郭亞男，曹思婷，何生虎，王 爽，張 鑫，孫 鵬

(寧夏大學農學院，寧夏銀川 750021)

寧夏某肉牛場牛支原體分離鑒定及病理組織學觀察

郭亞男，曹思婷，何生虎*，王 爽，張 鑫，孫 鵬

(寧夏大學農學院，寧夏銀川 750021)

為了分離鑒定寧夏某肉牛場牛支原體和分析該病原對靶器官的損傷，采用Thiaucourt's液體篩選培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基進行病原分離，設計牛支原體16 S rRNA通用引物和uvrC特異性引物進行基因序列擴增并測序，使用DNA Star軟件將分離菌株測序結果與GenBank中的標準株序列進行同源性比較，采用MEGA6.0軟件中的鄰接法(Neighbor-joining,NJ)依據(jù)16 S rRNA和uvrC序列構建分離株系統(tǒng)發(fā)育樹并進行遺傳進化分析，采用石蠟切片，HE染色，病理組織學觀察。結果表明，病原菌落呈油煎蛋樣，16 S rRNA和uvrC擴增片段與陽性對照一致，16 S rRNA和uvrC基因序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹與牛支原體在同一分支；肺組織結構消失，部分肺泡腔實變、塌陷，局灶性肺出血，肺泡腔內可見炎性細胞浸潤；肺泡隔增厚、出血，肺泡內有少量脫落的上皮細胞；肺泡壁斷裂，肺泡腔可見紅色的炎性滲出物，有纖維結締組織增生。

牛支原體；分離；鑒定；病理組織學

牛支原體(Mycoplasmabovis)能夠引起牛發(fā)生肺炎、關節(jié)炎、乳房炎、結膜炎，以及懷孕母牛流產、生殖器感染等多種疾病[1]。1961年，美國首次從患乳房炎的病牛乳中分離到牛支原體[2]，1976年被確定為引起牛呼吸系統(tǒng)疾病的病原之一。目前，牛支原體感染已經在多個國家和地區(qū)發(fā)生，對養(yǎng)牛業(yè)造成嚴重的經濟損失[3]。我國于1983年由黎濟申[4]首次報道從乳房炎牛乳中分離到了牛支原體， 2008年湖北省相繼報道從肉牛和犢牛肺臟中分離到牛支原體[5]，2010年李新民等[6]首次報道寧夏地區(qū)從肉牛肺臟分離到了牛支原體。隨后我國多地不斷有分離鑒定到牛支原體的報道。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 2016年3月寧夏某肉牛場從山東濟寧市購買了34頭5月齡左右的肉牛一批，購回1周后發(fā)生了全群疫病感染情況。當天死亡1頭，3 d后又死亡1頭，5 d后相繼死亡12頭，沒有死亡的20頭牛呈進行性消瘦?；寂１憩F(xiàn)精神沉郁、頭低垂，采食量下降，咳嗽，高熱(40℃～42℃)，眼部水腫、毛皮汗?jié)?，口鼻分泌漿液性分泌物(圖1)， 呼吸困難、喘息等癥狀，胸部聽診有濕啰音。

圖1 患牛精神沉郁、眼部水腫、鼻腔分泌黏性化膿性分泌物

剖檢的病牛肺組織表面分布大小不一的結節(jié)狀突起病灶，質地發(fā)硬無彈性，淤血、出血，出現(xiàn)大小不等的灰白色干酪樣或化膿性壞死灶(圖2和圖3)。

圖2 大小不等的灰白色干酪樣或化膿性壞死灶

圖3 淤血和出血

通過臨床癥狀和剖檢結果初步懷疑為牛支原體感染，隨即將牛群進行隔離。為確診病原，無菌采集剖檢肉牛肺臟進行病原學診斷及病理組織學觀察。

1.1.2 主要試劑和儀器 BPN-80CH二氧化碳培養(yǎng)箱，上海一恒科學儀器有限公司產品；QYC-200氣浴搖床，上海?，攲嶒炘O備有限公司產品；S1000TM Thermal Cycler，Bio-Rad；DYY-6C 電泳儀，北京市六一儀器廠產品；無支原體新生牛血清，Gibco公司產品(生產批號：1128145)；PPLO肉湯，美國BD公司產品(生產批號：3018438)；細菌基因組DNA提取試劑盒，購自康為世紀生物科技有限公司(生產批號：00041311)；DNA膠回收試劑盒，購自OMEGA公司D2500-01。

