陳 鈺， 李 琪， 于 紅， 孔令鋒

(中國(guó)海洋大學(xué)海水殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266003)

長(zhǎng)牡蠣轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子受體基因多態(tài)性與生長(zhǎng)性狀和糖原含量的相關(guān)性分析*

陳 鈺， 李 琪**， 于 紅， 孔令鋒

(中國(guó)海洋大學(xué)海水殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266003)

本研究采用PCR-SSCP技術(shù)，對(duì)長(zhǎng)牡蠣(Grassostreagigas)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子受體基因(Cg-TGF-βRI)編碼區(qū)單核苷酸多態(tài)性(SNP)與來(lái)自5個(gè)家系316個(gè)長(zhǎng)牡蠣個(gè)體的生長(zhǎng)性狀(殼高、殼長(zhǎng)、殼寬、總體量和軟體部量)和糖原含量進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析。研究表明，在Cg-TGF-βRI基因編碼區(qū)擴(kuò)增出的671bp基因片段中檢測(cè)到4個(gè)SNP，其中3個(gè)SNP位點(diǎn)(T726C,A741G,A786G)與經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)；A741G和A786G與生長(zhǎng)性狀和糖原含量均存在顯著相關(guān)性(P<0.05)，T726C僅與殼長(zhǎng)和軟體部重有顯著相關(guān)性(P<0.05)；3個(gè)SNP位點(diǎn)構(gòu)建得到5個(gè)單倍型，H1(TAG)和H4(CAG)單倍型的個(gè)體在總體重和軟體部重上均顯著高于其它3種單倍型的個(gè)體。研究結(jié)果表明，Cg-TGF-βR I基因多態(tài)性影響長(zhǎng)牡蠣的生長(zhǎng)性狀和糖原含量，可用于以后的長(zhǎng)牡蠣的分子標(biāo)記輔助育種和遺傳性狀的改良。

長(zhǎng)牡蠣；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子受體基因(Cg-TGF-βRI)；生長(zhǎng)性狀；糖原；SNPs

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(Transforming growth factor β,TGF-β)超家族是一組在細(xì)胞增殖和分化、細(xì)胞黏連、骨質(zhì)再生、胚胎發(fā)生、腫瘤發(fā)生等過(guò)程中具有重要作用的多功能細(xì)胞因子[1]。TGF-β超家族成員通過(guò)與細(xì)胞表面的特異性受體即轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子受體(Transforming growth factor-βreceptor,TGF-βR)結(jié)合而發(fā)揮作用[2]。其中TGF-βR I作為一個(gè)中介物介導(dǎo)信號(hào)在細(xì)胞外基質(zhì)中的傳導(dǎo)，從而引起細(xì)胞核內(nèi)基因表達(dá)的變化[3]。在哺乳動(dòng)物的研究中，發(fā)現(xiàn)TGF-β可通過(guò)誘導(dǎo)糖原合成酶激酶的磷酸化作用，進(jìn)一步參與該基因的負(fù)調(diào)控，進(jìn)而影響糖原的含量[4-5]，但在水產(chǎn)動(dòng)物尚未有TGF-β與糖原含量的相關(guān)性報(bào)道。目前，在水產(chǎn)動(dòng)物中已克隆出櫛孔扇貝的TGF-βR I基因，并通過(guò)表達(dá)量分析發(fā)現(xiàn)該基因可能參與了肌肉的生長(zhǎng)調(diào)控[6]。在長(zhǎng)牡蠣中也已克隆出轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子受體基因(Cg-TGF-βRI)全序列，并證實(shí)編碼Cg-TGF-βR I受體蛋白可能在早期胚胎發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用[7]。

