濰坊261041；3.濰坊市人民醫(yī)院保健科，山東濰坊261041）

目的探討MTHFR C677T基因的多態(tài)性分布，并分析與老年心力衰竭（HF）患者心室重構的相關性。方法入選診斷為老年HF患者98例（HF組），同期查體健康者40例為對照組。所有入選對象利用直接基因測序方法檢測MTHFR C677T基因多態(tài)性，同時檢測血漿同型半胱氨酸（Hcy）、腦鈉肽（NT-pro BNP）水平。測量左心室舒張末內徑（LVDd）、左心室后壁厚度（LVPWT）、室間隔厚度（IVST）及測算左心室射血分數（LVEF），計算左心室質量指數（LVMI）。結果HF組TT基因型頻率和T等位基因頻率明顯高于對照組（P＜0.05）；HF組Hcy、LVMI、NT-pro BNP均高于對照組，LVEF低于對照組（P＜0.05）；不同MTHFR C677T基因型者其血漿Hcy水平差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。HF組伴左心室肥厚組，TT基因型頻率及T等位基因頻率高于HF組不伴左心室肥厚組。HF組TT基因型患者LVMI高于CT及CC基因型患者，而LVEF則低于CT及CC基因型患者。結論MTHFR C677T基因型與老年HF患者心室重構相關，TT基因型及T等位基因的老年HF患者發(fā)生心室重構的可能性大。

心力衰竭；心室重構；多態(tài)性，單核苷酸；半胱氨酸；老年人

心力衰竭（heart failure，HF）是各種心臟疾病的終末階段，從病理生理看主要為早期代償性心肌肥厚到失代償性HF的過程，心室重構（ventricular remodeling，VR）是HF發(fā)生的根本。當前評估左心室心肌肥厚的重要指標是左心室質量指數［1］（left ventricular mass index，LVMI）。隨著老齡化社會程度的加重，我國HF的發(fā)病率和患病率逐年上升，醫(yī)療支出比重大。2015年的一項流行病學調查顯示，中國HF患者高達400萬，成年人HF的患病率為0.9%［2］，隨著年齡增長患病率升高。目前認為MTHFR C677T C→T突變后，造成高同型半胱氨酸血癥（hyper homocysteine，HHcy）［3］，是心血管疾病的獨立危險因素。而關于MTHFR C677T基因多態(tài)性與HF及心室重構的研究尚少。本研究探討老年HF患者MTHFR C677T基因多態(tài)性分布及與心室重構的關系。

1 資料與方法

1.1 研究對象 2014年9月至2015年9月濰坊市人民醫(yī)院保健科、心內科確診為老年HF的患者98例（HF組），男52例，女46例，所有入選者年齡均≥65歲，平均年齡（77.2±10.2）歲，其中冠心病34例，冠心病伴高血壓心臟病17例，冠心病合并糖尿病20例，冠心病合并肺心病22例，心臟瓣膜病5例。選擇同期40例體檢健康的老年人作為對照組，男19例，女21例，平均年齡（69.5±4.4）歲。兩組一般資料比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。HF診斷按照Framingham標準［4］。根據患者病史、癥狀、體征、心電圖、胸部X線及超聲心動圖等綜合診斷。排除標準：除外嚴重肝、腎功能不全，血液免疫系統(tǒng)疾病、嚴重感染、腫瘤和惡性心律失常等。

1.2 數據收集及標本準備 研究對象一般臨床資料包括：性別、年齡、身高、體質量、吸煙史、糖尿病史及高血壓病史。所有觀察對象于次日清晨空腹（禁飲食12小時）抽取外周靜脈血，測定總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、空腹血糖（FBG）、同型半胱氨酸（HCY）、腦鈉肽（NT-pro BNP）等，另取5 ml靜脈血置于內含乙二胺四乙酸（ethylene diamine tertra acete，EDTA）抗凝劑的試管中，于－70℃冰箱保存，用于提取DNA，待測MTHFR基因多態(tài)性。

