趙鳳菊，關 淼，李井春，楊本勇，趙曉彤

(遼寧省動物疫病預防控制中心，遼寧沈陽 110164)

產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素基因分型PCR檢測方法的建立及初步應用

趙鳳菊，關 淼，李井春，楊本勇，趙曉彤

(遼寧省動物疫病預防控制中心，遼寧沈陽 110164)

建立一種快速鑒別診斷不同型產(chǎn)氣莢膜梭菌的PCR檢測方法，為動物產(chǎn)氣莢膜梭菌病的快速診斷及流行病學調(diào)查提供有效的技術手段。克服傳統(tǒng)鑒定方法耗時長、費用高的缺點，提高了檢測效率。通過對產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素、β毒素、ε毒素和ι毒素基因序列分析，利用Premier5.0軟件設計并合成了5對特異性引物，建立了針對5種不同型產(chǎn)氣莢膜梭菌的PCR鑒別診斷方法。通過反復試驗確定了最佳退火溫度為53℃。通過靈敏度試驗表明,PCR檢測方法最低能檢測到的DNA濃度α毒素為308 pg/μL，β毒素、ε毒素為30.8 pg/μL，ι毒素A為0.122 pg/μL，ι毒素B為0.05 pg/μL。通過特異性試驗表明,本方法具有較高的特異性。同時，通過對本方法檢測出的陽性樣品16 S rRNA序列分析發(fā)現(xiàn)，與GenBank中的其他產(chǎn)氣莢膜梭菌的16 S rRNA序列同源性均在98%以上。表明建立的檢測方法靈敏度高、特異性強，可以應用于動物產(chǎn)氣莢膜梭菌病的實驗室診斷。

產(chǎn)氣莢膜梭菌；毒素基因；聚合酶鏈反應；鑒別診斷

產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens)是一種能夠形成芽胞的革蘭陽性厭氧菌，是人類、家畜和野生動物共患的一種病原菌[1]。本菌在環(huán)境中廣泛分布，主要通過毒素導致機體發(fā)病。不僅可以導致各種動物壞死性腸炎、腸毒血癥，還可以引起人類食物中毒、壞死性小腸結腸炎和氣性壞疽[2]。這些疾病大多數(shù)發(fā)病迅速，治療困難，常常致命。因此，必須依靠預防措施控制，包括疫苗接種[3]。產(chǎn)氣莢膜梭菌細菌分離培養(yǎng)、生化鑒定及家兔腸袢腸毒素檢測試驗等傳統(tǒng)診斷方法不僅耗時長，同時因需要用家兔作為實驗動物進行腸毒素檢測而增加檢測成本。因此，有必要建立一種快速、敏感、特異的分型診斷方法。目前，產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素至少已發(fā)現(xiàn)19種，其中α、β、ε和ι為主要致死毒素，根據(jù)這4種主要毒素可將產(chǎn)氣莢膜梭菌分為A(α)、B(α、β、ε)、C(α、β)、D(α、ε)、E(α、ι)5個類型[4-5]。不同型的產(chǎn)氣莢膜梭菌不僅可以導致不同的疾病，同時具有發(fā)病急、死亡快、病死率高的特點，病死率高達40%～100%[6]。

本研究以α毒素、β毒素、ε毒素、ι毒素為檢測對象，建立該菌毒素基因的PCR鑒別診斷方法，為產(chǎn)氣莢膜梭菌病的分型診斷提供技術支撐。對于本病的診斷、預防、治療及流行病學調(diào)查具有重要的現(xiàn)實意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣 品 羊梭菌病多聯(lián)干粉滅活疫苗，哈藥集團生物疫苗有限公司產(chǎn)品；ι毒素陽性質(zhì)粒；Ⅱ號炭疽芽胞苗，新疆天康畜牧生物技術股份有限公司產(chǎn)品；大腸埃希菌ATCC25922，杭州市天和微生物試劑有限公司產(chǎn)品；金黃色葡萄球菌、沙門菌、奇異變形桿菌、豬鏈球菌、巴氏桿菌，由遼寧省動物疫病預防控制中心保存。

136份臨床樣品為病死動物的腸內(nèi)容物及患病動物的新鮮糞便。

1.1.2 主要試劑 DNAzol○RReagent提取試劑，Invitrogen公司產(chǎn)品；ExTaqDNA聚合酶、10×Ex-Taqbuffer、2.5 mmol/L dNTPs、DNA Marker DL 2 000、溴化乙錠,寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 引 物 根據(jù)產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)生的4種主要毒素，即α、β、ε和ι毒素基因序列設計，引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，參考序列GenBank收錄號為JN793988、HQ179547、JX010451、X73562.1，引物序列見表1。

1.1.4 主要儀器 高速臺式冷凍離心機、冰箱、PCR儀、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、微波爐、分析天平等。