1.1.3 引物的設計與合成 參考GenBank 中登錄的MycoplasmabovisHB0801基因全序列，分別設計16 S rRNA通用引物和uvrC特異性引物，引物由北京三博遠志生物技術有限責任公司合成。

Mycoplasmabovis16 S rRNA通用引物：forward primer：5′-GAATTCCGAGAGTTTGATCCTGGCT-3′；reverse primer：5′-AAGCTTGAGGTAATCCATCCCCACGTTC -3′。

MycoplasmabovisuvrC特異性引物：forward primer：5′-GAATTCAATGTGTCTACTAGTCCTGG-3′；reverse primer：5′-AAGCTTAGCGTCATAGATTTTTGCATA-3′。

1.2 方法

1.2.1 病原的分離 將采集的肺臟組織表面用火焰滅菌，剪取肺臟深部組織一小塊，然后無菌操作條件下接種于牛支原體Thiaucourt's液體篩選培養(yǎng)基中和牛支原體Thiaucourt's固體篩選培養(yǎng)基，每份病料樣品接種3個液體培養(yǎng)基和3個固體培養(yǎng)基。固體培養(yǎng)基置于體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)2 d后，顯微鏡下觀察菌落形態(tài)；液體培養(yǎng)基于37℃恒溫搖床培養(yǎng)2 d后觀察培養(yǎng)基顏色變化情況，將變黃的培養(yǎng)液用0.22 μm除菌濾膜過濾，重復培養(yǎng)過濾液2次后接種于牛支原體Thiaucourt's固體篩選培養(yǎng)基中，并置于體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)2 d后，顯微鏡下觀察菌落形態(tài)。

1.2.2 16 S rRNA及uvrC特異性基因序列擴增與測序 取過濾后2次培養(yǎng)的培養(yǎng)物5 mL，12 000 r/min離心10 min,然后使用細菌基因組DNA提取試劑盒對沉淀物進行基因組DNA的提取。分別使用上述的支原體16 S rRNA引物和牛支原體uvrC特異性引物擴增支原體純培養(yǎng)物16 S rRNA基因序列和牛支原體uvrC特異性基因序列，預計擴增片段大小分別為1 500 bp和1 600 bp。

PCR反應體為25 μL體系為：模板2 μL，上、下游引物各0.5 μL(10 μmol/L)，2×TaqMaster Mix 10 μL，ddH2O 12 μL。16 S rRNA PCR反應條件：95 ℃ 2 min；95 ℃ 30 s，57 ℃ 20 s，72 ℃ 2 min，30 個循環(huán)；72 ℃延伸8 min，4℃結束反應。

特異性PCR反應條件：95 ℃ 2 min；95 ℃ 30 s，50 ℃ 20 s，72 ℃ 2 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸8 min，4℃結束反應。

PCR擴增產物經10 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析，用凝膠回收試劑盒純化回收PCR產物，將PCR純化產物送上海生工生物工程技術服務有限公司測序。

1.2.3 病原菌同源性比較與遺傳進化分析 使用DNA Star軟件將分離菌株測序結果與GenBank中的標準株序列進行同源性比較，采用MEGA6.0軟件中的鄰接法(Neighbor-joining,NJ)依據(jù)16 S rRNA和uvrC序列構建分離株系統(tǒng)發(fā)育樹，并進行遺傳進化分析。

1.2.4 病理組織學觀察 將采集的組織浸泡于100 mL/L的福爾馬林溶液，固定7 d后，石蠟包埋，HE染色，光學顯微鏡下觀察。

2 結果

2.1 菌落形態(tài)

接種于Thiaucourt's固體篩選培養(yǎng)基的組織樣于體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)2 d后，可觀察到針尖大小的菌落，400倍顯微鏡下可觀察到牛支原體典型的“油煎蛋”樣菌落形態(tài)(圖4)；在Thiaucourt's液體篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)的病原經過濾2次培養(yǎng)后，接種于Thiaucourt's固體篩選培養(yǎng)基后亦可觀察到針尖大小的菌落，100倍顯微鏡下呈現(xiàn)牛支原體典型的“油煎蛋”樣菌落形態(tài)(圖5)，菌落形態(tài)比直接接種于Thiaucourt's固體篩選培養(yǎng)基的菌落形態(tài)更為明顯。

圖4 “油煎蛋”樣菌落形態(tài)(400×)

圖5 “油煎蛋”樣菌落形態(tài)(100×)

