何亞鵬，張 琪，史懷平，付明哲*，許信剛*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院，陜西楊凌 712100)

綿羊痘病毒、山羊痘病毒及羊口瘡病毒多重PCR檢測方法的建立和應(yīng)用

何亞鵬1，張 琪1，史懷平2，付明哲1*，許信剛1*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院，陜西楊凌 712100)

為了建立鑒別綿羊痘病毒(SPPV)、山羊痘病毒(GTPV)和羊口瘡病毒(ORFV)的多重PCR檢測方法，針對GenBank中3種病毒的基因組序列，合成了3對引物，通過優(yōu)化多重PCR反應(yīng)條件，建立了鑒別檢測3種病毒的多重PCR方法。特異性試驗表明，應(yīng)用該方法可分別擴增出3種病毒對應(yīng)的目的片段，對大腸埃希菌、沙門菌、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)、豬細(xì)小病毒(PPV)、Vero細(xì)胞、正常羊組織的DNA和滅菌雙蒸水均無擴增；敏感性試驗表明，該方法最低檢測量分別為30.46 pg/μL的綿羊痘病毒、28.9 pg/μL的山羊痘病毒和26.94 pg/μL的羊口瘡病毒基因組DNA；應(yīng)用本方法對85份臨床病料進(jìn)行檢測，結(jié)果與其他已建立的單項PCR檢測方法結(jié)果一致，說明該方法可以用于臨床上SPPV、GTPV和ORFV的鑒別診斷。

多重PCR；綿羊痘病毒；山羊痘病毒；羊口瘡病毒；檢測

綿羊痘病毒(Sheeppox virus，SPPV)和山羊痘病毒( Goatpox virus，GTPV)屬于痘病毒科脊椎動物痘病毒亞科羊痘病毒屬，可引起羊發(fā)熱、消瘦、皮膚或黏膜發(fā)生痘疹，嚴(yán)重時導(dǎo)致死亡[1]。羊痘被世界動物衛(wèi)生組織(OIE)列為必須通報的動物疫病，我國將其列為一類動物疫病[2]。羊口瘡病毒(Orf virus，ORFV)屬于脊椎動物痘病毒亞科副痘病毒屬，可破壞綿羊、山羊的上皮完整性，在口唇、舌、鼻、乳房等部位形成丘疹、水皰、膿皰和痂皮[3]。這3種病毒在養(yǎng)羊國家廣泛流行，造成嚴(yán)重危害。臨床上既有單一的SPPV、GTPV、ORFV感染，也有SPPV和ORFV或者GTPV和ORFV雙重感染，有研究發(fā)現(xiàn)，SPPV和GTPV的一些毒株可以同時感染綿羊和山羊[4-5]。這3種病毒還可感染人類，導(dǎo)致皮膚病變，威脅公共衛(wèi)生安全。這3種病毒同屬痘病毒科脊椎動物痘病毒亞科，3種病毒感染的臨床癥狀和發(fā)病機理相似，并且正痘病毒屬的山羊痘病毒、綿羊痘病毒和副痘病毒屬的羊口瘡病毒均存在血清交叉反應(yīng)，所以采用傳統(tǒng)臨床診斷或血清學(xué)方法診斷難度較大[6-7]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，PCR技術(shù)越來越多地應(yīng)用于羊病的鑒別診斷[8-10]，但是單項PCR不能一次鑒別混合感染的情況。因此，本試驗建立一種可以同時檢測和鑒別SPPV、GTPV和ORFV的多重PCR方法，為綿羊痘、山羊痘和羊口瘡的快速確診和及時防控提供有效措施。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒和細(xì)胞株 羊口瘡病毒弱毒疫苗株，購自山東泰豐生物有限公司；山羊痘病毒弱毒疫苗(AV41)，購自山東綠都公司；綿羊痘病毒(SPPV shaanxi株)、大腸埃希菌、沙門菌、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2 shaanxi株)、豬細(xì)小病毒(PPV shaanxi株)、Vero細(xì)胞，由西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院獸醫(yī)微生物實驗室保存。