1.3 MTHFR C677T基因多態(tài)性測定 ①DNA提?。喝∷杏^察者的冷凍乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝外周血，于37℃水浴迅速融化，采用全血基因組DNA快速提取試劑盒（天根生物）提取基因組DNA（提取方法按照廠家說明書步驟操作）。②PCR基因擴增：根據MTHFR基因序列，設計擴增引物為上游引物F：TGCCCAGTCCCTGTGGTCTCT下游引物R：GCCTTCACAAAGCGGAAGAAT由北京尤比愛生工合成。熱啟動DNA聚合酶購自大連寶生物公司。擴增條件：94℃解鏈5 min×1個循環(huán)；94℃變性30秒；60℃退火30秒；72℃延伸30秒35個循環(huán)；72℃延伸5分鐘1個循環(huán)。③基因測序：將PCR產物各取30μl送尤比愛生物工程（北京）股份有限公司基因測序。

1.4 左心室各指標測定 所有觀察對象均于濰坊市人民醫(yī)院超聲科行心臟彩色超聲檢查，應用GE vivid E9彩色多普勒超聲，分別測量左心室舒張末期內徑（LVDd）、室間隔厚度（IVST）、后壁厚度（LVPWT），左心室射血分數（LVEF），所有指標均測量3個心動周期后取平均值。根據Deiereux公式計算左心室質量（LVM），LVM（g）＝1.04×［（IVST＋PWT＋LVDd）3-LVDd3］－13.6，進而計算LVMI，LVMI（g／m2）＝LVM／BSA（體表面積），BSA（體表面積）（m2）＝0.0061×身高（cm）＋0.0128×體質量（kg）－0.1529。左心室肥厚（LVH）診斷標準，根據推薦標準：男＞125 g／m2女＞110 g／m2。

1.5 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 17.0軟件包進行統(tǒng)計處理，計量資料采用均數±標準差（±s）表示，分類資料采用百分比表示，組間頻率比較用χ2檢驗，組間連續(xù)變量采用單因素方差分析或獨立樣本t檢驗，Hardy-Weinberg平衡檢驗基因分布，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 一般資料比較 HF組在吸煙史、高血壓病、FBG、TG、LDL-C和Hcy均高于健康組，HDL-C低于對照組（P＜0.05）；兩組性別、年齡、身高、體質量和TC差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 兩組一般資料比較

2.2 MTHFR基因C677T測序結果 HF組和對照組所研究人群經χ2擬合優(yōu)度檢驗均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡（χ2＝1.080，P＞0.05），說明研究樣本具有群體代表性。HF組T等位基因的頻率與TT基因型頻率分別為57.0%，35.7%，明顯高于對照組（P＜0.01）。兩組T等位基因頻率分布差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見表2。各基因型測序結果見圖1～3。

表2 兩組基因型及其等位基因分布比較

圖1 CC基因型圖譜 灰色標注處提示樣本為野生型CC基因型

圖2 CT基因型圖譜 灰色標注處提示為C、T雙峰重疊，樣本實為C、T突變雜合子

圖3 TT基因型圖譜 灰色標注處提示所指C→T突變純合子

2.3 不同基因型間各指標比較 HF組TT基因型的Hcy、LVMI、Lg（NT-pro BNP）明顯高于CT、CC基因型，而LVEF明顯低于CT、CC基因型（P＜ 0.05）。對照組中Hcy、Hcy、LVMI、Lg（NT-pro BNP）差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），由于NT-pro BNP不服從正態(tài)分布，采用非參數檢驗，HF組與對照組各指標比較，兩組Hcy、Lg（NT-pro BNP）、LVEF（%）、LVMI差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見表3。

表3 不同基因型間各指標比較（±s）

注：與TT基因比較，*P＜0.05

組別基因型例數Hcy（μmol／L）Lg（NT-pro BNP）LVEF（%）LVMI（g／m2）對照組CC 21 10.26±2.25 2.01±0.36 68.2±10.2 91.11±18.63 CT 13 11.45±2.63 2.24±0.47 68.1±10.3 90.21±19.68 TT 6 11.41±2.95 2.21±0.52 67.8±28.2 91.68±19.53 F值0.302 0.494 1.677 0.241 P值＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05組別基因型例數Hcy（μmol／L）Lg（NT-pro BNP）LVEF（%）LVMI（g／m2）HF組CC 20 11.26±2.43*3.83±0.42*42.23±7.43*133.34±28.17*CT 43 15.51±2.57*3.82±0.41*37.24±6.30*159.46±23.69*TT 35 21.34±2.72 3.89±0.44 31.10±8.34 163.45±23.34 F值39.012 23.345 3.498 408.229 P值＜0.01＜0.01＜0.05＜0.01

