蘭霄霄，周志陽，徐欣欣，吳雪清

（溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 婦產(chǎn)科，浙江 溫州 325015）

卵巢癌是高度惡性的腫瘤，是婦科癌癥相關(guān)性死亡的主要原因，主要發(fā)生于絕經(jīng)后的婦女，由于缺乏特異性癥狀和體征，發(fā)現(xiàn)時多為進展期，常伴有廣泛的腹腔轉(zhuǎn)移，5年生存率＜25%，預后較差[1]。然而目前常用的篩查方法如血清CA-125測定和經(jīng)陰道超聲或兩者聯(lián)合運用對早期、可治愈性卵巢癌的檢出率均不高，因此亟需一種高效的早期篩查方法，以提高卵巢癌的早期檢出率。此外，治療耐藥是卵巢癌患者治療過程中的一大難題，也是引起患者死亡的一個主要原因，但耐藥機制目前尚不完全清楚。

細胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）是一種雙層膜囊泡，根據(jù)其直徑大小、形狀、來源等不同可以分為外泌體、微囊泡、癌小體等[2]。EVs幾乎可以由所有類型的細胞釋放，內(nèi)含有許多功能活性物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、mRNA、microRNA（miRNA）等，能通過水平轉(zhuǎn)移或細胞-受體相互作用來進行內(nèi)容物的傳遞，在局部和遠處細胞間的信號交流中發(fā)揮重要的作用[3]。并且，在正常人群和癌癥患者如卵巢癌患者中，EVs的數(shù)量及其內(nèi)容物的組成和含量均有所不同。因此，EVs有望成為卵巢癌早期診斷的生物標志物，為卵巢癌的診斷和治療提供新的思路。

1 EVs的生物學特點

1.1 EVs的形成與分泌 EVs是由各種類型細胞釋放的雙層膜囊泡，它們可以被分泌到細胞間隙也可以被分泌到循環(huán)體液中并向遠處遷移直至被受體細胞攝取[4]。目前的研究主要將EVs分為外泌體和微囊泡兩大類。其中外泌體是1983年首次在綿羊網(wǎng)織紅細胞中被發(fā)現(xiàn)的，當時被稱為“外化囊泡”[5]，是一種直徑為30～100 nm的碟形雙層膜囊泡。外泌體的形成始于細胞質(zhì)膜向內(nèi)出芽，細胞質(zhì)膜出芽使得膜蛋白被包被在其中形成早期內(nèi)涵體。內(nèi)涵體膜進一步收縮入鞘，細胞溶質(zhì)蛋白和核酸選擇性地被包裹入內(nèi)涵體中形成腔內(nèi)囊泡（intraluminal vesicles，ILVs），含有多個ILVs的內(nèi)涵體則進一步成熟為多囊泡體（multivesicular bodies，MVBs）。隨后，成熟的MVBs一部分與胞質(zhì)中的溶酶體融合被降解，而另一部分則與質(zhì)膜融合并將其中的ILVs釋放到細胞外，這些被釋放出細胞的囊泡，就稱為外泌體[1，6-7]。外泌體中特異性內(nèi)容物的選擇過程受內(nèi)體分選轉(zhuǎn)運復合物（endosomal sorting complex required for transport，ESCRT）調(diào)控。BAIETTI等[8]發(fā)現(xiàn)用RNA干擾沉默ESCRT的關(guān)鍵成分，比如腫瘤易感基因101（TSG101，又稱ESCRT-I）、空泡蛋白分選（VPS）22（又稱ESCRT-I I）等，明顯減少了MCF-7細胞中外泌體的產(chǎn)生與分泌。而外泌體與質(zhì)膜的融合和釋放過程則被認為主要受RAB蛋白家族調(diào)控[9]。與外泌體不同，微囊泡直徑較大，最大可達1 000 nm，它直接從質(zhì)膜向外出芽釋放到細胞間隙[7，10]。雖然微囊泡和外泌體在直徑和形成過程中有明顯的差異，但是研究者們認為微囊泡形成過程的調(diào)節(jié)與外泌體相似，微囊泡和外泌體的拓撲結(jié)構(gòu)相似。此外，近期的研究發(fā)現(xiàn)在微囊泡直接從質(zhì)膜上出芽脫落的過程中，抑制蛋白結(jié)構(gòu)域蛋白1（arrestin domain-containing protein 1，ARRDC1）與ESCRT成分TSG101發(fā)生相互作用[11]，這說明微囊泡的形成過程也有ESCRT的參與。因此，目前很多研究不將兩者進行詳細區(qū)分，而直接稱為EVs。

