沈巍巍，陳 果，何秀苗,*,韋 平*

(1.廣西民族大學(xué)海洋與生物技術(shù)學(xué)院/廣西高校微生物與植物資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530006；2.廣西大學(xué)養(yǎng)禽與禽病研究所，廣西南寧 530005)

廣西梧州地區(qū)近十年傳染性法氏囊病病毒vVP2變化特征分析

沈巍巍1，陳 果2，何秀苗1,2*,韋 平2*

(1.廣西民族大學(xué)海洋與生物技術(shù)學(xué)院/廣西高校微生物與植物資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530006；2.廣西大學(xué)養(yǎng)禽與禽病研究所，廣西南寧 530005)

為了解近10年來(lái)廣西梧州地區(qū)雞傳染性法氏囊病病毒(IBDV)分子進(jìn)化情況，對(duì)2013年—2014年間來(lái)自該地區(qū)傳染性法氏囊病(Infectious bursal disease，IBD)的法氏囊樣品進(jìn)行IBDV的分離鑒定，并對(duì)分離株以及課題組2006年—2013年間分離的毒株,共24株的VP2高變區(qū)(vVP2)進(jìn)行序列分析和遺傳進(jìn)化分析。結(jié)果表明，QX0601等23個(gè)分離株在關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)上具有256I、284A、294I等超強(qiáng)毒株(vvIBDV)的分子特征，遺傳進(jìn)化分析表明，這23株分離株與UK661、HK46等超強(qiáng)毒參考株同處一個(gè)分支中，親緣關(guān)系較近；QX110603在關(guān)鍵性氨基酸位點(diǎn)上則具有256V、284T、294L等弱毒株的特征，遺傳進(jìn)化分析顯示，其與BJ836等致弱株處于同一分支，親緣關(guān)系較近。對(duì)所有分離株進(jìn)行氨基酸位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)，該地區(qū)IBDV進(jìn)化出現(xiàn)了新的特點(diǎn)，212D-212N符合國(guó)內(nèi)近年來(lái)的分離株的變化趨勢(shì)，209T-209A、338R-338H、359T-359R則表現(xiàn)出地域特點(diǎn)，未曾見過(guò)相似報(bào)道。研究結(jié)果表明，具有vvIBDV分子特征的分離株是該地區(qū)近10年來(lái)主要流行毒株，該地區(qū)IBDV毒株在vVP2序列上仍處于不斷進(jìn)化中，且?guī)в械赜蛱攸c(diǎn)。

傳染性法氏囊病病毒；vVP2；序列分析；遺傳進(jìn)化分析

雞傳染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus，IBDV)屬雙RNA病毒科，基因組包括A、B兩個(gè)雙鏈RNA片段，A節(jié)段有2個(gè)開放閱讀框(open reading frame，ORF)，編碼VP5、VP2、VP4和VP3 4種蛋白；B片段僅有1個(gè)ORF，編碼VP1蛋白，該蛋白被證實(shí)具有RNA聚合酶活性[1]。IBDV可攻擊雛雞的免疫器官法氏囊，引起免疫抑制，導(dǎo)致雞傳染性法氏囊病(Infectious bursal disease，IBD)[2-3]，并使雞群對(duì)其他疫病易感性增加。研究證實(shí)，IBDV抗原和毒力的改變主要與A節(jié)段VP2高變區(qū)( vVP2)的氨基酸殘基突變有關(guān)，超強(qiáng)毒株(vvIBDV)的vVP2 關(guān)鍵性氨基酸位點(diǎn)具有222A、256I、279D、284A、294I和299S的特征，而弱毒株則具有222P、256V、279N、284T、294L和299N的特征[4-5]。因此， vVP2已經(jīng)被廣泛用于對(duì)IBDV流行毒株的分子流行病學(xué)研究。