2.4 MTHFR基因C677T基因多態(tài)性 HF組中伴左心室肥厚組與不伴左心室肥厚組基因型分布、等位基因分布差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。HF伴左心室肥厚組Hcy水平高于不伴左心室肥厚組。見表4。

3 討 論

冠心病和高血壓病是目前我國HF的主要病因。HF時心臟收縮舒張功能紊亂，泵血功能減弱，心室內血液滯留嚴重，室壁張力增加，從而發(fā)生心室重構。彩色超聲檢查可見各室腔內徑變大，心臟LVEF下降。MTHFR基因通過改變Hcy水平影響心血管系統(tǒng)，未來可能成為篩選心血管疾病的候選基因。人類MTHFR基因位于染色體第1號染色體，有11個外顯子和10個內含子組成，有20多種突變位點，其中以C677T和A1298C位點最為常見［5］。MTHFR基因突變位點于1995年首次被發(fā)現，該位點突變是心血管疾病的一個重要危險因素［6］。MTHFR C677T突變后導致其編碼蛋白質的氨基酸結構發(fā)生變化，第677位點纈氨酸被丙氨酸取代，改變了MTHFR酶的活性，造成HHcy。

表4 HF兩型組MTHFR C677T多態(tài)性分布

隨著年齡增加，老年人心血管彈性減低，患病風險升高，體內代謝異常，易導致MTHFR基因多態(tài)性發(fā)生，引起MTHFR酶活性下降，導致Hcy水平升高。近年來有關Hcy與HF研究頗多，2011年Veeranna等［7］在研究Hcy與冠心病關系時發(fā)現，HHcy可導致冠心病患者發(fā)生HF的概率倍增。Herrmann［8］研究顯示HHcy不僅與HF的發(fā)生有關，而且還與其嚴重程度有關。一項對Framingham心臟研究中心的2 000多例研究對象調查后發(fā)現，在女性觀察者中血漿Hcy水平與左心室質量及厚度呈正相關，在男性觀察者中未發(fā)現有相關性［9］。Blacher等［10］一項對在慢性腎臟病終末期患者的研究中發(fā)現，血漿Hcy與LVMI具有相關性，HHcy可以增加終末期腎臟病患者左心室肥大風險性。馬素霞等［11］對131例高血壓病患者，根據Hcy水平分為H高血壓組和非H高血壓組，發(fā)現Hcy可加重老年高血壓病患者的左心室肥厚。Fu等［12］研究表明H Hcy是冠心病的獨立危險因素，是心血管事件的獨立預測因子。上述研究證實Hcy水平與慢性HF有關，也與病情的嚴重程度有關。本研究結果示HF組Hcy明顯高于對照組，高Hcy可能是HF發(fā)病的危險因素。對各組不同基因型進行了Hcy比較，發(fā)現HF組TT基因型組的Hcy最高，CT組次之，CC組最低，說明Hcy的升高與純和TT突變有關。HF伴左心室肥厚組Hcy水平高于不伴左心室肥厚組，說明Hcy與心室重構有一定關系。