長(zhǎng)牡蠣(Crassostreagigas)又稱(chēng)太平洋牡蠣，隸屬于軟體動(dòng)物門(mén)(Mollusca)瓣鰓綱(Bivalvia)牡蠣科(Ostridae)巨蠣屬(Crassostrea)，是世界上養(yǎng)殖范圍最廣、產(chǎn)量最高的經(jīng)濟(jì)貝類(lèi)，同時(shí)具有懷卵量大、繁殖周期短、生長(zhǎng)速度快等生物學(xué)特性[8]。在人工選育過(guò)程中，可通過(guò)與長(zhǎng)牡蠣基因效應(yīng)相關(guān)的分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)來(lái)提高長(zhǎng)牡蠣生長(zhǎng)率，進(jìn)而增加牡蠣的產(chǎn)量[9]。同時(shí)，長(zhǎng)牡蠣作為遺傳多樣性較高的物種，也為基因多態(tài)性分析提供了便利[10]。因此，可通過(guò)分析候選基因的單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphisms, SNPs) 及這些多態(tài)位點(diǎn)所構(gòu)建的單倍型，來(lái)建立表型性狀與候選等位基因多態(tài)性之間的關(guān)聯(lián)[11]，從而選育出對(duì)長(zhǎng)牡蠣生長(zhǎng)最有利的基因型個(gè)體。目前，在長(zhǎng)牡蠣中已經(jīng)分析了包括淀粉酶基因[12]、胰島素相關(guān)多肽基因[13]、胰島素受體相關(guān)基因[14]、糖原磷酸化酶基因[15]在內(nèi)的多種基因多態(tài)性與長(zhǎng)牡蠣經(jīng)濟(jì)性狀的相關(guān)性，為分子標(biāo)記輔助育種方法在改良長(zhǎng)牡蠣生長(zhǎng)及肉質(zhì)性狀的應(yīng)用奠定了良好的基礎(chǔ)。

本研究以長(zhǎng)牡蠣轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子受體基因作為候選基因，利用單鏈構(gòu)象多態(tài)性技術(shù)(Single strand conformation polymorphism，SSCP)結(jié)合測(cè)序方法進(jìn)行長(zhǎng)牡蠣SNPs的分型和篩選，分析了Cg-TGF-βRI基因單核苷酸多態(tài)性與長(zhǎng)牡蠣生長(zhǎng)和糖原含量性狀之間的相關(guān)性，旨在為長(zhǎng)牡蠣的遺傳改良提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與DNA提取

2009年6月從威海長(zhǎng)牡蠣養(yǎng)殖群體中選取性腺發(fā)育成熟的個(gè)體作為親貝，采用平衡巢式設(shè)計(jì)構(gòu)建36個(gè)全同胞家系。稚貝附著后，將各家系裝至扇貝籠中，并掛至乳山海區(qū)養(yǎng)成。各組懸掛水層及區(qū)域一致，并按長(zhǎng)牡蠣養(yǎng)成規(guī)范進(jìn)行管理，盡量減小環(huán)境誤差，以保證所構(gòu)建的全同胞家系均飼養(yǎng)于相同條件下。2011年選取5個(gè)全同胞家系(027、028、029、032和034)，取樣個(gè)數(shù)分別為66、66、61、58和65，共計(jì)316個(gè)2齡長(zhǎng)牡蠣[15]，測(cè)定各個(gè)體生長(zhǎng)數(shù)據(jù)(殼高(71.50±10.54)mm；殼長(zhǎng)(45.07±7.50)mm；殼寬(23.86±4.50)mm；總質(zhì)量(36.83±14.48)g；軟體部重(4.95±2.08)g)和糖原含量(見(jiàn)表1)。糖原含量的測(cè)定采用蒽酮比色法[16]，取經(jīng)過(guò)冷凍干燥處理后的長(zhǎng)牡蠣性腺組織30mg，加入3mL 30%的氫氧化鉀溶液，混勻后放于100℃沸水浴30min，迅速放于冰上冷卻；取5μL冷卻液稀釋至0.5mL，加入5mL冷卻的0.2%蒽酮-硫酸溶液，混勻后進(jìn)行沸水浴，10min后取出迅速冷卻；在可見(jiàn)分光光度計(jì)620nm波長(zhǎng)下進(jìn)行比色，測(cè)其吸光度值；以100μg/mL的葡萄糖溶液作為標(biāo)準(zhǔn)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并根據(jù)測(cè)得的吸光度值對(duì)應(yīng)換算出樣品的糖原含量。

采集閉殼肌組織放于無(wú)水乙醇中，-20℃保存。用苯酚-氯仿法[17]提取長(zhǎng)牡蠣閉殼肌組織DNA，在1%瓊脂糖凝膠電泳中檢測(cè)DNA質(zhì)量和濃度，溶于TE中-20℃保存。

