高?；?，王建東，康曉冬

(寧夏農(nóng)林科學院動物科學研究所，寧夏銀川 750002)

奶牛子宮內(nèi)膜炎源性大腸埃希菌藥敏試驗與耐藥基因檢測

高?；郏踅|，康曉冬*

(寧夏農(nóng)林科學院動物科學研究所，寧夏銀川 750002)

為探索奶牛子宮內(nèi)膜炎源性大腸埃希菌耐藥基因及其耐藥性之間的關(guān)系。采用K-B紙片法對臨床分離的54株奶牛子宮內(nèi)膜炎源性大腸埃希菌進行12種抗菌藥物敏感性測定，應用PCR進行這些抗菌藥物相關(guān)耐藥基因的檢測。結(jié)果顯示，54株大腸埃希菌對復方新諾明、恩諾沙星和四環(huán)素的耐藥率較高，分別為67%、39%和35%。分離的54株大腸埃希菌中有41株至少含有所檢測耐藥基因中的1種，CyrA、CyrB、ParC和Tet耐藥基因較為普遍，其耐藥菌基因檢出率依次為96%、83%、100%和95%，13株沒有檢測到相應的耐藥基因。奶牛子宮內(nèi)膜炎源性大腸埃希菌對常見抗菌藥物耐藥嚴重，耐藥基因普遍存在于耐藥菌株中，除氨基糖苷類耐藥菌株，其他3種抗菌藥物類型耐藥表型與耐藥基因檢測結(jié)果有較高一致性。

奶牛；子宮內(nèi)膜炎；大腸埃希菌；耐藥基因；耐藥性

子宮內(nèi)膜炎是奶牛產(chǎn)后多發(fā)的繁殖障礙性疾病，大大降低奶牛的繁殖性能，增加養(yǎng)殖成本，給奶牛業(yè)的健康發(fā)展帶來極大困擾。一直以來奶牛子宮內(nèi)膜炎依靠抗菌藥物進行治療，使得細菌耐藥性越來越嚴重，且由于抗菌藥選擇壓力的長期存在，導致其進化產(chǎn)生的耐藥基因型種類繁多[1]。大腸埃希菌是分離的主要病原菌，深入研究其耐藥性及耐藥基因有重要意義。大腸埃希菌極易產(chǎn)生耐藥性，被稱為耐藥決定因子的貯存庫，并且能將耐藥因子傳遞給腸道的其他病原微生物[2]。近年來，國內(nèi)外對大腸埃希菌的耐藥性及耐藥基因的研究也逐漸增多，但多集中在人、食品、家禽和豬，關(guān)于奶牛子宮內(nèi)膜炎源性大腸埃希菌耐藥基因的報道卻很少。本研究對奶牛子宮內(nèi)膜炎源性大腸埃希菌進行了耐藥性分析，設計了8對耐藥基因引物，檢測奶牛子宮內(nèi)膜炎大腸埃希菌耐藥基因攜帶情況，為大腸埃希菌耐藥機制進一步研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 來自寧夏農(nóng)林科學院動物科學研究所實驗室鑒定保存的54株奶牛子宮內(nèi)膜炎源性的大腸埃希菌，樣本來自寧夏吳忠市及周邊奶牛場的患子宮內(nèi)膜炎病牛。