近年來對MTHFR基因的研究成為焦點，發(fā)現其與多種疾病有關，研究最多的為心腦血管疾?。?3］。有關研究發(fā)現MTHFR TT基因型能增加高血壓患者冠心病的風險［14］。王晟等［15］發(fā)現Mir-499b通過增強MTHFR的表達降低血清Hcy的表達量減少老年慢性HF的發(fā)病率。當MTHFR基因發(fā)生突變時，MTHFR酶活性改變，使Hcy水平升高，Hcy與老年HF關系密切，推測MTHFR基因與老年HF有關。本研究可見HF組中TT基因型頻率明顯高于對照組，T等位基因頻率分布高于對照組，提示MTHFR基因C677T位點TT基因型及T等位基因頻率與HF的發(fā)病有關。TT基因型頻率或T等位基因頻率可能是老年HF發(fā)病的危險因素。對HF組基因型分組研究后發(fā)現，TT基因型組LVMI和Lg（NT-pro BNP）顯高于CT、CC組，LVEF低于CT、CC組，提示TT基因型可能與心室重構及心功能嚴重程度有關。隨著心功能分級增加，LVEF下降，基因型不同LVEF也不同，LVEF可能與T等位基因頻率有關；LVMI在TT基因型組中最高，CT基因型組中次之，可見不同基因型中心肌肥厚程度不同，即心室重構水平不同，病情嚴重程度不同。LVMI是目前反映心室重構最佳指標，能排除身高、體質量及個體大小等影響因素。老年HF組伴LVH者T等位基因頻率及TT基因型頻率明顯高于無LVH的HF患者，提示攜帶TT基因型的HF患者更易發(fā)生心室重構。推測TT基因型者血漿Hcy水平高，其對心血管的影響加快了心室重構的進程。研究發(fā)現［16-18］Hcy通過氧化應激反應，導致一氧化氮（NO）功能失活，損傷內皮依懶的血管舒張功能，致細胞間的支架結構嚴重受損致，從而對心肌及心肌細胞產生的損害，發(fā)生心肌重塑。也可以通過增加其金屬蛋白酶活性，導致心肌肥大和心肌組織損傷，加劇心肌纖維化，引起心肌重構。Hcy也可導致血管壁重構。國內外有關MTHFR基因C677T與心室重構機制的研究甚少，推測基因可能是通過改變Hcy水平，進而對心室重構產生影響。

總之，本研究發(fā)現MTHFR C677T基因多態(tài)性和老年HF患者心室重構有一定相關性，研究以LVMI作為心室重構的量化指標，更接近真實情況。然而HF的病理生理過程非常復雜，盡管有研究顯示心室重構、基因多態(tài)性可能是其發(fā)生發(fā)展的關鍵因素，但其發(fā)病機制還未明確。本研究入選的樣本量有限，研究過程中沒有考慮到飲食、環(huán)境等因素的影響，所得的結論仍需要更多的大樣本臨床研究進行驗證。

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MTHFR C677T gene poIymorphism and ventricuIar remodeIing in eIderIy patients with heart faiIure

Wang Xinli1，Chen Liang2，Jiang Zifan1，Zhang Shufeng3
1.The Clinical Medical College，Weifan g Medical University，Weifan g 261041，China；2.Health Care Center，Weifang Integrated Traditional Chinese an d Western Medicine Hospital，Weifang 261041，China；3.Department of Health Care，Weifang People＇s Hespital，Weifang 261041，China Corresponding author：Chen Liang，Email：wfbjliang＠163.com

ObjectiveTo investigate the distribution of MTHFR C677T genotypes on the subjects，and analyze its relationship to the ventricular remodeling in elderly patients with heart failure（HF）.MethodsThe study involved 98 patients with HF as HF group，40 health people from body check as normal control group.MTHFR C677T gene polymorphism was detected by PCR-direct sequencing method.Meanwhile，plasma total homocysteine（Hcy）and brain natriuretic peptide（BNP）were measured.Left ventricular remodeling was evaluated by calculating the left ventricular end-diastolic diameter（LVDd），left ventricular posterior wall thickness（LVPWT），interventricular septal thickness（IVST）and left ventricular ejection fraction（LVEF），left ventricular mass index（LVMI）of the subjects in two groups.ResuItsCompared with those of control group，the genotype TT and allele T frequencies of C677T in MTHFR gene in HF group were significantly higher（P＜0.05）.Hcy，LVMI and NT-pro BNP in HF group were higher than those in control group（P＜0.05）.In HF group，LVMI was the highest，while LVEF was the lowest in TT genotype among three genotypes（P＜0.05）.The frequencies of genotype TT and allele T in HF group with left ventricular hypertrophy（LVH）group were higher than those in HF without LVH group（P＜0.05）.ConcIusionThe MTHFR genotypes have correlation with the ventricular remodeling in elderly HF patients，and the patients with TT genotype or T allele are easier to develop into LVH.

heart failure；ventricular remodeling；polymorphism，single nucleotide；cysteine；aged

R541.6

：A

：1004-583X（2017）03-0212-05

10.3969／j.issn.1004-583X.2017.03.008

2016-10-17 編輯：武峪峰

山東省醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展計劃項目（2013WS0047）

陳亮，Email：wfbjchliang＠163.com