2.2 病原菌同源性比較及遺傳進化分析結果

通過對病原菌DNA 進行牛支原體16 S rRNA通用引物和uvrC特異性引物擴增，并經10 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析，結果顯示,16 S rRNA和uvrC擴增片段的序列大小約為1 500 bp、1 600 bp(圖6和圖7)。經測序，16 S RNA和uvrC序列大小分別為1 465 bp 、1 576 bp；16 S rRNA序列同源性比較結果顯示，PYRN2016與GenBank中的牛支原體MC3386、M148/88、PG45株同源性最高。構建的系統(tǒng)發(fā)育樹結果表明，PYRN2016與已報道的牛支原體MC3386、M148/88及國際菌株PG45遺傳距離最近，與MC3386自檢支持率高達94 %(圖8)；uvrC序列同源性比較結果顯示，PYRN2016與GenBank中的牛支原體Egy-11-DK-14、Egy-11-FA-14、HB0801-P180、HB0801-P150株同源性最高。構建的系統(tǒng)發(fā)育樹結果表明，PYRN2016與已報道的牛支原體Egy-11-DK-14、Egy-11-FA-14、HB0801-P180、HB0801-P150遺傳距離最近，與Egy-11-DK-14自檢支持率高達94 %(圖9)。

M.DNA 標準DL 2 000;1.陽性對照；2.擴增產物

M.DNA Marker DL 2 000;1.Positive control;2.Amplified product

圖6 uvrC引物PCR擴增結果

Fig.6 uvrC primer PCR amplification results

M.DNA 標準DL 2 000;1.陽性對照；2.擴增產物

M.DNA Marker DL 2 000;1.Positive control;2.Amplified product

圖7 16 S rRNA引物PCR擴增結果

Fig.7 16 S rRNA primer PCR amplification results

圖8 根據(jù)16 S rRNA基因序列構建的PYRN2016菌株系統(tǒng)發(fā)育樹

圖9 根據(jù)uvrC基因序列構建的PYRN2016菌株系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 病理組織學觀察

正常的肺組織切片觀察見圖10和圖11。病牛肺組織結構消失，部分肺泡腔實變、塌陷，局灶性肺出血，肺泡腔內可見炎性細胞浸潤(圖12和圖13)；肺泡隔增厚、出血，肺泡內有少量脫落的上皮細胞(圖14)；肺泡壁斷裂，肺泡腔可見紅色的炎性滲出液，有纖維結締組織增生(圖15)。

圖10 正常肺臟組織切片(HE,100×)

圖11 正常肺臟組織切片(HE,400×)

圖12 肺泡隔增厚，肺泡腔塌陷，局灶性肺出血，肺泡腔內充有中性粒細胞為主的滲出物(HE,100×)

圖13 肺泡腔實變，肺泡塌陷、肺泡腔內可見疑似炎性細胞浸潤(HE,100×)

圖14 肺泡壁出血，肺泡隔增厚，肺泡內有少量脫落的上皮細胞，炎性細胞浸潤(HE,400×)

圖15 肺泡壁斷裂，肺泡腔可見紅色的炎性滲出液，肺泡隔增厚,有纖維結締組織增生(HE,400×)

3 討論

牛支原體是柔膜體綱、支原體目、支原體科、支原體屬的一員，無細胞壁，具有典型的油煎蛋樣菌落形態(tài)，對外界環(huán)境的抵抗力弱，但因為牛支原體具有高頻變異性的表面脂蛋白，使牛支原體具有多樣性，進而逃避宿主的免疫應答，所以卻能夠廣泛存在于自然界中[7-9]。牛支原體與絲狀支原體絲狀亞種引起的臨床癥狀極為相似，而且牛支原體與無乳支原體16 S rRNA基因的可變區(qū)域中僅有8個不同的核苷酸，致使這2種病原的16 S rRNA基因序列具有99%的相似性[10-11]，利用擴增16 S rRNA進行這2種病原的鑒別較為困難，因此僅利用16 S rRNA進行病原的鑒定有一定的局限性[12-13]。uvrC基因為支原體的復制修復基因，具有物種特異性，在牛支原體和無乳支原體內，uvrC基因又具有高度保守性，因此，uvrC基因可作為牛支原體和無乳支原體PCR診斷的理想靶基因，可有效的區(qū)分無乳支原體和牛支原體[14]。

