王 浩，馮 冰△，朱 超，于建平，黃寶磚

(1.解放軍第四一一醫(yī)院腎內(nèi)科，上海 200081；2.第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院腎內(nèi)科，上海 200433；3.上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院腎內(nèi)科 200031)

染料木素對(duì)尿毒癥大鼠細(xì)胞外基質(zhì)沉積的影響

王 浩1，馮 冰1△，朱 超1，于建平2，黃寶磚3

(1.解放軍第四一一醫(yī)院腎內(nèi)科，上海 200081；2.第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院腎內(nèi)科，上海 200433；3.上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院腎內(nèi)科 200031)

目的 探討染料木素對(duì)尿毒癥大鼠細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)沉積的影響及其機(jī)制。方法 5/6腎切除術(shù)建立尿毒癥模型鼠，將模型鼠分為染料木素組(G組)和對(duì)照組(C組)，假手術(shù)組(S組)作為正常對(duì)照。檢測(cè)各組術(shù)前及術(shù)后第4、8周尿蛋白和生化等指標(biāo)，第8周觀(guān)察腎組織病理變化情況，半定量法評(píng)估腎小球硬化指數(shù)(GSI)。免疫組化法檢測(cè)Ⅳ型膠原(ColⅣ)、纖維連接蛋白(FN)的沉積情況。應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法、Western blot法分別檢測(cè)腎組織中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1) mRNA轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)表達(dá)情況。結(jié)果 術(shù)后第4周與C組比較，G組尿蛋白排泄量減少[(11.63±2.07)vs. (19.93±3.19)mg/d，P<0.01]，血清尿素氮、肌酐水平降低[(9.39±0.59)vs.(12.09±0.78)mmol/L，(65.11±3.79)vs.(77.63±3.20)μmol/L，P<0.01]。至術(shù)后第8周，尿蛋白排泄量減少，血清尿素氮、肌酐水平降低更為顯著。腎小球內(nèi)ColⅣ和FN沉積減少[(17.30±1.96)%vs. (24.68±3.97)%,(18.26±2.31)%vs. (29.35±4.15)%，P<0.01]，腎小球硬化明顯減輕。TGF-β1mRNA、蛋白質(zhì)表達(dá)減弱(P<0.05)。結(jié)論 染料木素可以減少尿毒癥大鼠細(xì)胞ECM的蓄積，對(duì)腎臟具有保護(hù)作用。

染料木素；尿毒癥；大鼠,Sprague-Dawley；膠原Ⅳ型；纖維連接蛋白；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1

大豆為豆科植物大豆的成熟種子，我國(guó)最早的本草著作《神農(nóng)本草經(jīng)》首次記載了大豆及其藥用價(jià)值，并將其列為中品。大豆異黃酮(soybean isoflavone)是存在于大豆中的生物活性物質(zhì)，主要包括染料木素(genistein)、大豆甙元(daidzein)、大豆苷元(glycitein)等。有研究證實(shí)，大豆蛋白飲食可以減輕腎小球纖維化、降低蛋白尿、減輕腎小管萎縮[1-3]。國(guó)內(nèi)亦有研究發(fā)現(xiàn)，大豆蛋白飲食可以減輕尿毒癥大鼠的早期血管病變，對(duì)腎臟具有一定的保護(hù)作用[4]。目前有關(guān)大豆蛋白幾種活性成分的研究主要集中在細(xì)胞與分子水平上，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究相對(duì)較少。本研究以5/6腎切除建立尿毒癥大鼠模型，觀(guān)察染料木素對(duì)腎硬化鼠細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的作用情況。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：雌性6周齡清潔級(jí)SD大鼠[動(dòng)物許可證號(hào)SCXK-(滬)2007-0003] 25只，體質(zhì)量200～230 g，飼養(yǎng)于第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院院清潔級(jí)動(dòng)物房(合格證號(hào)：醫(yī)動(dòng)字第02-64號(hào))。溫度20～23 ℃，相對(duì)濕度40%～50%，光照12 h明暗交替，標(biāo)準(zhǔn)飼料飼養(yǎng)，自由飲水。(2)主要試劑：染料木素(批號(hào)：G6649-70)、兔抗大鼠Ⅳ型膠原(ColⅣ)、兔抗大鼠纖維連接蛋白(FN)抗體購(gòu)于Sigma公司，小鼠抗大鼠轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)抗體、羊抗小鼠二抗購(gòu)于DAKO公司，ECL試劑盒購(gòu)于Pierce公司，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)試劑購(gòu)于Promega公司。(3)主要儀器：SYNCHRON CX5全自動(dòng)生化分析儀購(gòu)于Beckman公司，Thermal Cycler 480 PCR儀購(gòu)于Perkin Elmer公司，HPIAS-1000型醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)購(gòu)于千屏影像工程公司，GDS 7500凝膠成像分析系統(tǒng)購(gòu)于美國(guó)UVI公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組 使用數(shù)字表法，隨機(jī)將25只大鼠分為3組：假手術(shù)組(S組)8只，對(duì)照組(C組)8只，染料木素組(G組)9只。