梧州地區(qū)是廣西進(jìn)出廣東省的重要樞紐，養(yǎng)禽業(yè)發(fā)達(dá)，擁有古典三黃雞等著名品種，因此，對(duì)該地區(qū)近10年來(lái)的IBDV分離株進(jìn)行分析，了解該地區(qū)IBDV的演化情況，將為該地區(qū)IBD的有效防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料和分離株 IBD疑似法氏囊病料，均來(lái)源于梧州地區(qū)，其中2013年—2014年間病料所分離毒株為新分離毒株，均以QX14-開頭命名，其余毒株為本實(shí)驗(yàn)室分離保存，分離株的背景如表1所示。

1.1.2 雞胚 用于分離病毒的SPF雞胚，購(gòu)自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.1.3 試劑 RNA抽提試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、2×Taqmix等，康維公司產(chǎn)品；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.1.4 vVP2擴(kuò)增所用引物 參照韋平等[6]所用序列，引物IBDVs 5′-CCCAGAGTCTACACCATA-3′和IBDVa 5′-TCCT CTTGCCACTCTTTC-3′，預(yù)期擴(kuò)增片段474 bp，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1 分離株的背景

1.2 方法

1.2.1 IBDV在雞胚的增殖 取處理過(guò)的病料，以雞胚絨毛尿囊膜途徑接種9日齡SPF雞胚，每枚雞胚接種0.2 mL，棄去24 h內(nèi)的死胚。收集24 h～120 h內(nèi)死亡的雞胚，研磨，反復(fù)凍融3次后離心取上清備用。

1.2.2 IBDV vVP2的擴(kuò)增 vVP2的擴(kuò)增按本課題組建立的方法進(jìn)行[7-9]，以IBDVa和IBDVs為引物按如下程序進(jìn)行擴(kuò)增：94℃ 4 min；94℃ 45 s,52℃ 45 s,72℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。

1.2.3 測(cè)序及序列同源性分析 將電泳鑒定為陽(yáng)性的PCR產(chǎn)物純化后送華大基因公司測(cè)序，用 DNA Star 進(jìn)行序列同源性分析，用MEGA5.0繪制遺傳進(jìn)化樹。參考毒株為：經(jīng)典毒株002-73(法國(guó)AJ/878908)、STC(加拿大/D00499.1)、CJ 801(中國(guó)/AF416621)、Edgar(美國(guó)/A33255)、F52/70(中國(guó)/D00869)、CU-1wt(法國(guó)/AF362747)；變異株：Variant-E(美國(guó)/AF133904)、Bx(中國(guó)/AF413170)、GLS(美國(guó)/AY368653)、K310(韓國(guó)/AF165149)；弱毒株：BJ836(中國(guó)/AF413069)、CU-1M(法國(guó)/AF362771)、D78(美國(guó)/AF4999)、Gt(中國(guó)/DQ403248)、TL2004(中國(guó)/DQ088175)；疫苗株：B87(中國(guó)/DQ906921.1)、FW2512(中國(guó)/DQ656499)、Bursin-2(中國(guó)/DQ656517)；超強(qiáng)毒株：UK661(英國(guó)/X92760)、OKYM(日本/D49706)、HK46(中國(guó)/AF092943)、FJ-h(中國(guó)/EU328326)、Gx(中國(guó)/AY444873)、HLJ0504(中國(guó)/AF321056)、Harbin-1(中國(guó)/AF454945)；血清Ⅱ型毒株OH(加拿大/U30818)。

2 結(jié) 果

2.1 病毒分離與鑒定結(jié)果

分離物上清經(jīng)RT-PCR鑒定，從11個(gè)法氏囊樣品總RNA中均擴(kuò)增出了474 bp的IBDV特異性目的條帶(圖1)。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1.陰性對(duì)照；2.QX1401；3.QX1402；4.QX1403；5.QX1404；6.QX1405；7.QX1406；8.QX1407；9.QX1408；10.QX1409；11.QX1410；12.QX1411

M.DNA Marker DL 2 000;1.Negative control；2.QX1401；3.QX1402；4.QX1403；5.QX1404；6.QX1405；7.QX1406；8.QX1407；9.QX1408；10.QX1409；11.QX1410；12.QX1411