1.2 EVs的內(nèi)容物與功能 細胞之間可以通過釋放蛋白質(zhì)、核酸以及脂質(zhì)等分子到胞外，與受體結(jié)合從而介導細胞間的信號轉(zhuǎn)導。除了這些單分子以外，細胞還可以釋放EVs，通過水平轉(zhuǎn)移功能性miRNA和蛋白質(zhì)等物質(zhì)到受體細胞，改變受體細胞的功能[3]。其中miRNA通過連接到靶mRNA的3’非編碼區(qū)進而抑制靶基因翻譯為蛋白質(zhì)。EVs與靶細胞聯(lián)系的機制目前公認的有以下3種：①直接與靶細胞膜融合，釋放內(nèi)容物到靶細胞中；②通過內(nèi)吞作用被靶細胞攝??；③識別并結(jié)合靶細胞表面的特異性受體[12]。EVs中含有許多功能活性物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸，這些物質(zhì)能隨EVs一起出現(xiàn)在大多數(shù)循環(huán)體液中，而且其內(nèi)容物的組成及含量與起源細胞、產(chǎn)生方式、細胞狀態(tài)以及所處的環(huán)境相關(guān)。腸上皮細胞來源的外泌體含有多種代謝酶及腸組織特異性A33抗原，B細胞來源的外泌體富含CD86和MHC分子，T細胞來源的外泌體表面有促凋亡的FasL受體。EVs的功能取決于其所含有的內(nèi)容物，而內(nèi)容物取決于它們的起源細胞。例如，骨細胞釋放的微囊泡能激發(fā)骨礦化作用[13]，而正常內(nèi)皮細胞釋放的微囊泡則參與血管生成[14]。此外，許多腫瘤細胞釋放的微囊泡能夠促進腫瘤細胞的侵襲以及免疫逃避作用[15]。

2 EVs在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用

雖然在正常生理狀態(tài)下細胞也會釋放EVs，但是在病理狀態(tài)下會發(fā)生EVs的異常釋放，并且與疾病的發(fā)生、發(fā)展息息相關(guān)。腫瘤細胞釋放微囊泡的數(shù)量被證實與腫瘤的侵襲能力相關(guān)。已有研究表明，EVs介導物質(zhì)運輸?shù)浇徍瓦h處細胞影響腫瘤發(fā)展的許多過程，包括促進血管生成，逃避免疫監(jiān)視，侵襲轉(zhuǎn)移，耐藥等[16]。

2.1 血管生成 血管生成是腫瘤存活和生長至關(guān)重要的一個步驟。通過內(nèi)皮細胞的增殖形成一個血管網(wǎng)浸潤入腫瘤，為腫瘤的生長提供營養(yǎng)和氧氣，同時排出代謝廢物[17]。在正常以及腫瘤狀態(tài)下，內(nèi)皮細胞介導的基質(zhì)重組是血管形成的一個關(guān)鍵步驟，基質(zhì)降解蛋白酶，尤其是基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）能促進這一過程的進行。卵巢癌細胞系，如CABA1和A2780，釋放的EVs中含有血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）以及MMPs，能刺激內(nèi)皮細胞的運動性和侵襲性[18]。除了生長因子和蛋白酶外，EVs還能通過介導miRNA的轉(zhuǎn)運，修飾內(nèi)皮細胞的翻譯以刺激血管形成，進而促進腫瘤血管表型的獲得[19]。