1.1.2 主要試劑 2×TaqPCR MasterMix、Marker 1、Marker 2、質(zhì)粒小提試劑盒、細菌基因組DNA提取試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品；營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(20150802)、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基(20150831)，青島高科園海博生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；阿米卡星(AMI,30 μg/片，批號20150524)、慶大霉素(GEN,10 μg/片，批號20150429)、鏈霉素(STR,10 μg/片，批號20150513)、卡那霉素(KAN,30 μg/片，批號20150529)、頭孢氨芐(AMP,30 μg/片，批號150416)、四環(huán)素(TET,30 μg/片，批號20150521)、恩諾沙星(ENR,5 μg/片，批號150519)、諾氟沙星(NOR,10 μg/片，批號20150813)、氧氟沙星(OFL,5 μg/片，批號20150514)、復方新諾明(SMZ,23.75 μg/片,批號150520)、環(huán)丙沙星(CIP,10 μg/片，批號20150822)12種藥敏試紙片，杭州天和微生物試劑有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 細菌DNA的提取 將純培養(yǎng)的大腸埃希菌分別接種于標記好的1 mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)16 h，用質(zhì)粒小提試劑盒、細菌基因組DNA提取試劑盒，分別提取質(zhì)粒DNA和染色體DNA。得到的DNA分裝后，置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.4 PCR引物合成 按照GenBank 公布的耐喹諾酮類基因CyrA、CyrB、ParC，耐氨基糖苷類基因Aph(3′)-Ⅱ、aadA1、aadB，耐磺胺類Sul2，耐四環(huán)素TetA基因序列設計基因PCR擴增的引物，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司合成。引物序列信息：GyrA基因P1：5′-GGTGACGTAATCGGTAAATA-3′，P2：5′-ACCATGGTGCAATGCCACCA-3′，預期擴增的GyrA基因大小為810 bp，擴增條件：95℃ 5 min；94℃ 30 s，53℃ 45 s，72℃ 1 min，30個循環(huán)；72℃ 5 min。GyrB基因P1：5′-GTACAGGATGACGGGCGCGG-3′，P2：5′-GTACTCGTCACGACCGATACC-3′，預期擴增的GyrB基因大小為1 239 bp，擴增條件：95℃ 5 min；94℃ 30 s，53℃ 45 s，72℃ 1 min，30個循環(huán)；72℃ 5 min。ParC基因P1：5′-CTGGGTAAATACCATCCGCAC-3′，P2：5′-CGGTTCATCTTCATTACGAA-3′，預期擴增的ParC基因大小為987 bp，擴增條件：95℃ 5 min；94℃ 30 s，53℃ 45 s，72℃ 1 min，30個循環(huán)；72℃ 5 min。Aph(3′)-Ⅱ基因P1：5′-ATCCCCGGGAAAACAGATT-3′，P2：5′-CGTCCAACATCAATACAACC-3′，預期擴增的Aph(3′)-Ⅱ基因大小為365 bp，擴增條件：95℃ 5 min；94℃ 15 s，52℃ 20 s，72℃ 1 min，30個循環(huán)；72℃ 5 min。aadA1基因P1：5′-GGAGAATGGCAGCGCAAT-3′，P2：5′-GTTACTGCGCTGTACCAAT-3′，預期擴增的aadA1基因大小為269 bp，擴增條件：95℃ 5 min；94℃ 15 s，52℃ 20 s，72℃ 1 min，30個循環(huán)；72℃ 5 min。aadB基因P1：5′-GGCGCGGCGAGCTCGAGGCA-3′，P2：5′-GCAAGACCTCAACCTTTTCC-3′，預期擴增的aadB基因大小為345 bp，擴增條件：95℃ 5 min；94℃ 15 s，52℃ 20 s，72℃ 1 min，30個循環(huán)；72℃ 5 min。Sul2基因P1：5′-GATGGCATTCCCGTCTCG-3′，P2：5′-TTCTTGCGGTTTCTTTCAGC-3′，預期擴增的Sul2基因大小為577 bp，擴增條件：95℃ 5 min；94℃ 15 s，53℃ 20 s，72℃ 1 min，30個循環(huán)；72℃ 5 min。TetA基因P1：5′-TACGGGAGTTTGTTGGA-3′，P2：5′-GTATGGAGGATGTGGTTTC-3′，預期擴增的TetA基因大小為525 bp，擴增條件：95℃ 5 min；94℃ 15 s，53℃ 20 s，72℃ 1 min，30個循環(huán)；72℃ 5 min。

1.2 方法

1.2.1 藥敏檢測 本試驗采用紙片擴散法(K-B法)進行藥物敏感性試驗，方法同文獻[3]。根據(jù)臨床實驗室標準化協(xié)會(CLSI)標準判定，以確定奶牛子宮內(nèi)膜炎源性大腸埃希菌對12種藥物敏感性。