圖1 分離毒株的 RT-PCR 鑒定結(jié)果

Fig.1 Identification results of IBDV by RT-PCR

2.2 基于vVP2的序列同源性分析

24個(gè)分離株之間的核苷酸序列同源性為89.9%～100%，氨基酸序列同源性為89.2%～100%；這些分離株與血清Ⅱ型毒株OH的核苷酸序列同源性僅為71.9%～75.1%，氨基酸序列同源性也僅為67.1%～70.9%，與經(jīng)典毒力株002-73和STC等、變異株GLS等的核苷酸序列同源性為84.8%～96.2%，氨基酸序列同源性為86.1%～96.8%；QX0601等23個(gè)分離株與致弱毒株BJ836等的核苷酸序列同源性為88.0%～92.2%，氨基酸序列同源性為89.0%～92.4%，而QX110603與致弱毒株BJ836等的核苷酸序列同源性則高達(dá)98.1%～99.8%，氨基酸序列同源性可達(dá)到96.8%～99.4%；QX0601等23個(gè)分離株與常用疫苗株B87、FW2512、Bursin-2的核苷酸序列同源性僅為89.0%～92.2%，氨基酸序列同源性也僅為89.2%～92.4%；QX110603與常用疫苗株B87、FW2512、Bursin-2的核苷酸序列同源性為94.1%～94.7%，氨基酸序列同源性為93.0%～93.7%。QX0601等23個(gè)分離株與UK661、HK46等國(guó)內(nèi)外超強(qiáng)毒株的核苷酸序列同源性為94.7%～98.1%，氨基酸序列同源性為94.9%～100%；而QX110603與國(guó)內(nèi)外超強(qiáng)毒株等的核苷酸和氨基酸序列同源性均僅為93.0%～93.7%。

2.3 基于vVP2的特征性氨基酸位點(diǎn)分析

所有分離株和部分參考株的關(guān)鍵位點(diǎn)氨基酸如表2所示，24個(gè)分離株的249位和254位的氨基酸分別為Q和G，而非K和S，其抗原型未發(fā)生變異。QX0601等23個(gè)分離株的七肽區(qū)保持SWSASGS不變，和222A、256I、284A、294I、299S等符合vvIBDV基本特征，在279位點(diǎn)上，以2014年為分界點(diǎn)，2014年以前的分離株中表現(xiàn)為D，而2014年后則表現(xiàn)為N；QX110603特征性氨基酸位點(diǎn)表現(xiàn)256V、279N、284T、294L、299N、330R符合致弱毒株特征；結(jié)果與序列同源性分析結(jié)果一致。在其他位點(diǎn)上，212氨基酸位點(diǎn)變化特征符合近年來(lái)分離的vvIBDV由212D-212N的演變趨勢(shì)，由2006年、2007年的D轉(zhuǎn)變?yōu)?011年以后的N；209位氨基酸位點(diǎn)在2011年以前的分離株中主要表現(xiàn)為T，僅有2006年的2個(gè)毒株表現(xiàn)為A，而2014年的分離株則表現(xiàn)為A；338氨基酸位點(diǎn)在2007年以前的分離株表現(xiàn)為R，而在2011年以后的分離株則表現(xiàn)為H；359氨基酸位點(diǎn)在2011年以前的分離株中主要表現(xiàn)為T，而2014年的分離株則表現(xiàn)為R，也出現(xiàn)了359T-359R的進(jìn)化趨勢(shì)。