1.2 引物設(shè)計(jì)與PCR擴(kuò)增

參考長(zhǎng)牡蠣Cg-TGF-βRI基因cDNA序列(GenBank登錄號(hào)AJ427419)，在長(zhǎng)牡蠣基因組范圍內(nèi)設(shè)計(jì)能擴(kuò)增出671bp的4對(duì)特異性引物(TGF1-TGF4)(見(jiàn)表2)。PCR反應(yīng)程序：94℃變性5min；94℃變性1min，退火溫度52～64℃1min，72℃延伸1min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，循環(huán)結(jié)束后4℃保存。整個(gè)反應(yīng)用10μL體系：DNA模版100ng，引物1μmol/L，1×PCR buffer，2mmol/L MgCl2，0.2mmol/L dNTP和0.25UTaqDNA聚合酶(TaKaRa)。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),并用0.5ng/μL的溴化乙錠染色。

表1 5個(gè)長(zhǎng)牡蠣家系生長(zhǎng)數(shù)據(jù)和糖原含量Table 1 The growth trait and glycogen content of five Crassostrea gigas families

表2 引物序列Table 2 Sequences of primers

1.3 SSCP電泳及測(cè)序

向擴(kuò)增片段與目的片段大小一致且特異性好的PCR產(chǎn)物中加入等量變性劑(98%去離子甲酰胺，0.25%二甲苯菁，0.25%溴酚藍(lán)，10mmol/L EDTA)，98℃變性10min后立即冷卻，直至上樣時(shí)取出，以防止復(fù)性。電泳采用丙烯酰胺/N，N′-甲叉雙丙烯酰胺(29∶1)的非變性聚丙烯酰胺凝膠(10%～12%)，置于4℃，以100V電泳16～18h后銀染。結(jié)合SSCP條帶分型，隨機(jī)選擇3個(gè)以上具有相同電泳條帶的個(gè)體進(jìn)行純化測(cè)序，從而確定各個(gè)體的基因型。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SAS9.1統(tǒng)計(jì)分析軟件GLM模塊進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并采用Bonferroni多重比較分析各個(gè)SNPs及其單倍型與生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)性。對(duì)于多位點(diǎn)SNP單倍型與性狀的關(guān)聯(lián)分析，首先利用PHASE 2.1軟件將與性狀相關(guān)聯(lián)的SNPs構(gòu)建成單倍型，再通過(guò)構(gòu)建一般線性模型：Y=μ+G，H+e(Y是性狀觀察值，μ是群體表型均值，G是個(gè)體基因型效應(yīng)，H是單倍型效應(yīng)，e是隨機(jī)誤差)分析各基因型及其單倍型的差異顯著性(差異顯著P<0.05，極顯著P<0.01)。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因型鑒定

本研究成功設(shè)計(jì)了4對(duì)特異性引物，擴(kuò)增出覆蓋Cg-TGF-βRI基因cDNA全長(zhǎng)的671 bp的基因組DNA片段，共檢測(cè)到的4個(gè)SNP位點(diǎn)(A471C、T726C、A741G、A786G)均位于編碼區(qū)，且都為無(wú)義突變，其中在TGF-2中檢測(cè)到3個(gè)SNP，在TGF-1中只檢測(cè)到1個(gè)SNP，其余片段均未發(fā)現(xiàn)SNP。TGF-1和TGF-2兩對(duì)引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的SSCP電泳帶譜如圖1所示。

2.2 長(zhǎng)牡蠣Cg-TGF-βRI基因多態(tài)性與經(jīng)濟(jì)性狀的關(guān)聯(lián)分析

通過(guò)顯性遺傳效應(yīng)模型分析，發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)牡蠣Cg-TGF-βR I基因中有3個(gè)SNP與長(zhǎng)牡蠣生長(zhǎng)性狀和糖原含量相關(guān)(見(jiàn)圖2)。3個(gè)SNP位點(diǎn)在5個(gè)家系中各等位基因的頻率如表3所示。因?yàn)榧蚁甸g的差異，導(dǎo)致有的家系只有一個(gè)等位基因，同時(shí)在3個(gè)家系檢測(cè)到哈迪-溫伯格平衡的偏離，可能與不同基因型的個(gè)體存活率存在差異有關(guān)。表4顯示了Cg-TGF-βRI基因3個(gè)SNP與生長(zhǎng)性狀和糖原含量關(guān)聯(lián)分析的結(jié)果。在位點(diǎn)T726C，CT基因型個(gè)體的殼長(zhǎng)和軟體部重均顯著高于基因型為T(mén)T的個(gè)體(P<0.05)。在位點(diǎn)A741G，AG基因型個(gè)體的生長(zhǎng)性狀指標(biāo)和糖原含量均顯著高于GG基因型的個(gè)體(P<0.05)，其中AG基因型個(gè)體的殼寬、總重量和軟體部重極顯著高于GG基因型(P<0.01)。在位點(diǎn)A786G，AG基因型個(gè)體的糖原含量顯著高于GG基因型的個(gè)體，而殼高顯著高于AA基因型的個(gè)體(P<0.05)；GG基因型的個(gè)體在殼長(zhǎng)、殼寬、總體質(zhì)量和軟體重方面均顯著高于AA基因型的個(gè)體(P<0.01)。T726C和A741G位點(diǎn)僅存在2種基因型，可能是由于基因與環(huán)境的互作效應(yīng)導(dǎo)致相關(guān)的基因型在自然選擇過(guò)程中被逐步淘汰。