表1 產(chǎn)氣莢膜梭菌PCR引物的設計

1.2 方 法

1.2.1 臨床樣品的處理 將腸內(nèi)容物、糞便按1∶10倍體積加入無菌生理鹽水，充分攪拌，室溫放置30 min，12 000 r/min離心20 min，取上清液提取DNA。

1.2.2 DNA模板的制備 吸取200 μL樣品至1.5 mL Eppendorf管中，加入800 μL DNAzol提取試劑，混勻后4 ℃、12 000 r/min離心10 min。吸取900 μL上清，置于另一1.5 mL Eppendorf管中，加入500 μL無水乙醇，混勻后4 ℃、12 000 r/min離心5 min。棄上清，無菌水配制的750 mL/L乙醇洗滌2次，干燥后用40 μL無菌水溶解沉淀，置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 PCR反應體系及反應條件 采用25μL反應體系，反應體系為：滅菌蒸餾水 17.375 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，ExTaqDNA聚合酶 0.125 μL，上、下游特異性PCR引物(20 μmol/L) 各0.5 μL，模板 2 μL。

反應條件為：94℃ 5 min；94℃ 45 s，53℃ 45 s，72℃ 45 s， 35個循環(huán)；72℃ 10 min。

1.2.4 特異性試驗 利用優(yōu)化后的反應體系和反應條件對Ⅱ號炭疽芽胞苗、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、沙門菌、奇異變形桿菌、豬鏈球菌、巴氏桿菌進行檢測, 并設立無模板陰性對照。

1.2.5 敏感性試驗 利用優(yōu)化后的反應體系和反應條件，將產(chǎn)氣莢膜梭菌的DNA進行10倍倍比稀釋至10-5，然后進行PCR擴增，以檢測該方法的敏感性。

1.2.6 臨床應用 用本試驗建立的產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素基因分型PCR檢測方法對136份臨床腹瀉樣品進行檢測，同時設立陽性病料對照、無模板陰性對照。并選取15份產(chǎn)氣莢膜梭菌陽性樣品，擴增其16 S rRNA序列，送上海生工生物工程技術服務有限公司進行序列測定，并與NCBI基因庫進行序列同源性比較。

2 結 果

2.1 產(chǎn)氣莢膜梭菌PCR擴增結果

以產(chǎn)氣莢膜梭菌的DNA為模板，利用本試驗建立的方法進行PCR檢測。結果顯示，PCR可擴增出α毒素、β毒素、ε毒素和ι毒素基因的目的條帶，無模板陰性對照無目的條帶(圖1)。

M.DNA 標準DL 2 000;1.α毒素; 2. β毒素; 3. ε毒素; 4. ι毒素A; 5. ι毒素B;N.陰性對照

M.DNA Marker DL 2 000;1.Alpha toxin;2.Beta toxin;3.Epsilon toxin;4.Iota toxin A;5.Iota toxin B;N.Negative control

圖1 目的基因的PCR擴增

Fig.1 Amplification of the target genes by PCR

2.2 特異性試驗結果

利用優(yōu)化后的反應體系和反應條件對Ⅱ號炭疽芽胞苗、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、沙門菌、奇異變形桿菌、豬鏈球菌、巴氏桿菌進行檢測。結果發(fā)現(xiàn)，僅產(chǎn)氣莢膜梭菌的DNA模板能擴增出目的條帶，而對其他被檢細菌均無目的條帶(圖2～圖6)。

2.3 敏感性試驗結果

將產(chǎn)氣莢膜梭菌的DNA進行10倍倍比稀釋至10-5，進行PCR檢測。電泳結果顯示，α毒素最低可以檢測到濃度為308 pg/μL，β毒素、ε毒素最低可以檢測到濃度為30.8 pg/μL，ι毒素A最低可以檢測到濃度為0.122 pg/μL，ι毒素B最低可以檢測到濃度為0.05 pg/μL(圖7～圖11)。

M.DNA 標準DL 2 000;1.產(chǎn)氣莢膜梭菌;2.Ⅱ號炭疽芽胞苗;3.大腸埃希菌;4.金黃色葡萄球菌;5.沙門菌;6.奇異變形桿菌;7.豬鏈球菌;8.巴氏桿菌
M.DNA Marker DL 2 000;1.Clostridiumperfringen;2.B.anthracis;3.E.coli;4.S.aureus;5.Salmonella;6.Proteusmirabilis;7.Stre-ptococcussuis;8.Pasteurella

