李嘉琳，李夢詩，李斌，亓翠玲，王麗京

(廣東藥科大學基礎學院血管生物學研究所，廣州 510006)

P-選擇素缺失對小鼠生理特征的影響

李嘉琳，李夢詩，李斌，亓翠玲，王麗京*

(廣東藥科大學基礎學院血管生物學研究所，廣州 510006)

目的 探討P-選擇素基因(P-selectin)缺失對小鼠生理特征的影響。方法 P-選擇素敲除(PKO)小鼠和C57小鼠飼養(yǎng)于SPF級環(huán)境中，通過基因鑒定確定其為純和PKO小鼠。觀察PKO小鼠的活動狀態(tài)、繁育狀況，檢測血常規(guī)，確定P-選擇素敲除后對小鼠一般情況的影響。分別于6周和18周處死小鼠，通過伊紅&蘇木素(HE)染色，觀察P-選擇素敲除后對小鼠各個臟器組織結構的影響。結果 PKO小鼠與正常C57小鼠的繁育狀況相似，血常規(guī)無異常，HE染色發(fā)現(xiàn)PKO小鼠肝、脾、肺、腎組織結構均較正常。結論 P-選擇素的缺失不會對小鼠生殖繁育、血液造成影響，對重要的組織臟器也未見明顯影響，為以后進一步研究P-選擇素在疾病中的作用提供了動物模型研究理論基礎。

P-選擇素；P-選擇素敲除小鼠；動物模型

P-選擇素(CD62P)是選擇素家族中的一員，還包括L-選擇素(CD62L)和E-選擇素(CD62E)，這些選擇素主要在白細胞和血管內皮細胞之間發(fā)揮作用，介導兩者之間的粘附作用。當發(fā)生血栓或炎癥反應時，儲存于血小板α-顆粒和血管內皮細胞Weibel-Palade小體中的P-選擇素[1-3]迅速表達于血小板和內皮細胞表面，與P-選擇素配體(PSGL-1)結合介導血小板、內皮細胞與單核、中性粒細胞之間的粘附作用，因此P-選擇素在血栓形成和炎癥反應中發(fā)揮著重要作用[4]。P-選擇素還可以促進腫瘤的生長[5-6]?；蚬こ绦∈?GEM)是對實驗小鼠基因組進行有目的地改造，使其具有某種生物特性以便于對這種基因功能進行研究[7]。本實驗小鼠為P-選擇素基因敲除小鼠(PKO小鼠)，旨在通過對PKO小鼠進行生物學特征及組織病理學觀察，研究P-選擇素缺失后對小鼠一般生理特征的影響，為進一步研究P-選擇素在疾病中的作用提供提供了動物模型研究理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級P-選擇素(P-selectin)基因敲除小鼠(簡稱PKO小鼠)純合子雌雄各兩只，6～8周齡，體重18～22 g，購于美國 Jackson 實驗室，由密歇根大學耿建國教授惠贈，背景為C57BL/6J(簡稱C57)小鼠。清潔級C57小鼠20只，雌雄各半，5～6周齡，體重18～22 g，購自廣東省醫(yī)學實驗動物中[SCXK(粵)2014-0035]。所有小鼠組織取材于廣東藥科大學實驗動物中心動物實驗設施內進行[SYXK(粵)2012-0125]。所有操作符合實驗倫理委員會的要求。

1.2 主要儀器及試劑

顯微鏡(徠卡公司)；PCR儀(美國應用生物系統(tǒng)公司)；石蠟切片機(徠卡公司)；包埋機(YAGUANG)；生物組織攤烤片機(YAGUANG)；凝膠成像儀(基因有限公司)；低溫離心機(美國熱電公司)；VMC64S7獨立送回風凈化籠具(蘇杭實驗動物設備廠)；制冰機(勱克生物公司)；蛋白酶K、dNTP(Sigma公司)；PCR引物合成(上海英濰捷基公司)；二甲苯、乙醇(廣州康龍公司)；抗凝管(廣州康龍公司)；乙醚(廣州康龍公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 小鼠的飼養(yǎng)和繁育

C57 PKO小鼠飼養(yǎng)于SPF環(huán)境中，光照控制(12 h明/12 h暗)，室溫22～26℃，相對濕度50%～65%。將雄性和雌性PKO小鼠以1∶1進行全同胞兄妹方式交配，懷孕的母鼠單獨放置一個籠位。每天觀察小鼠的活動狀態(tài)及飲食情況，及時記錄小鼠受孕時間及產仔數(shù)，對配對的小鼠定期給予一定量的葵瓜子或煮熟的雞蛋以補充營養(yǎng)。