(a：引物TGF-1的擴(kuò)增片段SSCP帶譜，其中條帶B代表與GenBank accession no.AJ427419序列相同的純合子，條帶A代表雜合子；b：引物TGF-2的擴(kuò)增片段SSCP帶譜，條帶C代表與GenBank accession no.AJ427419序列相同的純合子，其余條帶代表不同組合的雜合子。a: SSCP pattern of primer TGF-1, band B indicates the homozygote, consistent sequence of GenBank accession no. AJ427419, band A indicates the heterozygote; b: SSCP pattern of primer TGF-2, band C indicates the homozygote, consistent sequence of GenBank accession no. AJ427419, the other bands indicate heterozygotes.)

圖1Cg-TGF-βRI基因引物擴(kuò)增片段的SSCP電泳帶譜

Fig.1 SSCP band patterns for two primers ofCg-TGF-βRIgene

圖2 與表型性狀相關(guān)聯(lián)的不同基因型的測(cè)序結(jié)果Fig.2 Sequencing result of different genotypes associated with the phenotypic traits

SNP位點(diǎn)SNPlocus家系Family27028029032034T726CT0.70.7111C0.30.2P0.000*0.025*A741GA0.2G0.81111P0.025*A786GA0.35G11110.65P0.025*

注：哈迪-溫伯格平衡偏離水平，*P<0.05。

Note：Significance of Hardy-Weinberg departure, *P< 0.05.

表4 長(zhǎng)牡蠣中Cg-TGF-βR I基因3個(gè)SNPs與生長(zhǎng)性狀以及糖原含量的關(guān)聯(lián)分析Table 4 Association analysis of the three SNP genotypes with growth performance and glycogen content at C. gigas Cg-TGF-βR I gene

注:同一列標(biāo)不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note: Means of different superscript letters within the same column indicates significant difference at 5% level.

2.3 長(zhǎng)牡蠣Cg-TGF-βRI基因SNPs單倍型與經(jīng)濟(jì)性狀的關(guān)聯(lián)分析

利用PHASE2.1軟件預(yù)測(cè)的Cg-TGF-βRI基因SNP單倍型共有5種，頻率大于1%的5種單倍型與長(zhǎng)牡蠣生長(zhǎng)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析(見(jiàn)表5)。最小二乘法線性擬合結(jié)果表明，所構(gòu)建的單倍型與糖原含量、殼寬、總重和軟體部重存在極顯著關(guān)聯(lián)(P<0.01)。單倍型為H3(TGA)的個(gè)體在殼長(zhǎng)、殼寬、總體重和軟體部重方面均顯著低于其他單倍型的個(gè)體；而H1(TAG)和H4(CAG)單倍型的個(gè)體在總體重和軟體部重上均顯著高于H2(TGG)、H3(TAG)和H5(CGG)單倍型的個(gè)體(P<0.05)。其中，在糖原含量上，單倍型H1(TAG)、H3(TGA)和H2(TGG)兩兩之間有極顯著差異(P<0.01)，H1(TAG)和H5(CGG)之間有顯著差異(P<0.05)。在殼高方面，H2(TGG)和H4(CAG)之間,H3(TAG)和H4(CAG)之間均表現(xiàn)出顯著差異性(P<0.05)。在殼長(zhǎng)方面，H3(TAG)單倍型的個(gè)體均顯著低于其它單倍型的個(gè)體，其中除了與H1(TAG)有顯著差異外(P<0.05)，其他均為極顯著差異(P<0.01)。在殼寬方面，H1(TAG)單倍型的個(gè)體均顯著大于H2(TGG)、H3(TAG)、H5(CGG)單倍型的個(gè)體(P<0.05)，并且H3(TGA)單倍型的個(gè)體在殼寬上極顯著低于H1(TAG)、H2(TGG)和H4(CAG)單倍型的個(gè)體(P<0.01)。在總體重和軟體部重性狀方面,H3(TGA)單倍型的個(gè)體均顯著低于其他5種單倍型的個(gè)體，而且H1(TAG)和H4(CAG)單倍型的個(gè)體顯著高于H2(TGG)、H3(TAG)和H5(CGG)這3類(lèi)單倍型的個(gè)體(P<0.05)，其中在軟體部質(zhì)量方面，僅H4(CAG)和H5(CGG)2種單倍型的個(gè)體間存在顯著差異(P<0.05)，其余均為極顯著差異(P<0.01)。