1.2.2 尿毒癥模型鼠的建立及飼養(yǎng)方案 C、G組大鼠采用間隔1周的兩步法建立5/6腎切除尿毒癥模型鼠[5]，1期手術(shù)在麻醉下扇形切除左腎上下極各1/3，吸收性明膠海綿止血；術(shù)后第8天行2期手術(shù)摘除右腎。S組麻醉下僅打開(kāi)左、右腎包膜，不切除腎臟。術(shù)后各組正常飲食喂養(yǎng)8周，G組于2期手術(shù)后次日給予染料木素15 mg/(kg·d)灌胃；C組予等量的生理鹽水灌胃。

1.2.3 尿蛋白及血生化檢測(cè) 術(shù)前及術(shù)后第4、8周各組大鼠禁飲1 d，于代謝籠中收集24 h尿液，使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法測(cè)定尿蛋白量。于同樣的時(shí)間點(diǎn)，各組大鼠禁食12 h后經(jīng)內(nèi)眥靜脈取血，檢測(cè)血肌酐(Scr)、血尿素氮(BUN)、血清清蛋白(Alb)和血清總蛋白(TP)。

1.2.4 腎組織病理檢查 2期手術(shù)后第8周采血檢測(cè)Scr和BUN，確認(rèn)尿毒癥模型成功建立后即處死大鼠。手術(shù)摘取殘腎，固定、包埋、切片，行HE染色。在光鏡下觀(guān)察各組腎小球病理情況。Raij半定量法[6]評(píng)估腎小球硬化指數(shù)(GSI)。腎小球出現(xiàn)玻璃樣變和(或)毛細(xì)血管塌陷則定義為硬化。根據(jù)硬化灶所占腎小球比例分為0～++++：腎小球無(wú)硬化為0；受損0～<25%為+；受損25%～<50%為++；受損50%～<75%為+++，受損75%～100%為++++。每張切片觀(guān)察30個(gè)以上的腎小球，計(jì)算GSI。

1.2.5 免疫組織化學(xué)檢測(cè) 應(yīng)用SABC法測(cè)定殘腎組織中的ColⅣ和FN。腎組織切片、脫蠟，PBS沖洗3 min，3%H2O2抑制內(nèi)源性過(guò)氧化物酶30 min，微波加熱后行抗原修復(fù)，PBS沖洗5 min，分別加入一抗、二抗，DAB顯色，光鏡下棕黃色的顆粒為陽(yáng)性顯示。各鼠隨機(jī)選取10個(gè)腎小球，應(yīng)用HPIAS-1000型醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)計(jì)算圖像中陽(yáng)性區(qū)域與全區(qū)域的面積比。