2.2 微環(huán)境 在肺癌模型中缺氧能誘導腫瘤細胞釋放EVs[20]，這表明不利的腫瘤微環(huán)境在某種程度上能觸發(fā)腫瘤細胞釋放EVs，進而為腫瘤細胞提供營養(yǎng)和氧氣，促進血管的生成。腫瘤微環(huán)境中富含腫瘤細胞釋放的EVs，近來越來越多的證據(jù)表明這種EVs是促進惡性腫瘤進展的一個重要因素。腫瘤細胞能與細胞外基質(zhì)發(fā)生相互作用，并且主動地對微環(huán)境進行修飾使其利于自身的生存和發(fā)展。而EVs正是介導腫瘤細胞和微環(huán)境中其他細胞之間信息交流的重要介質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，一種侵襲性前列腺癌細胞系PC3釋放的微囊泡能觸發(fā)周圍微環(huán)境成纖維細胞中細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）磷酸化，上調(diào)MMPs的表達，增加該細胞的活動性并抑制其凋亡。隨后，這種活化的成纖維細胞釋放的微囊泡促進了前列腺癌細胞的遷移和侵襲[21]。在微環(huán)境中，黑色素瘤細胞來源的外泌體通過自分泌/旁分泌信號通路與周圍非腫瘤細胞進行信息交流，并對其進行改造，進而促進原始黑色素細胞發(fā)生類似上皮間質(zhì)化（epithelial-to-mesenchymal transition，EMT）的轉(zhuǎn)變，而EMT能減少細胞之間的黏附，是腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移所必需的一個過程，這就為腫瘤自身的增殖和轉(zhuǎn)移提供良好的微環(huán)境。此過程中涉及絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路的激活，同時還有Let-7i（血清外泌體中一個上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的miRNA調(diào)節(jié)器）的參與，兩者共同促進了黑色素瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[22]。因此，血清外泌體中EMT的miRNA調(diào)節(jié)器可能成為黑色素瘤轉(zhuǎn)移的一個潛在生物標志或是治療靶點。

轉(zhuǎn)移前利基形成是大量腫瘤細胞進入候選轉(zhuǎn)移位點前的一個準備環(huán)節(jié)，這種利基能支持將來腫瘤細胞的植入和存活[23]。研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)移前利基的形成有賴于腫瘤細胞釋放的外泌體[24]。COSTASILVA等[25]發(fā)現(xiàn)胰腺導管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC）細胞釋放含有巨噬細胞遷移抑制因子（macrophage migration inhibitory factor，MIF）的外泌體能優(yōu)先連接到肝臟的庫普弗細胞上，誘導庫普弗細胞釋放轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor β，TGFβ），后者促進肝星狀細胞活化，進而上調(diào)纖連蛋白的表達，隨后骨髓來源的巨噬細胞被招募到富含纖連蛋白的肝臟位點中，最終導致胰腺導管腺癌轉(zhuǎn)移前利基的形成，為將來PDAC轉(zhuǎn)移到肝臟創(chuàng)造合適的微環(huán)境。此外，該團隊還發(fā)現(xiàn)，與診斷后5年內(nèi)無明顯疾病證據(jù)的患者以及健康人群相比，診斷后5年內(nèi)有進展性疾病的PDAC患者外泌體中MIF的水平明顯升高，這意味著外泌體中的MIF有望成為PDAC診斷和預后的生物標志物。