表5 Cg-TGF-βR I基因單倍型與長(zhǎng)牡蠣生長(zhǎng)性狀與糖原的關(guān)聯(lián)分析Table 5 Association between haplotypes of Cg-TGF-βR I gene and growth trait and glycogen content of C. gigas

注:同一列不同上標(biāo)字母表示SNP單倍型各性狀的差異顯著性(P<0.05)。

Note: Values with different superscript letters within a column of every SNP haplotype are significantly different at 0.05 level.

3 討論

遺傳變異是水產(chǎn)動(dòng)物進(jìn)行長(zhǎng)期遺傳改良的基礎(chǔ)，因此保護(hù)和有效利用遺傳資源對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展有重要意義[18]。一般而言，對(duì)于長(zhǎng)牡蠣這類(lèi)具有群居習(xí)性且繁殖力強(qiáng)的有效群體來(lái)說(shuō)極有可能有豐富的遺傳多態(tài)性。劉思瑋等[15]在糖原磷酸化酶基因的研究中檢測(cè)到的SNP平均密度為1/25,Cong等[13,14]在長(zhǎng)牡蠣胰島素受體相關(guān)受體基因(IRR)的多態(tài)性研究中發(fā)現(xiàn)上述基因的SNP平均密度為1/80,在長(zhǎng)牡蠣胰島素相關(guān)多肽基因(OIRP)中SNP平均密度為1/40。本研究在共671bp的長(zhǎng)牡蠣生長(zhǎng)轉(zhuǎn)化因子受體基因中共檢測(cè)到4個(gè)SNP位點(diǎn)，SNP平均密度為1/167bp，明顯低于之前的研究結(jié)果。而且在櫛孔扇貝TGF-βRI受體基因的非編碼區(qū)中也僅篩查到1個(gè)SNP[6]。導(dǎo)致TGF-βRI受體基因單核苷酸多態(tài)性如此低的原因可能是由于自然選擇對(duì)于基因的選擇作用，也可能是由于該基因在進(jìn)化上相對(duì)保守使得變異度降低。因此，針對(duì)不同的基因而言，SNP的頻率不盡相同，需要綜合考慮各方面的因素。本研究中SNP頻率較低可能是由于候選基因本身存在差異性，并且也應(yīng)考慮基因和環(huán)境的互作效應(yīng)。檢測(cè)到的SNP位點(diǎn)在部分家系中由于缺乏多態(tài)性，無(wú)法檢測(cè)到與表型的相關(guān)性。這可能是因?yàn)閺母骷蚁抵羞x取的2齡長(zhǎng)牡蠣，由于不同基因型個(gè)體生存能力不同，從而導(dǎo)致部分家系中等位基因多態(tài)性的缺失以及哈迪-溫伯格平衡的偏離。長(zhǎng)牡蠣較高的遺傳負(fù)荷，在以往的研究中已有報(bào)道。Launey和Hedgecock[19]發(fā)現(xiàn)偏分離比例在長(zhǎng)牡蠣早期幼蟲(chóng)階段最低，隨著生長(zhǎng)發(fā)育而逐漸增加，指出高遺傳負(fù)荷是導(dǎo)致偏分離增加的原因，并且支持某些等位基因由于和致死基因連鎖而受到選擇的理論。由于家系間基因型存在顯著的差異，利用單個(gè)家系難以檢測(cè)到基因型與表型的相關(guān)，因而本研究中將各家系合并成混合群體進(jìn)行SNP及其單倍型與生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)性分析。然而，采用遺傳背景差異較大的家系組成的混合群體，可能會(huì)產(chǎn)生群體分層現(xiàn)象，一定程度上干擾關(guān)聯(lián)分析的準(zhǔn)確性。