1.3.2P-selectin基因的鑒定

(1)PKO小鼠組織DNA的提取

75%乙醇消毒剪刀后剪取約2 mm的鼠尾于1.5 mL離心管中，加入25 mmol/L NaOH 500 μL，使組織完全浸沒，金屬浴100℃ 1 h，冷卻后加入40 mmol/L TrisHCl(pH 5.5)500 μL，離心3000 r/min 5 min。取1 μL上清進行PCR反應。

(2)擴增目的條帶

引物1： 5′-CTG AAT GAA CTG CAG GAC GA-3′; 引物2： 5′-ATA CTT TCT CGG CAG GAG CA-3′; 引物3： 5′-TTG TAA ATC AGA AGG AAG TGG-3′; 引物4： 5′-AGA GTT ACT CTT GAT GTA GAT CTCC-3′。PCR反應物配制：2X Mix 25 μL，引物1、2、3、4各1 μL，三蒸水20 μL，DNA 1 μL，總體積50 μL。PCR反應條件：94℃變性3 min，94℃ 20 s，64℃ 30 s( 每個循環(huán)依次減少0.5℃ )，72℃ 35 s，共循環(huán)12次；94℃ 20 s，58℃ 30 s，72℃ 35 s，共循環(huán)25次；72℃延伸 2 min，10℃冷卻擴增產物。

(3)瓊脂糖電泳及基因型鑒定

制備1.2%瓊脂糖凝膠電泳，取7.5 μL的PCR產物及DNA marker分別加入孔中，進行電泳分析。PKO-/-只有1條帶為172 bp,PKO+/-有兩條帶，1條帶為322 bp,另1條帶為172 bp。

1.3.3 血常規(guī)

選擇成熟的雄性小鼠C57和PKO各6只，乙醚麻醉后，從眼框靜脈叢取血200 μL，EDTAK2抗凝，冰上送檢至廣東省動物檢測所，檢測以下血常規(guī)指標，紅細胞計數(shù)(RBC)、白細胞計數(shù)(WBC)、血小板計數(shù)(PLT)、中性粒細胞數(shù)、淋巴細胞數(shù)、單核細胞數(shù)、嗜酸性細胞數(shù)、嗜堿性細胞數(shù)等。

1.3.4 HE染色

分別選擇6周和18周的C57和PKO小鼠，脫頸椎法處死，取心肝脾肺腎組織，4%中性甲醛溶液固定12～24 h后脫水處理，脫水順序為70%乙醇30 min，80%乙醇30 min，95%乙醇30 min，無水乙醇I，無水乙醇II，二甲苯I，二甲苯II，低熔點蠟，高熔點蠟(60℃)均1 h，常規(guī)包埋切片，切片厚度為4 μm。脫蠟：按照常規(guī)脫蠟方法，二甲苯I，二甲苯II各20 min，無水乙醇，95%乙醇各1 5min，95%乙醇10 min，90%乙醇5 min,80%乙醇5 min進行脫蠟。PBS洗一次，蘇木素染色2 min，流水反藍30 min，伊紅染色20 s，常規(guī)脫水處理，晾干后中性樹膠封片。顯微鏡下觀察，取視野正中部分100倍、400倍拍照。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計軟件,計量資料采用t檢驗或方差分析，以P< 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 PKO小鼠鑒定

注：M.DNA marker 1000；1～3.PKO-/-； 4.PKO+/-。圖1 P-選擇素基因敲除小鼠的鑒定圖Note.M.DNA marker 1000；1～3.PKO-/-； 4.PKO+/-.Fig.1 Identification of PKO mice

為確定該小鼠確為PKO小鼠，我們對其基因進行鑒定。PKO-/-：只有1條帶，為172 bp，如圖1中，1～3號均為PKO-/-；PKO+/-有兩條帶，1條帶為322 bp，另1條帶為172 bp，如圖1中4號所示。

2.2 PKO小鼠繁育情況

將8～10周的雄性和雌性PKO小鼠1∶1進行配種，共4籠。通過觀察發(fā)現(xiàn)PKO小鼠的繁育周期與正常C57小鼠一樣均為1個月左右，且每胎產仔數(shù)與C57小鼠相似，說明P-選擇素基因的敲除，對小鼠生殖繁育沒有影響。

圖2 PKO小鼠繁育周期和每窩產仔數(shù)與正常C57小鼠相似Fig.2 Days of reproductive cycle and number of puppies per litter of the mice