圖2 α毒素PCR特異性試驗

Fig.2 The specificity test of PCR for alpha toxin

M.DNA 標準DL 2 000;1.產(chǎn)氣莢膜梭菌;2.Ⅱ號炭疽芽胞苗;3.大腸埃希菌;4.金黃色葡萄球菌;5.沙門菌;6.奇異變形桿菌;7.豬鏈球菌;8.巴氏桿菌
M.DNA Marker DL 2 000;1.Clostridiumperfringen;2.B.anthracis;3.E.coli;4.S.aureus;5.Salmonella;6.Proteusmirabilis;7.Stre-ptococcussuis;8.Pasteurella

圖3 β毒素PCR特異性試驗

Fig.3 The specificity test of PCR for beta toxin

M.DNA 標準DL 2 000;1.產(chǎn)氣莢膜梭菌;2.Ⅱ號炭疽芽胞苗;3.大腸埃希菌;4.金黃色葡萄球菌;5.沙門菌;6.奇異變形桿菌;7.豬鏈球菌;8.巴氏桿菌
M.DNA Marker DL 2 000;1.Clostridiumperfringen;2.B.anthracis;3.E.coli;4.S.aureus;5.Salmonella;6.Proteusmirabilis;7.Stre-ptococcussuis;8.Pasteurella

圖4 ε毒素PCR特異性試驗

Fig.4 The specificity test of PCR for epsilon toxin

2.4 臨床樣品檢測結果

通過應用建立的產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素基因分型PCR檢測方法對臨床腹瀉樣品的檢測發(fā)現(xiàn)，35份樣品僅檢測出α毒素，為A型產(chǎn)氣莢膜梭菌；2份樣品僅檢測出α毒素和β毒素，為C型產(chǎn)氣莢膜梭菌；樣品陽性率為27.21%(37/136)。同時，選取15份產(chǎn)氣莢膜梭菌陽性樣品，擴增其16 S rRNA序列，送生物公司進行序列測定，應用在線軟件進行Blast，結果發(fā)現(xiàn)，測定序列與GenBank中的其他產(chǎn)氣莢膜梭菌的16 S rRNA序列同源性均在98%以上。表明該方法能夠很好的用于臨床樣品產(chǎn)氣莢膜梭菌的分型檢測。

M.DNA 標準DL 2 000;1.產(chǎn)氣莢膜梭菌;2.Ⅱ號炭疽芽胞苗;3.大腸埃希菌;4.金黃色葡萄球菌;5.沙門菌;6.奇異變形桿菌;7.豬鏈球菌;8.巴氏桿菌
M.DNA Marker DL 2 000;1.Clostridiumperfringen;2.B.anthracis;3.E.coli;4.S.aureus;5.Salmonella;6.Proteusmirabilis;7.Stre-ptococcussuis;8.Pasteurella

圖5 ι毒素A PCR特異性試驗

Fig.5 The specificity test of PCR for iota toxin A

M.DNA 標準DL 2 000;1.產(chǎn)氣莢膜梭菌;2.Ⅱ號炭疽芽胞苗;3.大腸埃希菌;4.金黃色葡萄球菌;5.沙門菌;6.奇異變形桿菌;7.豬鏈球菌;8.巴氏桿菌
M.DNA Marker DL 2 000;1.Clostridiumperfringen;2.B.anthracis;3.E.coli;4.S.aureus;5.Salmonella;6.Proteusmirabilis;7.Stre-ptococcussuis;8.Pasteurella

圖6 ι毒素B PCR特異性試驗

Fig.6 The specificity test of PCR for iota toxin B

M.DNA 標準DL 2 000;1.30800 pg/μL;2.3080 pg/μL;3.308 pg/μL;4.30.8 pg/μL;5.3.08 pg/μL;6.0.308 pg/μL

M.DNA Marker DL 2 000;1.30800 pg/μL;2.3080 pg/μL;3.308 pg/μL;4.30.8 pg/μL;5.3.08 pg/μL;6.0.308 pg/μL

圖7 α毒素PCR敏感性試驗

Fig.7 The sensitivity result of PCR for alpha toxin

M.DNA 標準DL 2 000;1.30800 pg/μL;2.3080 pg/μL;3.308 pg/μL;4.30.8 pg/μL;5.3.08 pg/μL;6.0.308 pg/μL

M.DNA Marker DL 2 000;1.30800 pg/μL;2.3080 pg/μL;3.308 pg/μL;4.30.8 pg/μL;5.3.08 pg/μL;6.0.308 pg/μL

圖8 β毒素PCR敏感性試驗

Fig.8 The sensitivity result of PCR for beta toxin

M.DNA 標準DL 2 000;1.30800 pg/μL;2.3080 pg/μL;3.308 pg/μL;4.30.8 pg/μL;5.3.08 pg/μL;6.0.308 pg/μL

M.DNA Marker DL 2 000;1.30800 pg/μL;2.3080 pg/μL;3.308 pg/μL;4.30.8 pg/μL;5.3.08 pg/μL;6.0.308 pg/μL