2.3 免疫逃逸 在癌癥發(fā)展的早期，宿主細胞通過免疫監(jiān)視引起自發(fā)性癌癥免疫反應，從而控制癌癥的生長。然而隨著癌癥的進展，腫瘤細胞采取免疫逃避機制沉默自身的免疫原性物質(zhì)或者活化免疫抑制信號通路使得宿主的這種調(diào)控機制失效[26]。VALENTI等[27]在體內(nèi)外實驗中，直接將人黑色素瘤或者結(jié)直腸癌細胞釋放的微囊泡與單核細胞融合抑制了單核細胞向抗原提呈細胞分化。此外，腫瘤細胞外泌體還能夠釋放一些因子抑制自然殺傷細胞的活性并誘導T細胞凋亡[28]，說明EVs在腫瘤細胞免疫逃逸過程中起到促進作用。

2.4 侵襲和轉(zhuǎn)移 細胞外基質(zhì)降解是腫瘤轉(zhuǎn)移過程中必不可少的一個環(huán)節(jié)。EVs中含有許多蛋白酶，比如MMP2、MMP9以及MT1-MMP等，能促進基質(zhì)的降解。研究表明晚期卵巢癌患者比早期患者腹水中含有更多數(shù)量的EVs[29]，這意味著侵襲性EVs與腫瘤進展之間有相互聯(lián)系。除了基質(zhì)降解，血管破壞也是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的一個重要過程。ZHOU等[30]用轉(zhuǎn)移性乳腺癌細胞MDA-MB-231（MBC）及正常人上皮細胞MCF-10A所分泌的外泌體作為研究模型，經(jīng)體內(nèi)外實驗后發(fā)現(xiàn)miR-105在MBC外泌體中表達較高。血管內(nèi)皮細胞緊密連接蛋白ZO-1基因的3’UTR區(qū)域有2個miR-105結(jié)合位點，高表達miR-105的MBC外泌體與該位點結(jié)合后能下調(diào)血管內(nèi)皮細胞ZO-1的表達，進而破壞內(nèi)皮屏障，使得血管通透性提高，而使用抗miR-105復合物則可以有效修復血管通透性，恢復ZO-1表達。這說明腫瘤細胞通過表達并分泌高水平miR-105外泌體，下調(diào)內(nèi)皮細胞中ZO-1的表達，破壞內(nèi)皮屏障，進而增強腫瘤細胞的浸潤轉(zhuǎn)移能力。由于miR-105的促轉(zhuǎn)移作用，它或許可以成為一個用于預測或診斷乳腺癌轉(zhuǎn)移的生物標志物，在了解miR-105的調(diào)控機制后，可以更進一步針對其調(diào)控通路，設(shè)計靶向藥物，或直接抑制miR-105，為乳腺癌的治療提供新策略。

2.5 耐藥 耐藥問題是腫瘤治療過程中的一大障礙，是關(guān)系腫瘤患者預后的一個重要因素。細胞外囊泡可以通過從腫瘤細胞中排出治療性藥物而促進腫瘤細胞的增殖和進展，進而誘導耐藥。SAFAEI等[31]發(fā)現(xiàn)順鉑不敏感性腫瘤細胞釋放的微囊泡中順鉑的含量是順鉑敏感性細胞釋放的微囊泡的2.6倍，這表明EVs可以通過積累并外排化療藥物而參與腫瘤細胞的耐藥過程。除了作為藥物排出泵，EVs還可以通過改變化療敏感細胞的基因表達情況來誘導腫瘤細胞耐藥。CHEN等[32]分別對耐藥乳腺癌細胞系MCF-7/Adr和MCF-7/Doc以及敏感乳腺癌細胞系MCF-7/S釋放的外泌體進行miRNA表達譜分析，發(fā)現(xiàn)共有441種miRNA在耐藥和敏感乳腺癌細胞系中存在差異表達，其中他們選擇含有在MCF-7/Adr和MCF-7/Doc細胞系中持續(xù)高表達3種miRNA（miR-100、miR-222和miR-30a）的外泌體與MCF-7/S共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)后MCF-7/S釋放的外泌體中miR-100、miR-222以及miR-30a的水平也隨之上調(diào)。此外，TAKAHASHI等[33]發(fā)現(xiàn)處于化療壓力下的肝細胞癌細胞及其釋放的外泌體中長鏈非編碼RNA-VLDLR（long noncoding RNA-VLDLR，lnc-VLDLR）的表達明顯上調(diào)，而且將這種外泌體與肝細胞癌細胞共培養(yǎng)后能減少化療引起的細胞死亡同時上調(diào)受體細胞中l(wèi)nc-VLDLR的表達水平。以上結(jié)果說明，耐藥腫瘤細胞釋放的外泌體能將其中異常增加的核酸轉(zhuǎn)移至敏感腫瘤細胞中，改變后者的基因表達情況，從而誘導腫瘤耐藥。