表2 24個(gè)分離株與vvIBDV和弱毒株vVP2特征氨基酸位點(diǎn)的比較

2.4 基于vVP2的遺傳進(jìn)化分析

根據(jù)24個(gè)分離株和參考株的vVP2片段繪制其遺傳系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖2)，血清Ⅱ型毒株OH單獨(dú)屬于一個(gè)大分支，分離株、參考株與血清Ⅰ型毒株同處另一個(gè)大分支，并被進(jìn)一步分為vvIBDV分支和致弱毒株分支。24個(gè)分離株中，QX110603與Gt、BJ836等致弱毒株同屬于一個(gè)分支，親緣關(guān)系比較接近，其余分離株均與參考株中的vvIBDV屬一個(gè)分支，并被進(jìn)一步分成兩個(gè)小分支：2014年的新分離株QX1401等單獨(dú)屬于一個(gè)小分支，2011年的分離株QX110609、QX110605、QX110602和QX110604單獨(dú)屬于一個(gè)小分支，而2011年的另外2個(gè)分離株QX110601和QX110606同處一個(gè)小分支中，這3個(gè)小分支分離株與HLJ0504親緣關(guān)系最近；分離株QX0602和WZ0709等2006年和2007年分離株則與HK46、UK661、OKYM等參考株同屬于一個(gè)分支。

▲為分離株

▲ isolated strain

圖2 分離株與參考株基于IBDV-vVP2繪制的系統(tǒng)進(jìn)化樹

Fig.2 Phylogenetic tree based on the vVP2 fragment of IBDV

3 討論

通過(guò)vVP2的序列分析發(fā)現(xiàn)，2006年—2014年間，來(lái)自于廣西梧州地區(qū)的24個(gè)IBDV分離株中以具有vvIBDV分子特征的毒株為主(23/24)。根據(jù)遺傳進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)不同年代的毒株具有聚類的趨勢(shì)，分屬不同的分支。這些分離株在vVP2上發(fā)生了關(guān)鍵性氨基酸位點(diǎn)以外的位點(diǎn)突變，而這種突變也具有年代特點(diǎn)，如209位氨基酸位點(diǎn)在2011年以前的分離株中主要表現(xiàn)為T，僅有2006年的2個(gè)毒株表現(xiàn)為A，而在2014年的分離株則表現(xiàn)為A，338氨基酸位點(diǎn)在2007年以前的分離株表現(xiàn)為R，而在2011年以后的分離株則表現(xiàn)為H等，表明該地區(qū)的IBDV流行毒株仍處于在不斷變化中。王帥濤等[10]和梅永杰等[11]對(duì)華東等地區(qū)IBDV的研究結(jié)果也證實(shí)了IBDV仍處于進(jìn)化過(guò)程中。

2006年—2014年間的廣西梧州分離株中有23個(gè)分離株具有vvIBDV的分子特征，其中QX1402等2011年以后的17個(gè)分離株與HLJ0504親緣關(guān)系較近，HLJ0504為分離自我國(guó)黑龍江某雞場(chǎng)的超強(qiáng)毒株；而2006年和2007年間的6個(gè)毒株則與早期的vvIBDV參考株UK661、OKYM等親緣關(guān)系較近，2011年以后的分離株似乎越來(lái)越具有我國(guó)分離株的特征。這些流行毒株又表現(xiàn)出新的特征，其279位氨基酸位點(diǎn)出現(xiàn)了279D向279N的變化，該位點(diǎn)位于小親水區(qū)(mh)且被普遍認(rèn)為與毒株毒力及細(xì)胞適應(yīng)性有關(guān)，但該位點(diǎn)多與253、284等位點(diǎn)聯(lián)合作用，單獨(dú)位點(diǎn)的改變是否影響毒株特性仍需后續(xù)研究方可確定[12-13]；212D-212N比較普遍，而212D-212N的演變是近年來(lái)vvIBDV的一個(gè)新的演變趨勢(shì)[14-17]，根據(jù)本研究獲得的數(shù)據(jù)，結(jié)合其他課題組的研究結(jié)果，我們推測(cè)，IBDV分離株已經(jīng)由早期的國(guó)外流入，在我國(guó)特有的養(yǎng)殖環(huán)境下逐漸進(jìn)化，形成我國(guó)特有的IBDV分子特征，這一推斷有待于對(duì)更多的分離株進(jìn)行分析證實(shí)。