相關(guān)研究表明，TGF-β信號(hào)通路可以誘導(dǎo)特定類(lèi)型細(xì)胞生長(zhǎng)的停滯[20-21]。特別是在肌細(xì)胞中通過(guò)抑制肌細(xì)胞特異基因的表達(dá)，進(jìn)而抑制肌肉形成。目前，在長(zhǎng)牡蠣Cg-TGF-β基因研究中，發(fā)現(xiàn)該基因在各個(gè)發(fā)育時(shí)期都有表達(dá)，其中唇瓣和鰓中的表達(dá)量相對(duì)較高[22]。在相關(guān)TGF-βRI基因研究中，發(fā)現(xiàn)櫛孔扇貝和長(zhǎng)牡蠣中可能存在與哺乳動(dòng)物類(lèi)似的TGF-β信號(hào)通路，而且分析出TGF-βR I表達(dá)量和橫紋肌量的負(fù)相關(guān)性[6,7]。以上研究都表明了TGF-βRI基因不僅在在動(dòng)物體的各個(gè)發(fā)育時(shí)期都具有功效，而且對(duì)于肌肉生長(zhǎng)調(diào)控發(fā)揮重要作用。因此，查找Cg-TGF-βRI基因編碼區(qū)SNP可以全面分析基因多態(tài)性在影響蛋白修飾過(guò)程中的作用，進(jìn)而將會(huì)更有效地研究該基因與生長(zhǎng)性狀的相關(guān)性，有利于從分子生物學(xué)方面對(duì)長(zhǎng)牡蠣早期苗種進(jìn)行選擇，進(jìn)而發(fā)揮分子標(biāo)記在輔助育種技術(shù)中的作用。

本研究通過(guò)對(duì)長(zhǎng)牡蠣5個(gè)家系共316個(gè)個(gè)體的生長(zhǎng)性狀和糖原含量與Cg-TGF-βRI基因內(nèi)篩查到的SNP位點(diǎn)相關(guān)性進(jìn)行分析,獲得3個(gè)與表型性狀相關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)(T726C，A741G和A786G)。所檢測(cè)到的SNP位點(diǎn)均并未引起氨基酸的改變。此類(lèi)同義多態(tài)性可能通過(guò)影響mRNA的拼接、穩(wěn)定性、結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)折疊,從而間接影響蛋白質(zhì)的功能[23]。也會(huì)通過(guò)控制轉(zhuǎn)錄來(lái)影響基因的表達(dá)水平。這3個(gè)SNP位點(diǎn)構(gòu)建成的5個(gè)SNP單倍型中，H1(TAG)和H4(CAG)單倍型個(gè)體的總體量和軟體部重(分別為46.23、46.90和7.35、6.44)均顯著高于其它3種單倍型H2(TGG)、H3(TAG)和H5(CGG)的個(gè)體(P<0.05)，表明H1(TAG)和H4(CAG)單倍型是對(duì)長(zhǎng)牡蠣的生長(zhǎng)最為有利的單倍型，證實(shí)了在長(zhǎng)牡蠣的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子受體基因?qū)τ陂L(zhǎng)牡蠣生長(zhǎng)發(fā)育具有極為重要的作用。在糖原含量方面，H1(TAG)單倍型的個(gè)體顯著高于H2和H5單倍型的個(gè)體，表明該基因可能參與糖原含量的調(diào)控，為確認(rèn)這種關(guān)系的可靠性，需要進(jìn)一步分析該基因在調(diào)節(jié)糖原代謝中的生理作用。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)研究了長(zhǎng)牡蠣Cg-TGF-βR I基因多態(tài)性，獲得了3個(gè)與生長(zhǎng)性狀相關(guān)的SNP位點(diǎn)，并首次證實(shí)了單核苷酸多態(tài)性影響長(zhǎng)牡蠣生長(zhǎng)性狀和糖原含量。在獲得的5個(gè)單倍型中，發(fā)現(xiàn)H1(TAG)單倍型相對(duì)有利于長(zhǎng)牡蠣的生長(zhǎng)，為今后分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)的應(yīng)用提供了有力的工具。同時(shí)，證實(shí)了編碼區(qū)的基因突變會(huì)導(dǎo)致生長(zhǎng)性狀的改變,從而表明Cg-TGF-βRI基因可作為候選基因來(lái)應(yīng)用于今后長(zhǎng)牡蠣的遺傳改良。

[1] 李翠玲. 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β分子生物學(xué)研究進(jìn)展[J]. 國(guó)外醫(yī)學(xué)免疫學(xué)分冊(cè), 1995, 18(3): 124-127. Li C L. Transforming growth factor beta research progress of molecular biology[J]. Foreign Medical Sciences Section of Immunology, 1995, 18(3): 124-127.