圖9 ε毒素PCR敏感性試驗

Fig.9 The sensitivity result of PCR for epsilon toxin

M.DNA 標準DL 2 000;1.1220 pg/μL;2.122 pg/μL;3.12.2 pg/μL;4.1.22 pg/μL;5.0.122 pg/μL;6.0.0122 pg/μL

M.DNA Marker DL 2 000;1.1220 pg/μL;2.122 pg/μL;3.12.2 pg/μL;4.1.22 pg/μL;5.0.122 pg/μL;6.0.0122 pg/μL

圖10 ι毒素A PCR敏感性試驗

Fig.10 The sensitivity result of PCR for iota toxin A

3 討 論

隨著分子生物學技術的發(fā)展，動物疫病的檢測越來越簡便、快捷，準確性越來越高，為動物疫病防控提供了有力的技術支持，從而有效的控制住動物疫病的蔓延及可能為人類健康帶來的威脅。PCR是目前動物疫病診斷中應用最為廣泛的重要技術手段之一，PCR已經(jīng)被成功運用于各種細菌病的病原鑒定。不僅降低了病原尤其是人畜共患病病原對人類、動物及環(huán)境可能造成的威脅，同時有效的提高了檢測效率，為動物疫病防控爭取到寶貴時間。

M.DNA 標準DL 2 000;1.500 pg/μL;2.50 pg/μL;3.5 pg/μL;4.0.5 pg/μL;5.0.05 pg/μL;6.0.005 pg/μL

M.DNA Marker DL 2 000;1.500 pg/μL;2.50 pg/μL;3.5 pg/μL;4.0.5 pg/μL;5.0.05 pg/μL;6.0.005 pg/μL

圖11 ι毒素B PCR敏感性試驗

Fig.11 The sensitivity result of PCR for iota toxin B

產(chǎn)氣莢膜梭菌攜帶超過17種基因編碼的外毒素，但通常根據(jù)攜帶的一種或多種毒素基因(α毒素、β毒素、ε毒素或ι毒素)將產(chǎn)氣莢膜梭菌分為A、B、C、D、E 5型[7]。產(chǎn)氣莢膜梭菌傳統(tǒng)的分型方法具有試驗周期長、檢測成本較高、操作復雜的缺點，而PCR的應用克服了傳統(tǒng)分型方法的缺點。

本試驗建立的檢測方法具有良好的靈敏性與較強的特異性。16 S rRNA基因序列代表一種原核生物，通過比較變動序列可以從種屬、種類甚至亞種水平進行分類[8]。本研究經(jīng)過對大量臨床樣品的檢測及對部分陽性樣品16 S rRNA 序列的同源性分析發(fā)現(xiàn)，本試驗建立的檢測方法可以快速、準確的運用于產(chǎn)氣莢膜梭菌病的臨床診斷。

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Establishment and Application of PCR Method for Toxin Gene Typing in Clostridium perfringens

ZHAO Feng-ju,GUAN Miao,LI Jing-chun,YANG Ben-yong,ZHAO Xiao-tong

(PreventionandControlCenterofLiaoningProvinceAnimalEpidemicDisease,Shenyang，Liaoning,110164,China)

This study established a rapid diagnostic PCR method forClostridiumperfringens,provided an effective technical means for the rapid diagnosis and epidemiological investigation of animalClostridiumperfringensinfection in order to overcome the long time and high cost disadvantages in traditional identification methods,improve the detection efficiency.Based on the analysis of alpha toxin,beta toxin,epsilon toxin and iota toxin gene sequences forClostridiumperfringens,five pairs of specific primers were designed and synthesized by Premier5.0 software,the PCR method of differential diagnosis forClostridiumperfringenstypes was established.The optimum annealing temperature was 53 ℃ by repeated experiments.The sensitivity test showed that the PCR can detect the lowest concentrations of DNA of the alpha toxin for 308 pg/L,beta toxin,epsilon toxin for 30.8 pg/L,iota toxin A for 0.122 pg/L,iota toxin B for 0.05 pg/L.The specificity test showed that the method has higher specificity.At the same time,through 16 S rRNA sequence analysis of the positive samples,and compared with GenBank in otherClostridiumperfringens16 S rRNA sequence,the homologies were above 98%.Thus,the established detection method has high sensitivity,strong specificity,and can be used in laboratory diagnosis ofClostridiumperfringensinfections in animals.

Clostridiumperfringens; toxin gene; PCR; differential diagnosis

2016-08-06

遼寧省農(nóng)業(yè)攻關及產(chǎn)業(yè)化項目(2015202013)

趙鳳菊(1978-)，女，河北廊坊人，碩士，高級獸醫(yī)師，主要從事人畜共患病防控技術研究。

SS859.87

A

1007-5038(2017)03-0059-05