3 EVs在卵巢癌診治中的作用

3.1 EVs與卵巢癌診斷 隨著卵巢癌病情進展，大多數(shù)卵巢癌患者會產(chǎn)生惡性腹水，惡性腹水的出現(xiàn)與卵巢癌患者的低預后相關(guān)，說明這種復雜的體液可能在卵巢癌的增殖和進展中具有促進作用。研究發(fā)現(xiàn)，與早期患者相比，進展期卵巢癌患者腹水中EVs的水平更高，并且囊泡中蛋白質(zhì)如MMP-2的含量也比早期患者多[29]，這意味著EVs有望成為協(xié)助卵巢癌診斷的新生物標志物。

3.2 EVs促進卵巢癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移 KELLER等[34]將卵巢癌患者腹水來源的外泌體經(jīng)腹腔注射到SKOV3細胞移植瘤小鼠體內(nèi)，每周2次，每次500 μg，25 d后發(fā)現(xiàn)與沒有外泌體處理的對照組相比，用外泌體處理的小鼠腫瘤體積明顯增加，這表明卵巢癌患者來源的外泌體可以促進卵巢癌的增殖。同樣地，VAKSMAN等[35]在注射ES2卵巢癌細胞之前用卵巢癌患者胸腹水來源的外泌體預先處理免疫缺陷小鼠，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，預先用外泌體處理的小鼠身上移植瘤的體積更大，腫瘤的侵襲性更強，而且小鼠的總體生存率也更低。GRAVES等[29]用IV期卵巢癌患者腹水來源的尿激酶纖溶酶原激活劑（uridylyl phosphate adenosineu，uPA）和卵巢癌細胞OVCA429共培養(yǎng)進行細胞侵襲實驗，并分析細胞和培養(yǎng)基中的uPA和MMPs的活性，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，含EVs的OVCA429細胞中uPA的活性增加了2倍，同時細胞的侵襲能力也有所增強，這表明卵巢癌細胞來源的EVs能促進卵巢癌的侵襲轉(zhuǎn)移。

腫瘤相關(guān)巨噬細胞（tumor-associated macrophages，TAMs）是腫瘤微環(huán)境中浸潤數(shù)量最多的炎性細胞，常表現(xiàn)為M2型，參與卵巢癌早期種植及進一步轉(zhuǎn)移，與患者預后不良密切相關(guān)。應翔等[36]將卵巢癌細胞外泌體、M-CSF+IL-4和空培養(yǎng)基分別與人外周血CD14+單核細胞共培養(yǎng)3 d后觀察單核細胞的分化情況。流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，SKOV3外泌體組、M-CSF+IL-4組較空培養(yǎng)基組單核細胞CD206表達升高，HLA-DR表達降低，體外遷移實驗顯示外泌體組腫瘤細胞遷移數(shù)明顯增加，表明SKOV3外泌體可誘導單核細胞分化極化為M2型巨噬細胞，進而促進卵巢癌細胞遷移。