1.1.2 待檢病料 85份病料采自陜西、甘肅、寧夏等不同地區(qū)羊場的疑似SPPV、GTPV和ORFV感染病羊的患部皮膚痂皮、口腔黏膜和淋巴結(jié)等。

1.1.3 主要試劑 DNA聚合酶混合物PremixTaqVersion 2.0、DNA Marker DL1 000，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；血液/組織/細(xì)胞基因組提取試劑盒，北京天根生化科技公司產(chǎn)品；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank中登錄的3種病毒的序列，參考國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)[10-12]，應(yīng)用引物設(shè)計軟件Primer Premier 5.0設(shè)計3對引物，用于擴增SPPV、GTPV、ORFV基因序列的相對保守區(qū)(表1)。引物由Invitrogen公司合成，稀釋至20 μmol/L備用。

表1 引物信息

1.2.2 病毒DNA的提取 取樣品200 μL，根據(jù)血液/組織/細(xì)胞基因組提取試劑盒試驗步驟，提取疫苗弱毒和病料中全基因組DNA備用。

1.2.3 單項PCR檢測方法的建立 分別以SPPV、GTPV、ORFV的DNA為模板，進(jìn)行單項PCR擴增。反應(yīng)體系為25 μL：PremixTaqVersion 2.0 DNA聚合酶混合物12.5 μL，上、下游引物(20 μmol/L)各0.5 μL，DNA模板 1.5 μL，滅菌雙蒸水10 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 35 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，32個循環(huán)；然后72 ℃再延伸8 min。為確定單項PCR最佳退火溫度，將退火溫度設(shè)定為49、51、53、55、57 ℃ 5個梯度進(jìn)行單重PCR反應(yīng)，電泳，觀察結(jié)果。

1.2.4 多重PCR擴增條件的優(yōu)化 多重PCR的擴增和退火溫度與各引物濃度關(guān)系較大，因此將提取的SPPV、GTPV、ORFV的DNA測定濃度后均稀釋為50 ng/μL，等量混勻作為模板。對多重PCR中的退火溫度(49、51、53、55、57 ℃)、SPPV、GTPV、ORFV各引物對終濃度(μmol/L)組合(0.5、0.5、0.5；1.0、0.5、0.5；0.5、1.0、0.5；0.5、0.5、1.0；1.0、1.0、1.0)等反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，以確定多重PCR擴增最佳條件。

1.2.5 多重PCR特異性試驗 采用優(yōu)化后的PCR體系及程序，分別以SPPV、GTPV、ORFV以及3種病毒混合物的DNA為模板，同時以大腸埃希菌、沙門菌、PCV2、PPV、Vero細(xì)胞、正常羊組織的DNA和滅菌雙蒸水作為模板，進(jìn)行多重PCR反應(yīng)。

1.2.6 多重PCR敏感性試驗 測得提取的3種病毒的DNA含量分別為95.2(SPPV)、90.3(GTPV)、84.2(ORFV) ng/μL，進(jìn)行51倍～56倍稀釋，將稀釋倍數(shù)相同的DNA等比例混合后作為PCR的模板，進(jìn)行多重PCR，以檢測其敏感性。

1.2.7 臨床樣品檢測 取臨床混合病料組織樣品研磨液約200 μL，根據(jù)DNA提取試劑盒說明書，提取DNA，采用本試驗的多重PCR方法，檢測樣品中是否有這3種病毒DNA，同時用已經(jīng)創(chuàng)建的PCR方法進(jìn)行檢測這些樣品[10-12]，并對結(jié)果進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

2.1 單項PCR擴增結(jié)果及退火溫度的選擇

單項PCR反應(yīng)后電泳可觀察到177(SPPV)、413(GTPV)、507(ORFV) bp的特異條帶，大小與預(yù)期一致。采用5個不同的退火溫度進(jìn)行單項PCR反應(yīng)，條帶之間差異不明顯，應(yīng)用5個不同的退火溫度均可較好的擴增(圖1)。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 1 000;1～5.SPPV；6～10.GTPV；11～15.ORFV退火溫度分別為49、51、53、55、57 ℃