1.2.6 RT-PCR法檢測(cè)TGF-β1mRNA表達(dá) 取腎皮質(zhì)30～50 mg，Trizol法抽提總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。TGF-β1引物序列上游：5′-CTT CAG CTC CAC AGA GAA GAA CTG A-3′，下游：5′-CCT CGT CAA CAG GTT GTA CTA GCA C-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為298 bp；GAPDH引物序列上游：5′-TTC ATT GAC CTC AAC TAC ATG-3′，下游：5′-GTG GCA GTG ATG GCA TGG ATC-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為443 bp。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃變性 1 min，55 ℃ 退火1 min 30 s，72 ℃ 延伸1 min 30 s，共40個(gè)循環(huán)，72 ℃再延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠中電泳，溴化乙錠染色，GDS 7500分析系統(tǒng)進(jìn)行定量分析。

1.2.7 Western blot 印跡分析 取30～50 mg腎皮質(zhì)碾碎，加入0.5 mL含PMSF的細(xì)胞裂解液，置冰上超聲細(xì)胞粉碎。5 000 r/min，0 ℃離心后取上清液。用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進(jìn)行分離，分離后電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，置于5%脫脂奶粉中封閉1 h。將NC膜放入小鼠抗大鼠TGF-β1稀釋液中孵育16 h，漂洗。加入羊抗小鼠IgG中孵育2 h。利用ECL試劑盒對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。GDS 7500分析系統(tǒng)檢測(cè)各條帶的光密度。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠尿蛋白水平及血生化指標(biāo)比較 手術(shù)后第4周，C組大鼠尿蛋白及Scr、Bun水平均升高，第8周時(shí)明顯升高。與C組比較，S、G組尿蛋白排泄量明顯減少(P<0.01)，Scr、Bun水平均顯著下降(P<0.01)。實(shí)驗(yàn)期間各組大鼠血清Alb及TP水平比較均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

2.2 各組大鼠腎臟病理檢查比較 在光鏡下，S組(圖1A)腎小球結(jié)構(gòu)清晰，無(wú)系膜增生、細(xì)胞增殖；C組(圖1B、C)腎小球肥大、結(jié)構(gòu)紊亂，呈局灶纖維化或彌漫性球性硬化，血管襻內(nèi)皮細(xì)胞增殖，腎間質(zhì)可見(jiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)，動(dòng)脈管腔輕度狹窄；G組(圖1D)腎小球肥大不明顯，細(xì)胞增殖、系膜區(qū)增寬亦不及C組顯著。S、C、G組大鼠GSI分別為3.34±2.62、42.38±14.31、27.65±7.23。與C組比較，G組大鼠GSI明顯降低(P<0.01)。

2.3 各組大鼠腎臟組織FN 和Col Ⅳ表達(dá)水平比較 結(jié)果表明，S組腎小球系膜區(qū)有少量的ColⅣ和FN沉積。C組ColⅣ和FN沉積明顯增加(P<0.01)。與C組相比，G組ColⅣ和FN沉積明顯減少(P<0.01)，見(jiàn)圖2、表2。

表1 不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠尿蛋白量及生化指標(biāo)比較

a：P<0.01，與S組比較；b：P<0.01，與C組同期比較。

A：S組；B、C：C組；D： G組。

圖1 各組大鼠腎組織HE染色(HE×200)

A：S組FN表達(dá)；B：G組FN表達(dá)；C：C組FN表達(dá)；D：S組Col Ⅳ表達(dá)；E：G組Col Ⅳ表達(dá)；F：C組Col Ⅳ表達(dá)。

圖2 各組大鼠腎組織FN 和Col Ⅳ表達(dá)(HE×200)

a：P<0.01，與S組比較；b：P<0.01，與C組比較。

2.4 各組大鼠腎臟組織TGF-β1mRNA及蛋白表達(dá)比較 C組腎組織TGF-β1mRNA及蛋白表達(dá)較S組升高(P<0.05)，G組腎組織TGF-β1mRNA及蛋白表達(dá)較C組降低(P<0.05)，見(jiàn)圖3、4及表3。

圖3 各組大鼠腎臟組織 TGF-β1 mRNA表達(dá)