國外報道牛支原體入侵牛場2周內可在牛群流行[15]，長途運輸、飼養(yǎng)環(huán)境變化、氣候變化等因素可誘發(fā)牛支原體病的發(fā)生，我國牛支原體病的暴發(fā)機會都與運輸有關，多數(shù)引進后1周左右發(fā)病，部分牛第2天即發(fā)病，少數(shù)牛在10 d左右發(fā)病[16]。本次分離的牛支原體是從山東引進的一批5月齡左右的肉牛體內分離，該批肉牛從引進后1周開始發(fā)病并出現(xiàn)死亡情況，隨后引發(fā)全群發(fā)病，與國內外報道的牛支原體規(guī)律一致。在發(fā)病12 d內，共引發(fā)14頭犢牛死亡，發(fā)病率高達100 %，病死率達41.18 %。分析此次引發(fā)牛支原體發(fā)病原因可能是由于該批肉牛在購買時未按照國家規(guī)定進行相關疫病的檢測，購買的牛只攜帶牛支原體病原，加上長途運輸對牛群造成應激加上飼養(yǎng)環(huán)境的變化，導致牛體抵抗力降低，最終誘發(fā)牛支原體疾病的發(fā)生。因此，在從外地調運牛只時，應將牛支原體做為必檢的病原之一，對檢測為陽性牛只進行隔離，采集病料進行病原的分離鑒定；在引進牛后，若發(fā)生疑似牛支原體感染的臨床癥狀時，應及時隔離并進行鑒定，鑒定出病原后，應立即將患牛進行撲殺、對養(yǎng)殖場所進行嚴格的消毒并對全群牛只進行檢測，防止病原繼續(xù)傳播。

在牛支原體分離過程中，通過液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基同時接種發(fā)現(xiàn)，通過固體培養(yǎng)基進行分離，時間較短，但是菌落形態(tài)較小。經過液體培養(yǎng)后進行過濾培養(yǎng)，培養(yǎng)2次后進行固體培養(yǎng)基接種，菌落形態(tài)明顯，但培養(yǎng)時間相對較長。uvrC特異性引物與16 S rRNA引物的配合使用可以快速的對牛支原體病原進行鑒定，并可以排除與無乳支原體和絲狀支原體的混淆。在臨床上可以有效的鑒別牛支原體病原。

牛支原體可引發(fā)肺炎、關節(jié)炎、中耳炎等癥狀，但是引起牛急性死亡的主要是牛支原體引發(fā)的肺炎。牛支原體病原侵入牛呼吸系統(tǒng)，侵害氣管、支氣管、肺臟等組織，使牛正常肺組織結構消失，肺泡實變、塌陷、出血，炎性滲出，肺泡隔增厚、出血，纖維結締組織增生，甚至肺泡壁斷裂，最終使患牛在臨床上表現(xiàn)出現(xiàn)高熱、呼吸急促、喘息、咳嗽、分泌漿液性分泌物等癥狀。

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Isolation and Identification of Mycoplasma bovis and Its Histopathological Observation in a Beef Cattle Farm of Ningxia

GUO Ya-nan,CAO Si-ting,HE Sheng-hu,WANG Shuang,ZHANG Xin,SUN Peng

(CollegeofAgriculture,NingxiaUniversity,Yinchuan,Ningxia,750021,China)

For isolation and identification ofMycoplasmabovisand analysis of target organ damage in a beef cattle farm of Ningxia,this study used Thiaucourt's liquid filter medium and solid medium to isolate pathogens,designed universal 16 S rRNA primers and uvrC specific primers ofMycoplasmabovisto amplifiy and sequence the gene,used DNA Star software to compare the sequence of the isolated strain and the standard strains in GenBank,and MEGA6.0 software Neighbor-joining method to construct and analyze phylogenetic tree of isolates based on 16 S rRNA and uvrC sequences,and used paraffin section technology and hematoxylin-eosin staining for histopathological observation.The results showed that the bacterial colony looks like "fried egg",16 S rRNA and uvrC amplified fragments were consistent with the positive control,phylogenetic trees constructed based on 16 S rRNA and uvrC gene sequences were in the same branch withMycoplasmabovis;lung tissue structure disappeared,part of alveolar consolidation and collapse,focal pulmonary hemorrhage,alveolar infiltration with inflammatory cells;thickening of alveolar septa,shedding of a small amount of alveolar epithelial cells;alveolar wall fracture,alveolar inflammatory exudate,fibrous connective tissue proliferation.

Mycoplasmabovis; isolation; identification; histopathology

2016-07-20

寧夏科技攻關重點專項項目(312-0164)

郭亞男(1991- )，男，河南南陽人，碩士研究生，主要從事獸醫(yī)臨床診斷基礎研究。*通訊作者

S852.35;S858.23

A

1007-5038(2017)03-0038-06