3.3 EVs為卵巢癌治療提供新思路 VAKSMAN等[35]通過對86例卵巢癌患者胸腹水上清中的外泌體進行miRNA表達譜分析發(fā)現(xiàn)高水平的外泌體miR21、23b以及29a與卵巢癌患者較差的無進展生存期（progression-free survival，PFS）相關(guān)，而高水平的外泌體miR21又與較差的總體生存期（overall survival，OS）相關(guān)，說明卵巢癌患者胸腹水中的外泌體miRNA對卵巢癌細胞的生存和進展有影響，這種外泌體miRNA水平可能作為卵巢癌預后的生物標志物，調(diào)控這些外泌體miRNA有望成為卵巢癌治療的新手段。

耐藥是腫瘤治療的一大障礙，除了促進腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移，EVs還與腫瘤的耐藥相關(guān)。凋亡蛋白酶激活因子（apoptotic protease activating factor，APAF1）是一種與化療耐藥和凋亡相關(guān)的基因，已有研究證明在多數(shù)癌癥類型中，APAF1的缺失促進了腫瘤細胞的耐藥[37]。AU YEUNG等[38]發(fā)現(xiàn)卵巢癌網(wǎng)膜腫瘤微環(huán)境中基質(zhì)細胞釋放的外泌體能運輸其內(nèi)的miR21到卵巢癌細胞中，通過直接連接到APAF1的編碼序列，下調(diào)卵巢癌細胞中APAF1的表達，進而抑制卵巢癌細胞的凋亡并促進其獲得耐藥。雖然大量的研究表明EVs能通過多種途徑促進腫瘤化療耐藥，但是也有研究表明它能作為藥物運輸?shù)慕橘|(zhì)，聚集化療藥物，攜帶化療藥物進入腫瘤細胞，減少藥物外流，從而提高化療效率。TANG等[39]用攜帶有順鉑的卵巢癌EVs治療接種了卵巢癌細胞A2780的免疫缺陷小鼠，治療一段時間后發(fā)現(xiàn)，與用PBS、順鉑或者不含有順鉑的卵巢癌微囊泡組相比，用攜帶有順鉑的卵巢癌微囊泡處理的小鼠卵巢腫瘤體積較小并且小鼠的生存期也更長。此外，該團隊還發(fā)現(xiàn)包載有化療藥物的腫瘤EVs能相對特異地被腫瘤細胞所攝取，誘導腫瘤細胞的凋亡而對周圍正常細胞影響較小，攝取了這種EVs的腫瘤細胞還能釋放出新的化療藥物包載囊泡，引起多米諾骨牌樣腫瘤殺傷作用，大大抑制了腫瘤的生長。以上結(jié)果表明，卵巢癌細胞釋放的微囊泡也可以作為一種特異性化療藥物運輸?shù)慕橘|(zhì)，并且還能減少化療帶來的不良反應，更好地發(fā)揮化療藥物的療效。

綜上所述，EVs是細胞間信息交流的一種重要工具，內(nèi)含有豐富的生物活性物質(zhì)，隨著研究的進一步深入，我們對EVs的生物學特征也有了更深刻的認識?；谒谀[瘤增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移過程中的重要調(diào)控作用，近幾年來EVs已成為醫(yī)學領(lǐng)域的研究熱點，研究內(nèi)容也從腫瘤早期篩查的生物標記物擴展到腫瘤治療靶點等各個方面，為惡性腫瘤的診斷和治療提供了新的思路。目前已有越來越多的證據(jù)表明EVs有望成為卵巢癌患者外周血新的生物標記物，有助于解決卵巢癌早期診斷困難的難題，調(diào)控特異性EVs的產(chǎn)生和分泌還可能協(xié)助卵巢癌的治療。此外，EVs還可能作為藥物定向運輸?shù)妮d體或作用靶點，為臨床難治性卵巢癌的治療提供新的策略。總而言之，關(guān)于EVs的研究還只是冰山一角，其更詳細的功能還有待于我們進一步的研究與探索。

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