M.DNA Marker DL 1 000;1-5.SPPV；6-10.GTPV；11-15.ORFV annealing temperatures were 49,51,53,55 and 57 ℃,respectively

圖1 單項PCR擴增及退火溫度優(yōu)化

Fig.1 Optimization for annealing temperature of single PCR

2.2 多重PCR引物的優(yōu)化結(jié)果

取不同濃度的引物組合進(jìn)行試驗，以篩選最佳的引物濃度。結(jié)果表明，SPPV、GTPV、ORFV引物終濃度分別為1.0、0.5、0.5 μmol/L時多重PCR擴增效果最好(圖2)。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 1 000;1～5.SPPV、GTPV、ORFV引物對終濃度分別為0.5、0.5、0.5 μmol/L；1.0、0.5、0.5 μmol/L；0.5、1.0、0.5 μmol/L；0.5、0.5、1.0 μmol/L；1.0、1.0、1.0 μmol/L

M.DNA Marker DL 1 000;1-5.Primer concentrations(μmol/L)for SPPV,GTPV and ORFV were 0.5,0.5,0.5 μmol/L；1.0,0.5,0.5 μmol/L；0.5,1.0,0.5 μmol/L；0.5,0.5,1.0 μmol/L；1.0,1.0,1.0 μmol/L,respectively

圖2 多重PCR引物濃度優(yōu)化結(jié)果

Fig.2 The primer concentration optimization results of multiplex PCR

2.3 多重PCR退火溫度優(yōu)化結(jié)果

選取不同的退火溫度(49℃～57℃)進(jìn)行多重PCR反應(yīng)，電泳結(jié)果見圖3，多重PCR在53℃時擴增出的3個條帶相對更清晰，更亮，所以確定退火溫度為53℃(圖3)。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 1 000;1～5.退火溫度分別為49、51、53、55、57 ℃

M.DNA Marker DL 1 000;1-5.Annealing temperatures were 49,51,53,55 and 57℃ respectively

圖3 多重PCR退火溫度優(yōu)化結(jié)果

Fig.3 The annealing temperature optimization results of multiplex PCR

2.4 特異性擴增結(jié)果

選用優(yōu)化后的多重PCR擴增條件(PCR體系內(nèi)加入SPPV、GTPV、ORFV的3對引物混合物)，分別以SPPV、GTPV、ORFV 3種病毒及其混合物、大腸埃希菌、沙門菌、PCV2、PPV、Vero細(xì)胞、正常羊組織的DNA和ddH2O為模板，進(jìn)行多重PCR反應(yīng)。結(jié)果表明，SPPV、GTPV、ORFV及其混合物均可擴出特異的目的片段，而其他樣品均未擴增出條帶，表明該檢測方法特異性好(圖4)。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 1 000;1～11.多重PCR模板分別為SPPV、GTPV、ORFV、SPPV+GTPV+ORFV、大腸埃希菌、沙門菌、PCV2、PPV、Vero細(xì)胞、正常羊組織的DNA和ddH2O

M.DNA Marker DL 1 000;1-11.The templates of multiplex PCR were SPPV,GTPV,ORFV,SPPV+GTPV+ORFV,Escherichiacoli,Salmonella,PCV2, PPV, Vero cell line,healthy goat and sheep tissue,and ddH2O

圖4 多重PCR特異性試驗

Fig.4 Specificity test of the multiplex PCR

2.5 敏感性試驗結(jié)果

采用優(yōu)化后的條件來擴增倍比稀釋的SPPV、GTPV和ORFV的DNA，測得多重PCR對SPPV、GTPV、ORFV的DNA的最低檢測量分別為30.46、28.90、26.94 pg/μL(圖5)。