VP2蛋白是IBDV的主要保護(hù)性抗原，在IBDV抗原性和致病性中的作用至關(guān)重要。VP2蛋白除了兩個(gè)親水區(qū)和七肽區(qū)這3個(gè)重要功能區(qū)外，其他區(qū)域的氨基酸對(duì)于維持VP2蛋白在IBDV抗原性和致病性中的作用也必不可少。研究發(fā)現(xiàn)，來(lái)自廣西梧州地區(qū)的分離株在VP2氨基酸序列上發(fā)生了一些特殊的變化，如209位的A、T交替現(xiàn)象，212D到212N的變化，279D向279N的變化，338R-338H的變化，359T到359R的進(jìn)化等，課題組對(duì)我國(guó)華南地區(qū)的分離株進(jìn)行分析也發(fā)現(xiàn)了部分類似的現(xiàn)象[12]，高立等[17]推測(cè)D212N突變可能導(dǎo)致HLJ-0504毒株的VP2蛋白抗原性出現(xiàn)漂移，繼而導(dǎo)致毒株母源抗體保護(hù)。分析本研究獲得的分離株，我們也發(fā)現(xiàn)，這24個(gè)分離株均來(lái)源于免疫雞群，且與B87等常用疫苗株的序列同源性較低，此外，在課題組的另外一個(gè)研究中[18]，不同vVP2和VP1特征的分離株，其致病性不同，所以，我們推測(cè)，VP2蛋白中這些氨基酸位點(diǎn)的變化，很可能是引起病毒毒力及其抗原性改變的重要因素，但具體的影響如何，有待于進(jìn)一步的研究，分離株的這些突變也表明，該地區(qū)的IBDV仍處于不斷進(jìn)化中。

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Molecular Characteristics Analysis of vVP2 Gene of IBDV in Guangxi Wuzhou during Past Ten Years

SHEN Wei-wei1,CHEN Guo2,HE Xiu-miao1,2,WEI Ping2

(1.SchoolofMarineSciencesandBiotechnology/GuangxiKeyLaboratoryofUtilizationofMicrobialandBotanicalResources,GuangxiUniversityforNationalities,Nanning,Guangxi,530006,China;2.InstituteforPoultryScienceandHealth,GuangxiUniversity,Nanning,Guangxi,530005,China)

In order to study genetic variations of infectious bursal disease viruses (IBDV) in Wuzhou,Guangxi province during the past ten years,the sequence analysis and phylogenetic analysis based on VP2 hypervariable region (vVP2) of the field IBDV isolates (totally 24),which were isolated from IBD susceptible bursa between 2006-2014 in this region (the 11 isoaltes named as QX14- were newly isolated in this study) were performed.The sequence analysis indicated that the 23 isolates were characterized as very virulent IBDV (vvIBDV) according to critical amino acid sites which showed 256I,284A,294I.Phylogenetic analysis showed that these isolates were grouped with vvIBDV reference strains. Isolate QX110603 had typical amino acid sites as attenuated strains with 256V,284T, 294L.In the phylogenetic analysis,QX110603 was grouped with attenuated reference strains. Most of these isolates showed unique amino acid mutation in D212N, which was a common mutation trend in recent years.In addition,there were also some other amino acid sites such as T209A, R338H,T359R, which showed regional characteristics.The study suggests that IBDV with very virulent characters is the main strain prevalent in Wuzhou,Guangxi province,the genome of the isolates is still constantly evolved and showed specific regional characters.

Infectious bursal disease viruses;vVP2;sequence analysis;phylogenetic analysis

2016-07-29

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31560706，31660717)；廣西自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2014GXNSFDA118018)；2014廣西民族大學(xué)相思湖青年學(xué)者創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目

沈巍巍(1991- )，女，河南南陽(yáng)人，碩士研究生，主要從事分子病毒學(xué)研究。*通訊作者

S852.659.4

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1007-5038(2017)03-0032-06