[2] Hu P P, Datto M B, Wang X F. Molecular mechanisms of transforming growth factor-β signaling[J]. Endocrine Reviews, 1998, 19(3): 349-363.

[3] 李京紅. 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β受體研究進(jìn)展[J]. 國(guó)外醫(yī)學(xué)生理、病理科學(xué)與臨床分冊(cè), 1998, 18(1): 28-30. Li J H. Transforming growth factor beta research progress. foreign medical sciences[J]. Pathophysiology and Clinical Medicine, 1998, 18(1): 28-30.

[4] Fang H, Zhou J L, Liu J W, et al. Glycogen synthase kinase-3β negatively regulates TGF-β1 and Angiotensin II-mediated cellular activity through interaction with Smad3[J]. Molecular and Cellular Pharmacology, 2010, 644(1-3): 17-23.

[5] Dai C S, Wen X Y, He W C, et al. Inhibition of proinflammatory RANTES expression by TGF-β1 is mediated by glycogen synthase kinase-3β-dependent β-catenin signaling[J]. Journal of Biological Chemistry, 2011, 268(9): 7052-7059.

[6] Guo H H, Bao Z M, Li J Q, et al. Molecular characterization of TGF-β type I receptor gene (Tgfbr1) inChlamysfarreri, and the association of allelic variants with growth traits[J]. Plos One, 2012, 7(11): 51005.

[7] Herpin A, Lelong C, Becker T, et al. Structural and functional evidences for a type 1 TGF-βsensustrictoreceptor in the lophotrochozoanCrassostreagigassuggest conserved molecular mechanisms controlling mesodermal patterning across bilateria[J]. Mechanisms of Development, 2005, 122(5): 695-705.

[8] 肖述, 喻子牛. 養(yǎng)殖牡蠣的選擇育種研究與實(shí)踐[J]. 水產(chǎn)學(xué)報(bào), 2008, 32(2): 287-295. Xiao S, Yu Z N. Review of selective breeding research and practice in oyster cultivation[J]. Journal of Fisheries of China, 2008, 32(2): 287-295.

[9] Swan A A, Thompson P A, Ward R D. Genotype × environment interactions for weight in Pacific oysters (Crassostreagigas) on five Australian farms[J]. Aquaculture, 2007, 265(1-4): 91-101.

[10] Morris R W, Kaplan N L. On the advantage of haplotype analysis in the presence of multiple disease susceptibility alleles[J]. Genetic Epidemiology, 2002, 23(3): 221-233.

[11] Vignal A, Milan D, SanCristobal, M. et al. A review on SNP and other types of molecular markers and their use in animal genetics[J]. Genetics Selection Evolution, 2002, 34: 275-306.

[12] Prudence M, Moal J, Boudry P, et al. Anamylasegene polymorphism is associated with growth differences in the Pacific cupped oysterCrassostreagigas[J]. Animal Genetics, 2006, 37(4): 348-351.

[13] Cong R H, Li Q, Kong L F. Polymorphism in the insulin-related peptide gene and its association with growth traits in the Pacific oysterCrassostreagigas[J]. Biochemical Systematics and Ecology, 2013, 46: 36-43.

[14] Cong R H, Kong L F, Yu H, et al. Association between polymorphism in the insulin receptor-related receptor gene and growth traits in the Pacific oysterCrassostreagigas[J]. Biochemical Systematics and Ecology, 2014, 54: 144-149.

[15] 劉思瑋, 李琪, 于紅, 等. 長(zhǎng)牡蠣糖原磷酸化酶基因 SNPs 與生長(zhǎng)性狀和糖原含量的相關(guān)性分析[J]. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué), 2013, 20(3): 481-489. Liu S W, Li Q, Yu H, et al. Single nucleotide polymorphisms in glycogen phosphorylase gene and their association with growth performance and glycogen content in Pacific oysterCrassostreagigas[J]. Journal of Fishery Sciences of China, 2013, 20(3): 481-489.