圖4 各組大鼠腎臟組織TGF-β1蛋白表達(dá)

組別nTGF-β1mRNATGF-β1蛋白S組80.132±0.0320.127±0.037C組80.644±0.079a1.405±0.131aG組90.329±0.055b0.432±0.076b

a：P<0.05，與S組比較；b：P<0.05，與C組比較。

3 討 論

慢性腎臟病的醫(yī)學(xué)營(yíng)養(yǎng)治療由來(lái)已久，但是關(guān)于是否可以食用大豆蛋白的爭(zhēng)議一直困擾著臨床醫(yī)生和患者。傳統(tǒng)觀(guān)念認(rèn)為，大豆蛋白由于非必需氨基酸的存在，加重了腎臟的負(fù)擔(dān)，可能不利于甚至加重腎病患者的病情。但近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明，大豆蛋白飲食可以減輕多種腎病的腎臟損害。Javanbakht等[7]通過(guò)對(duì)腎病綜合征鼠模型的研究發(fā)現(xiàn)，大豆蛋白可以改善腎組織氧化應(yīng)激、減輕腎實(shí)質(zhì)損害。Ibrahim等[8]發(fā)現(xiàn)，大豆蛋白可以降低多囊模型鼠的蛋白尿、改善酸中毒、減輕腎硬化。Yang等[9]研究證實(shí)大豆蛋白可以降低5/6腎次全切大鼠殘余腎組織 TNF-α水平、抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)活性、減緩腎衰竭。而作為大豆蛋白單獨(dú)的一種活性成分，染料木素也已被證實(shí)可以減少糖尿病模型鼠的蛋白尿、降低SCr和BUN、改善脂質(zhì)堆積[10]，對(duì)腎臟具有保護(hù)作用。

本實(shí)驗(yàn)以5/6腎切除建立尿毒癥鼠模型，觀(guān)察染料木素對(duì)ECM的作用情況。研究發(fā)現(xiàn)，在實(shí)驗(yàn)的第4周，C組尿SCr、BUN升高，尿蛋白排泄量增加；第8周時(shí)，SCr、BUN升高更為明顯。G組前述指標(biāo)在第4和第8周時(shí)均明顯低于C組，殘腎組織病理改變亦明顯減輕。結(jié)果表明染料木素可以減輕尿毒癥鼠的腎損傷。全段實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，各組間血清Alb及TP水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，分析其原因可能是雖然尿蛋白排泄量增加，但肝臟尚能代償，故血清Alb及TP水平?jīng)]有明顯降低。

ECM主要由ColⅣ、FN、ColⅠ、ColⅤ型和層粘連蛋白等組成。ColⅣ為基底膜膠原蛋白，主要分布于腎小球、腎小管基底膜以及系膜基質(zhì)之中。FN是一種糖蛋白，由腎小球固有細(xì)胞分泌。目前普遍認(rèn)為，ECM動(dòng)態(tài)平衡的失調(diào)介導(dǎo)了腎小球硬化的發(fā)生、發(fā)展。特別是ColⅣ和FN，其代謝失衡過(guò)程可能參與了腎小球損傷及修復(fù)過(guò)程中的組織重塑[11]?，F(xiàn)已認(rèn)識(shí)到，腎臟正常組織的逐漸纖維化是大多數(shù)慢性腎衰竭進(jìn)行性發(fā)展的共同病理基礎(chǔ)。如能有效地阻止或減緩腎組織纖維化的發(fā)展，對(duì)延緩或改善慢性腎衰具有非常重要的意義。在本實(shí)驗(yàn)中，G組與C組相比，ColⅣ和FN在基底膜和系膜區(qū)的沉積明顯減少。表明染料木素可以減少尿毒癥鼠ECM的蓄積，減緩腎小球硬化。