2.6 臨床樣品檢測結(jié)果

用本試驗建立的多重PCR方法檢測了85份臨床病料。在85份病料中SPPV單純感染的有3份，GTPV單純感染的有5份，ORFV單純感染的有37份。SPPV與ORFV混合感染的有0份，GTPV與ORFV混合感染的有2份，同時感染3種病毒的0份。SPPV、GTPV與ORFV的陽性率分別為3.53%、8.24%和45.88%，GTPV和ORFV混合感染的陽性率為2.35%，和已經(jīng)創(chuàng)建的PCR方法的檢測結(jié)果一致。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 1 000;1～6.依次為51倍～56倍比稀釋3種病毒DNA混合物的擴增結(jié)果

M.DNA Marker DL 1 000;1-6.Different dilutions of template from 51～56

圖5 多重PCR敏感性試驗

Fig.5 Sensitivity test of the multiplex PCR

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 1 000;1～9.9個臨床樣品；10.ddH2O

M.DNA Marker DL 1 000;1-9.9 clinical samples；10.ddH2O

圖6 部分臨床樣品多重PCR擴增結(jié)果

Fig.6 Detection results of clinical samples by multiplex PCR

3 討論

綿羊痘、山羊痘和羊口瘡幾乎存在于所有的養(yǎng)羊國家，對我國養(yǎng)羊業(yè)也造成嚴(yán)重危害，華中、華南、西北等多地呈地方性流行，并向周圍蔓延。羊痘的發(fā)病率各個地方不同，病死率可達(dá)50%。有調(diào)查顯示，2000年—2009年中國除少數(shù)幾個省市沒有公開的疫情報道外，其他地區(qū)均有羊痘流行，而西北地區(qū)是羊痘疫情最嚴(yán)重的地區(qū)。羊痘在所有季節(jié)均可發(fā)病，春季和冬季天氣冷，尤為嚴(yán)重。羊痘在新疫區(qū)流行時更加猖獗，容易出然死亡，綿羊較山羊嚴(yán)重，羔羊、懷孕羊和老年羊更嚴(yán)重，因此應(yīng)盡量避免從疫區(qū)引種。羊痘病毒可抑制宿主的免疫機制，宿主發(fā)生羊痘時，抗病能力降低，容易繼發(fā)其他病原微生物的感染，導(dǎo)致混合感染，造成嚴(yán)重后果。臨床發(fā)現(xiàn)羊感染羊痘后更容易繼發(fā)羊口瘡病毒和支原體感染。近年來有報道指出羊痘感染養(yǎng)殖業(yè)從業(yè)人員，天花病毒、羊痘病毒和羊口瘡病毒同屬于脊椎動物痘病毒亞科，天花病毒是人類的巨大災(zāi)難，總計造成3億以上的人類死亡，因此必須重視羊痘和羊口瘡病毒對人的感染，警惕可能造成的危害[2,13]。羊口瘡在敏感的羊群的發(fā)病率可高達(dá)90%，ORFV有多種方式逃避機體的免疫反應(yīng)，并且可以合成抗炎癥反應(yīng)的物質(zhì)，抵抗機體免疫反應(yīng)對它的清除作用，因此可以反復(fù)多次感染同一宿主，并且免疫過的羊群也有可能感染，因此反復(fù)暴發(fā)給養(yǎng)羊業(yè)帶來了很大的損失[13-14]。現(xiàn)在已確定ORFV可以通過直接接觸而感染人。臨床診斷上，當(dāng)綿羊痘、山羊痘和羊口瘡發(fā)生時病羊出現(xiàn)明顯的典型病變才能初步診斷，而現(xiàn)在羊病的發(fā)生表現(xiàn)出復(fù)雜性，多呈隱性感染、混合感染和非典型癥狀，臨床診斷方法難以做出準(zhǔn)確快速判斷，無法及時應(yīng)對疫情。目前檢測SPPV和GTPV混合感染、GTPV和ORFV混合感染的PCR檢測方法較多，而能同時檢測同為脊椎動物痘病毒亞科的SPPV、GTPV、ORFV的PCR方法少[1,10]。綿羊痘、山羊痘和羊口瘡作為羊的3種重要疫病，一旦暴發(fā)，需要獲得及時、準(zhǔn)確的實驗室診斷。本研究建立的檢測方法，能在短時間內(nèi)對SPPV、GTPV、ORFV進(jìn)行準(zhǔn)確鑒別，優(yōu)于病毒分離和眾多單項PCR檢測方法。