[16] Horikoshi H. Glycogen[J]. Chem Field, 1958, 34: 36-39.

[17] Li Q, Yu H, Yu R H. Genetic variability assessed by microsatellites in cultured populations of the Pacific oyster (Crassostreagigas) in China[J]. Aquaculture, 2006, 259(1): 95-102.

[18] Guo X M. Use and exchange of genetic resources in molluscan aquaculture[J]. Reviews in Aquaculture, 2009, 1(3-4): 251-259.

[19] Launey S, Hedgecock D. High genetic load in the Pacific oysterCrassostreagigas[J]. Genetics, 2001, 159: 255-265.

[20] Feng X H, Derynck R. Specificity and versatility in TGF-β signaling through Smads[J]. Cell and Developmental Biology, 2005, 21: 659-693.

[21] Massagué J, Seoane J, Wotton D. Smad transcription factors[J]. Genes & Development, 2005, 19: 2783-2810.

[22] Lelong C, Badariotti F, Quéré H L, et al. Cg-TGF-β, a TGF-β/activin homologue in the Pacific oysterCrassostreagigas, is involved in immunity against Gram-negative microbial infection[J]. Developmental and Comparative Immunology, 2007, 31: 30-38.

[23] Hunt R, Sauna Z E, Ambudkar S V, et al. Silent (synonymous) SNPs: should we care about them ?[J]. Methods in Molecular Biology, 2009, 5: 23-39.

責(zé)任編輯 朱寶象

Polymorphism of Transforming Growth Factor β ReceptorⅠGene and Its Association with Growth Traits and Glycogen Content in Pacific Oyster Crassostrea gigas

CHEN Yu, LI Qi, YU Hong, KONG Ling-Feng

(The Key Laboratory of Mariculture， Ministry of Education, Ocean University of China, Qingdao 266003, China)

We evaluated the effect of the polymorphism of Pacific oyster (Crassostreagigas) transforming growth factor β receptor I gene (Cg-TGF-βRI) on the growth traits and glycogen content through PCR-SSCP analysis. Polymorphism ofCg-TGF-βRIwas examined for its association with the growth performance (shell height, shell length, shell width, total weight and soft-tissue weight) of 316 oyster individuals from five full-sib families. Four single nucleotide polymorphisms (SNPs) were revealed in 671 bp ofCg-TGF-βRIgene. Of them, two SNPs (A741G and A786G) were significantly associated with the growth traits and glycogen content (P<0.05), while another one (T726C) significantly associated with shell length and soft-tissue weight. Furthermore, among the five SNP haplotypes constructed using these three SNPs, the total weight and the soft-tissue weight of the individuals with the haplotype H1(TAG) and H4(CAG) ofCg-TGF-βRIwas significantly higher than those with the other three (P<0.05), suggesting that the two haplotypes may be the most advantageous in terms of weight gain inC.gigas, and may serve as genetic markers for fast growth in oyster breeding.

Crassostreagigas; transforming growth factor β receptor I gene; growth performance; glycogen; SNPs

國(guó)家公益性行業(yè)科研專(zhuān)項(xiàng)(201305005)；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31372524)；山東省農(nóng)業(yè)良種工程項(xiàng)目資助 Supported by National Marine Public Welfare Research Program(201305005);National Natural Science Foundation of China(31372524); Agriculture for Project Funding of Shandong Province

2015-11-01；

2016-04-20

陳 鈺(1989-),女,碩士生,從事水產(chǎn)動(dòng)物遺傳育種學(xué)研究。E-mail:chenyuxielei@126.com

** 通訊作者：E-mail：qili66@ouc.edu.cn

S968.3

A

1672-5174(2017)03-027-07

10.16441/j.cnki.hdxb.20150375

陳鈺， 李琪， 于紅， 等. 長(zhǎng)牡蠣轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子受體基因多態(tài)性與生長(zhǎng)性狀和糖原含量的相關(guān)性分析[J]. 中國(guó)海洋大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2017, 47(3): 27-33.

CHEN Yu, LI Qi, YU Hong, et al. Polymorphism of transforming growth factor β receptorⅠgene and its association with growth traits and glycogen content in pacific oysterCrassostreagigas[J]. Periodical of Ocean University of China, 2017, 47(3): 27-33.