TGF-β1是一類(lèi)超家族細(xì)胞因子，作用廣泛，參與了體內(nèi)諸如炎癥、血管形成、組織發(fā)生、增生、凋亡等多種生物學(xué)過(guò)程[12-13]，尤其是在ECM的產(chǎn)生和調(diào)控方面意義重大。Meng等[14]認(rèn)為，正?；騼H有微小病變的腎臟中，TGF-β1表達(dá)非常微弱。當(dāng)出現(xiàn)腎損害時(shí)，TGF-β1表達(dá)明顯增強(qiáng)。通過(guò)抑制TGF-β1表達(dá)，可以減輕腎臟纖維化、維護(hù)正常的腎臟功能、保護(hù)殘余腎功能[15]。本實(shí)驗(yàn)中，G組TGF-β1在mRNA、蛋白質(zhì)水平上與C組比較均明顯減弱，提示TGF-β1的過(guò)度表達(dá)可能參與了腎組織間質(zhì)纖維化的過(guò)程，并最終導(dǎo)致慢性腎衰竭。而染料木素有對(duì)TGF-β1的表達(dá)有抑制作用，該結(jié)果與尿蛋白排泄量、血生化、腎組織病理學(xué)改變、ColⅣ和FN的沉積情況等相一致。

綜上所述，染料木素可以降低ColⅣ、FN等ECM的蓄積、減輕腎小球硬化，對(duì)尿毒癥鼠具有一定的腎臟保護(hù)作用，其機(jī)制可能與下調(diào)TGF-β1表達(dá)有關(guān)。

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Effect of genistein on deposition of extracellular matrix in uremic rats

WangHao1，F(xiàn)engBing1△，ZhuChao1，YuJianping2，HuangBaozhuan3

(1.DepartmentofNephrology，No. 411HospitalofPLA，Shanghai200081，China；2.DepartmentofNephrology，ChanghaiHospital，SecondMilitaryMedicalUniversity，Shanghai200433,China；3.DepartmentofNephrology，XuhuiDistrictCentralHospital，Shanghai200031，China)

Objective To investigate the effect of genistein on deposition of extracellular matrix(ECM) in uremic rats and its mechanism.Methods The uremic rat model was established by 5/6 nephrectomy.The model rats were divided into the genistein group(G) and control group (C).The sham-operation group served as the normal control(S).Urinary protein and biochemical indexes before operation,at postoperative 4,8 weeks were measured in various groups.The pathologic changes of renal tissue were observed.The glomerular sclerosis index(GSI) was evaluated by the semi-quantitative method.fibronectin(FN) and type Ⅳcollagen(ColⅣ) deposition situation were detected by using the immunohistochemical method.Western blot and RT-PCR were used to measure the protein expression and mRNA transcription of TGF-β1.Results Comparing postoperative 4 weeks with the group C,the urinary protein excretion amount was decreased[(11.63±2.07)mg/dvs.(19.93±3.19)mg/d，allP<0.01],serum urea nitrogen and creatinine levels of the group G were decreased[(9.39±0.59)mmol/Lvs.(12.09±0.78)mmol/L，(65.11±3.79)mmol/Lvs.(77.63±3.20)μmol/L，allP<0.01].Until postoperative 8 weeks,the urinary protein excretion amount was decreased and the decrease of serum urea nitrogen and creatinine levels was more obvious.The deposition of ColⅣ and FN in renal glomerulus was lower than that of the control group[(17.30±1.96)%vs.(24.68±3.97)%;(18.26±2.31)%vs.(29.35±4.15)%,allP<0.01].Glomerular sclerosis was significantly alleviated.The TGF-β1mRNA and protein expression were attenuated (P<0.05).Conclusion Genistein can reduce the deposition of ECM in uremic rats and has a protective effect on kidney.

genistein;uremia;rats,Sprague-Dawley;collagen type Ⅳ;fibronectin;transforming growth factor beta1

? 著·

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.07.005

王浩(1973-)，副主任醫(yī)師，碩士研究生，主要從事腎臟病營(yíng)養(yǎng)學(xué)研究。△

，E-mail:fengbing411snk@163.com。

R459.3

A

1671-8348(2017)07-0879-04

2016-08-12

2016-11-26)