2.3 PKO小鼠主要臟器與正常小鼠C57組織病理學觀察對比

2.3.1 P-選擇素基因的缺失對小鼠肝組織結構無影響

分別于6周和18周時處死PKO小鼠和C57小鼠，石蠟包埋HE染色后分別在低倍鏡(×100)及高倍鏡(×400)進行組織病理學觀察下，我們發(fā)現(xiàn)PKO小鼠和C57小鼠肝組織結構均較正常。P-選擇素基因的缺失不會對小鼠肝組織結構產生影響。(見圖3)

2.3.2 P-選擇素基因的缺失對小鼠脾組織結構無影響

分別于6周和18周時處死PKO小鼠和C57小鼠，石蠟包埋HE染色后分別在低倍鏡(×100)及高倍鏡(×400)進行組織病理學觀察下，我們發(fā)現(xiàn)PKO小鼠和C57小鼠脾組織結構均較為正常。P-選擇素基因的缺失不會對小鼠脾組織結構產生影響。(見圖4)

2.3.3 P-選擇素基因的缺失對小鼠肺組織結構無影響

分別于6周和18周時處死PKO小鼠和C57小鼠，石蠟包埋HE染色后分別在低倍鏡(×100)及高倍鏡(×400)進行組織病理學觀察下，我們發(fā)現(xiàn)PKO小鼠和C57小鼠肺組織結構均較為正常。P-選擇素基因的缺失不會對小鼠肺組織結構產生影響。(見圖5)

2.3.4 P-選擇素基因的缺失對小鼠腎臟組織結構無影響

分別于6周和18周時處死PKO小鼠和C57小鼠，石蠟包埋HE染色后分別在低倍鏡(×100)及高倍鏡(×400)進行組織病理學觀察下，我們發(fā)現(xiàn)PKO小鼠和C57小鼠腎組織結構均較正常。P-選擇素基因的缺失不會對小鼠腎組織結構產生影響。(見圖6)

注：PKO和C57小鼠分別在6周和18周時，通過低倍鏡(×100)及高倍鏡(×400)對肝組織進行病理學觀察。圖3 PKO和C57小鼠肝臟組織HE染色Fig.3 Histology of the liver of 6-week-old and 18-week-old PKO mice and C57 mice.HE staining.×100 and ×400

注：PKO和C57小鼠分別在6周和18周時，通過低倍鏡(×100)及高倍鏡(×400)對脾組織進行病理學觀察。圖4 PKO和C57小鼠脾臟組織HE染色Fig.4 Histology of the spleen of 6-week-old and 18-week-old PKO mice and C57 mice.HE staining.×100 and ×400

2.4 PKO小鼠血常規(guī)檢測

通過血常規(guī)檢測紅細胞計數(shù)(圖7A RBC)、白細胞計數(shù)(圖7B WBC)、血小板計數(shù)(圖7C PLT)、淋巴細胞數(shù)(圖7D)、單核細胞數(shù)(圖7E)、中性粒細胞數(shù)(圖7F)、嗜酸性粒細胞數(shù)(圖7G)發(fā)現(xiàn)PKO小鼠的血常規(guī)均在正常范圍內(見圖7)。

3 討論

粘附分子(adhesion molecules, AM)是一類主要分布在細胞表面或是細胞外基質中的蛋白質，大多為糖蛋白主要介導細胞與細胞之間或細胞與細胞外基質之間的粘附作用[10]。L選擇素(L-selectin)、E-選擇素(E-selectin)和P-選擇素(P-selectin)是選擇素家族成員，由最初發(fā)現(xiàn)這三種選擇素的三種細胞leukocyte、endothelium和platelet命名，參與多種生理及病理過程，如介導淋巴細胞歸巢、白細胞浸潤炎癥組織、血栓形成以及腫瘤轉移等。P-選擇素主要存儲于血小板的α顆粒和內皮細胞的韋伯氏小體中，當血小板或內皮細胞活化后，P-選擇素迅速表達于血小板(僅需幾秒)或內皮細胞(需數(shù)分鐘)的表面，介導血小板或內皮細胞與白細胞之間的粘附作用，從而在血栓形成和炎癥反應中具有重要作用[11]。近年來發(fā)現(xiàn)P-選擇素在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中也具有重要作用，例如，我們實驗室亓翠玲等[6]發(fā)現(xiàn)P-選擇素介導的血小板粘附促進腫瘤的生長，血小板可以促進腫瘤的發(fā)生，P-選擇素的缺失可抑制血小板在腫瘤組織的聚集，減少血管內皮分泌生長因子及血管形成，從而抑制腫瘤生長。P-選擇素的配體如P-選擇素糖蛋白配體-1 ( PSGL-1 )，表達于多種腫瘤細胞上，如肺癌、肝癌、乳腺癌、結直腸癌、腎癌、鱗狀上皮癌等，通過與P-選擇素結合介導腫瘤細胞與血小板或內皮細胞的黏附，從而促進腫瘤細胞生長及轉移[12]。另有報道發(fā)現(xiàn)在腫瘤組織中P-選擇素表達增加促進新生血管的形成，并且細胞表面黏附分子和內皮細胞間的相互作用對于腫瘤的轉移和新生血管形成有著重要作用[13]。