1.2.2 耐藥基因PCR檢測 根據(jù)耐藥性檢測結(jié)果，針對喹諾酮類耐藥基因中CyrA、CyrB、ParC基因，對耐氨基糖苷類中Aph(3，)-Ⅱ、aadA1、aadB基因，耐磺胺類中Sul2基因，對耐四環(huán)素大腸埃希菌中TetA基因進行PCR擴增。用提取保存?zhèn)溆玫腄NA為模板，擴增體系25 μL：2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，ddH2O為10.5 μL。取5 μLPCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，用DNA Maker標記，1×TAE電泳緩沖液，電壓120 V，電泳時間40 min，對結(jié)果進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 藥敏試驗結(jié)果

54株大腸埃希菌對抗菌藥物的敏感性測定結(jié)果見表1。54株大腸埃希菌對試驗藥物呈現(xiàn)不同程度的耐藥，其中對復方新諾明、恩諾沙星、四環(huán)素、頭孢氨芐和鏈霉素的耐藥率較高，分別為67%、39%、35%、20%和15%，對阿米卡星、頭孢唑啉的耐藥率為最低為4%。

表1 大腸埃希菌分離株對抗菌藥物的耐藥率

2.2 耐藥譜結(jié)果

54株大腸埃希菌對抗菌藥物的耐藥譜結(jié)果見表2。由表2可知，54株大腸埃希菌中多重耐藥(≥3)的分離菌占32%，分離株最多可以對7種抗菌藥物耐藥，其中耐7種藥物的占4%，耐6種藥物的占2%，耐5種藥物的占8%，耐4種藥物的占6%，耐3種藥物的占14%。

2.3 抗菌藥物耐藥基因檢測結(jié)果

2.3.1 耐藥基因擴增結(jié)果 擴增出了aadA1、sul2、CyrB、CyrA、Parc、Aph(3′)-Ⅱ和Tet 7種基因，部分大腸埃希菌耐藥基因PCR擴增電泳結(jié)果見圖1。

表2 54株大腸埃希菌分離株耐藥譜

2.3.2 耐藥基因分布 在54株大腸埃希菌中，共檢測到7種耐藥基因，見表3。試驗所選用的耐藥基因編碼的耐藥表型在大腸埃希菌中有很高的流行性，這些耐藥基因分別編碼對4類抗菌藥物的耐藥性，它們分別是氨基糖甙類(Aph(3′)-Ⅱ、aadA1、aadB)、磺胺類(Sul2)、喹諾酮(CyrA、CyrB、ParC)和四環(huán)素類(Tet)。

在檢測的17株耐阿米卡星或慶大霉素或鏈霉素或卡那霉素的大腸埃希菌中，僅有7株同時擴增到aadA1、Aph(3′)-Ⅱ基因中的1個。所有耐基糖苷類大腸埃希菌中均未檢測到aadB基因，表型耐藥與耐藥基因符合率為41%。在檢測的24株耐恩諾沙星或氧氟沙星或環(huán)丙沙星或諾氟沙星的大腸埃希菌中，24株同時擴增到CyrA、CyrB、ParC基因中的1個，表型耐藥與耐藥基因符合率為100%。在檢測的36株耐磺胺類大腸埃希菌中，攜帶Sul2基因的為28株，符合率為78%。在檢測的19株耐四環(huán)素類大腸埃希菌中，攜帶Tet基因的為18株，符合率為95%。

M.DNA 標準DL 600;A1～A6.CyrA基因擴增產(chǎn)物；B1～B6.aadA1基因擴增產(chǎn)物；C1～C6.Tet基因擴增產(chǎn)物；D1～D6.aadB基因擴增產(chǎn)物

M.DNA Marker DL 600;A1-A6.PCR products of CyrA gene;B1-B6.PCR products of aadA1 gene;C1-C6.PCR products of Tet gene;D1-D6.PCR products of aadB gene

圖1 部分大腸埃希菌耐藥的基因PCR擴增電泳圖

3 討論

病原菌感染是引起奶牛子宮內(nèi)膜炎的主要因素，目前報道的主要有大腸埃希菌、芽胞桿菌、化膿隱秘桿菌、無乳鏈球菌等數(shù)十種細菌[4]，引起奶牛子宮內(nèi)膜炎病原菌中大腸埃希菌分離率最高[5]。大腸埃希菌是人和許多動物腸道中最主要且數(shù)量最多的一種細菌，是條件性致病菌，正常條件下不致病，多同其他細菌或病毒共同感染，也可導致嚴重疾病。因此，對生產(chǎn)實際中分離的大腸埃希菌耐藥性的調(diào)查、分離、鑒定及耐藥機制的研究有重要意義，同時為進一步研究和探討細菌耐藥性提供理論依據(jù)。