注：PKO和C57小鼠分別在6周和18周時，通過低倍鏡(×100)及高倍鏡(×400)對肺組織進行病理學觀察。圖5 PKO和C57小鼠肺組織HE染色 and high power lens(×400). Fig.5 Histology of the lungs of 6-week-old and 18-week-old PKO mice and C57 mice.HE staining.×100 and ×400

注：PKO和C57小鼠分別在6周和18周時，通過低倍鏡(×100)及高倍鏡(×400)對腎組織進行病理學觀察。圖6 PKO和C57小鼠腎組織HE染色Fig.6 Histology of the kidneys of 6-week-old and 18-week-old PKO mice and C57 mice.HE staining.×100 and ×400

綜上所述，通過對P-選擇素基因敲除小鼠一般狀態(tài)的觀察及重要組織臟器的HE染色，發(fā)現(xiàn)P-選擇素基因的缺失不會對PKO小鼠的生殖和繁育造成影響，對血液、各主要臟器無明顯影響，說明P-選擇素的缺失對小鼠一般生理功能沒有影響。通過對P-選擇素基因敲除小鼠生理特征的研究，為P-選擇素與腫瘤、炎癥等疾病的研究提供了動物模型研究理論基礎。總之，通過對轉基因動物生物學特征和病理學的觀察，對探究基因與疾病關系和新藥研發(fā)具有重要意義。

注：(A)紅細胞計數(shù)(RBC)；(B)白細胞計數(shù)(WBC)；(C)血小板計數(shù)(PLT)；(D)淋巴細胞數(shù)；(E)單核細胞數(shù)；(F)中性粒細胞數(shù)；(G)嗜酸性細胞數(shù)。圖7 PKO小鼠與C57小鼠血常規(guī)比較Note.(A)Red blood cell count;(B)White blood cell count;(C)Blood platelet count; (D)Lymphocyte count;(E)Monocyte count;(F)Neutrophil count;(G)Eosnophil count.Fig.7 Comparison of the routine blood test of ther PKO and C57 mice

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Effects ofP-selectingene knockout on the biological characteristics of mice

LI Jia-lin，LI Meng-shi，LI Bin，QI Cui-ling，WANG Li-jing*

(Vascular Biology Center， Guangdong Pharmaceutical University， Guangzhou 510006， China)

Objective To investigate the effects ofP-selectingene knockout on the biological characteristics of mice. MethodsP-selectinknockout (PKO) mice and C57BL/6 mice were housed in SPF environment. To make sure that the mice were pure PKO mice by gene identification. To determine the general condition, the activity status, reproduction ofP-selectinknockout mice were observed and tested. HE staining was used to observed the histological morphology and structures of 6-week-old and 18-week-oldP-selectinknockoutout mice. Results PKO mice and C57 mice have similar multiplication, there was no significant difference in reproduction and blood routine test. The stuctures of liver, spleen, lung and kidney were normal. ConclusionsP-selectinknockout has no significant effects on reproduction, blood routine test and major organs.This research provides animal model theoretical basis for further study on the effects of P-selection in diseases.

P-selectin;P-selectinknockout mice; Animal model

WANG Li-jing, E-mail: wanglijing62@163.com

國家自然科學基金面上項目(31471290)；廣東省科技計劃項目(51343072)。

李嘉琳(1990-),女，碩士研究生，專業(yè)：病理學與病理生理學。E-mail: lijialin124@163.com

王麗京(1962-),女，教授，研究方向：腫瘤微環(huán)境、模式動物疾病模型。E-mail: wanglijing62@163.com

Q95-33

A

1005-4847(2017) 01-0014-06

10.3969/j.issn.1005-4847.2017.01.003

2016-06-27