3.1 大腸埃希菌對抗菌藥物的耐藥性

諸多研究結(jié)果表明，大腸埃希菌對不同抗菌藥物表現(xiàn)出不同的耐藥性。本研究發(fā)現(xiàn)奶牛子宮內(nèi)膜炎源性大腸埃希菌對復方新諾明、恩諾沙星和四環(huán)素具有較高耐藥率，對阿米卡星、頭孢唑啉耐藥率較低，多重耐藥普遍存在。有研究報道，豬源性常在大腸埃希菌以多重耐藥性為主[6]，奶牛子宮內(nèi)膜炎大腸埃希菌分離株均呈現(xiàn)多重耐藥[5]。細菌耐藥性與其本身特性、耐藥基因的傳播和藥物的常規(guī)使用情況等因素有關(guān)[7]。建議獸醫(yī)臨床治療使用阿米卡星、頭孢唑啉。

3.2 大腸埃希菌耐藥譜分析

本研究表明，32%的奶牛子宮內(nèi)膜炎大腸埃希菌表現(xiàn)出多重耐藥(≥3)的耐藥表型，只有復方新諾明、恩諾沙星和卡那霉素檢出存在單獨攜帶，分別占28%、2%和2%，這說明奶牛疾病防治中抗菌藥物的超劑量和大量使用可能引起大腸埃希菌產(chǎn)生多重耐藥。有研究揭示，奶牛子宮內(nèi)膜炎致病性大腸埃希菌的耐藥性和多重耐藥性與整合子攜帶有著密切關(guān)系[8]。

3.3 大腸埃希菌耐藥基因檢測分析

本試驗對4類抗菌藥物表型的大腸埃希菌攜帶的耐藥基因進行了檢測分析，結(jié)果表明，除氨基糖苷類耐藥菌株，其他3種抗菌藥物類型耐藥表型與耐藥基因檢測結(jié)果有較高一致性。多重耐藥現(xiàn)象較為普遍，存在一種細菌檢測出幾種不同類型的耐藥基因。3種氨基糖苷類耐藥基因檢測出aadA1和Aph(3′)-Ⅱ，未檢測出aadB基因，其中10株耐氨基糖苷類菌株、2株復方新諾明、1株四環(huán)素耐藥菌株沒有檢測到相應的耐藥基因，可能是攜帶其他耐藥基因或者存在其他耐藥機制。值得注意的是59%的耐氨基糖苷類菌株沒有檢測到相應耐藥基因。有研究認為，氨基糖苷類藥物耐藥表型與耐藥基因的符合率存在差異，是由于一種鈍化酶可以介導多種氨基糖苷類藥物的耐藥性，多種鈍化酶可以介導同一氨基糖苷類藥物耐藥，一種鈍化酶又可由多種基因編碼而導致[9]，還有研究表示，大腸埃希菌acrD主動外排泵可以從細胞漿和細胞質(zhì)中捕獲氨基糖苷類藥物[10]，氨基糖苷類耐藥菌株主動外排基因acrD mRNA的轉(zhuǎn)錄、表達和氨基糖苷類耐藥水平呈正相關(guān)[11]，其耐藥機制有待進一步研究。同時研究發(fā)現(xiàn)，中度敏感菌株也可以檢測到相應的耐藥基因，這同基因的表達程度、不同藥物的抗菌活性、對酶的穩(wěn)定性差異以及基因型的流行有關(guān)[12]。

3.4 表型與耐藥相關(guān)性

試驗證明，攜帶耐藥基因的大腸埃希菌對四環(huán)素類、磺胺類、氨基糖苷類、喹諾酮類抗菌藥物等表現(xiàn)出耐藥，存在多種耐藥基因共存現(xiàn)象，使得大腸埃希菌多重耐藥形勢嚴峻。除氨基糖苷類耐藥菌株(符合率=41%)，其他3種抗菌藥物類型耐藥表型與耐藥基因型基本呈正相關(guān)(符合率≥78%)。

[1] Levy B,Marshall B.Antibacterial resistance worldwide:Causes, challenge and responses[J].Nat Med,2004,10(12S):S122-S129.

[2] 王孝武，王旭榮， 楊志強，等．奶牛子宮內(nèi)膜炎研究進展[J].動物醫(yī)學進展，2014,35(7)：98-102.

[3] 劉溪源，黃 龍，高菊梅，等．關(guān)于寧夏地區(qū)首次從乳房炎乳樣中檢出非脫羧勒克菌的研究[J].中國畜牧獸醫(yī),2014,41(11):247-251.

[4] 王孝武，王旭榮，楊志強，等．甘肅省某牛場奶牛子宮內(nèi)膜炎病原菌的分離鑒定及其耐藥性分析[J].西北農(nóng)業(yè)學報,2014,23(6):16-24.

[5] 趙紅霞，李培峰，吳聰明，等．奶牛子宮內(nèi)膜炎大腸桿菌的分離血清型鑒定及其耐藥性測定[J].中國獸醫(yī)雜志,2009,45(4):22-23.

[6] 湯景元，王紅寧，張鵬舉，等．95個豬場大腸桿菌耐藥表型及氨基糖苷類藥物耐藥基因型調(diào)查[J].畜牧獸醫(yī)學報，2008,39(4):472-477.

[7] 金文杰，秦愛建，鄭志明，等．禽致病性大腸桿菌中四種抗氨基糖苷類藥物耐藥基因的分子流行病學調(diào)查[J].中國預防獸醫(yī)學報,2009,5(29):104-404.

[8] 趙紅霞，李培峰，吳聰明．等．奶牛子宮內(nèi)膜炎大腸桿菌耐藥性及其與整合子關(guān)系的研究[J].畜牧獸醫(yī)學報,2009,40(1):142-144.

[9] 陳 琳，張俊豐，劉健華，等．rmtB陽性豬大腸埃希氏菌中氨基糖苷鈍化酶分析[J].中國畜牧獸醫(yī),2009,36(12):31-35.

[10] Aires J R,Nikaido H.Aminoglycosides are captured from both periplasm and cytoplasm by the acrD multidrug efflux transporter ofEscherichiacoli[J].J Bacteriol,2005,187(6):1923-1929.

[11] 孫 慧，雷 戰(zhàn)，鄒金峰，等．山東地區(qū)禽源致病性大腸桿菌氨基糖苷類藥物耐藥性及耐藥基因的檢測[J].中國獸醫(yī)學報,2011,9(31):1279-1282.

[12] 劉芳萍，趙玉林，李昌文，等．雞源性沙門氏菌耐藥基因檢測與耐藥相關(guān)性分析[J].中國預防獸醫(yī)學報,2013,35(8):627-630.

Drug Susceptibility Test and Drug Resistance Gene Detection of Escherichia coli from Cows with Endometritis

GAO Hai-hui, WANG Jian-dong , KANG Xiao-dong

(InstituteofAnimalScienceNingxiaAgricultureandForestryAcademy,Yinchuan,Ningxia,750002,China)

To investigate the relationship between resistance genes and drug resistance inEscherichiacoliisolated from cow endometritis,drug susceptibility test of 54E.colistrains from cow endometritis to 12 antimicrobials were conducted by using K-B method,and PCR technique was used to detect the the resistance genes related to antimicrobials.The resistant rate of 54E.colistrains to cotrimoxazole,enrofloxacin,tetracycline were 67%,39% and 35%.At least one resistance gene was detected in 41E.colistrains.The detected rates of CyrA，CyrB，ParC，Tet genes were more common and detected rates were 96%,83%,100%,95%,13 strains detected were no resistance gene.E.coliwas seriously resistant to antimicrobials.Resistant genes were widely exsited in drug-resistant strains.Antimicrobial phenotypes ofE.coliisolated from cow endometritis were very consistent with their genotypes except aminoglycosides.

cow;endometritis;Escherichiacoli;drug resistance gene；drug resistance

2016-07-14

寧夏農(nóng)林科學院科技創(chuàng)新先導資金項目(NKYG-14-19)

高?；?1990-)，女，寧夏吳忠人，助理研究員，碩士，主要從事預防獸醫(yī)學研究。*通訊作者

S852.612

A

1007-5038(2017)03-0050-05