多重PCR的擴增與退火溫度和各引物濃度關(guān)系較大，所以有必要優(yōu)化這些反應(yīng)條件，結(jié)果表明SPPV、GTPV、ORFV引物對終濃度分別為1.0、0.5、0.5 μmol/L，退火溫度為53 ℃時，多重PCR檢測效果最好；特異性結(jié)果表明，應(yīng)用此多重PCR方法可以成功擴增出177 bp(SPPV)、413 bp(GTPV)、507 bp(ORFV)的特異性片段，對大腸埃希菌、沙門菌、PCV2、PPV、Vero細(xì)胞、正常羊組織的DNA和滅菌雙蒸水均無擴增；敏感性試驗發(fā)現(xiàn)該方法對SPPV、GTPV和ORFV基因組DNA的最低檢測量分別為30.46、28.90、26.94 pg/μL，具有很高的靈敏性；采用建立的多重PCR方法檢測了85份臨床病料，單純感染SPPV的有3份，單純感染GTPV的有5份，單純感染ORFV的有37份，混合感染SPPV與ORFV的有0份，混合感染GTPV與ORFV的有2份，同時感染3種病毒的0份，SPPV、GTPV與ORFV的陽性率分別為3.53%、8.24%和45.88%，GTPV和ORFV混合感染的陽性率為2.35%，和其他已經(jīng)創(chuàng)建的PCR方法檢測的結(jié)果相同，本次對臨床羊病料的檢測結(jié)果表明，羊口瘡病毒感染占大多數(shù)，山羊痘和綿羊痘也值得注意防控，這與以往國內(nèi)報道的SPPV、GTPV、ORFV流行情況相符。本研究建立的多重PCR方法可以在快速檢測并鑒別SPPV、GTPV和ORFV，特異性好、敏感度高，為綿羊痘、山羊痘和羊口瘡的流行病學(xué)調(diào)查、快速確診和有效防控提供有效方法。目前，針對綿羊痘、山羊痘和羊口瘡應(yīng)研發(fā)安全高效的基因工程疫苗，及時快速地進(jìn)行診斷，積極應(yīng)對，才能有效控制這類疫病在我國長期造成危害。

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Establishment and Application of Multiplex PCR for Detecting Sheeppox Virus, Goatpox Virus and Orf Virus

HE Ya-peng1,ZHANG Qi1,SHI Huai-ping2,FU Ming-zhe1,XU Xin-gang1

(1.CollegeofVeterinaryMedicine,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi,712100,China; 2.CollegeofAnimalScienceandTechnology,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi,712100,China))

A multiplex polymerase chain reaction assay was developed for the detection of sheeppox virus,goatpox virus and orf virus.According to the genome sequence of SPPV,GTPV and ORFV in GenBank,three pairs of primers were synthetized.The multiplex PCR reaction condition was optimized,and the multiplex PCR for simultaneously detecting SPPV,GTPV and ORFV was established.The specificity test showed that target fragments were obtained from the genomic DNA of three virus respectively.Three fragments were amplified from the mixed DNA sample of SPPV, GTPV and ORFV simultaneously,and no amplification was obtained fromEscherichiacoli,Salmonella, PCV2,PPV,Vero cell line,healthy goat or sheep tissue, and ddH2O.The sensitivity test showed that the multiplex PCR could detect 30.46 pg/μL of SPPV DNA,28.9 pg/μL of GTPV DNA and 26.94 pg/μL of ORFV DNA.The results of multiplex PCR were consistent with the established PCR detection method in testing 85 clinical samples.These results indicated that multiplex PCR has values for detecting of SPPV,GTPV and ORFV in clinic.

multiplex PCR;Sheeppox virus;Goatpox virus;Orf virus;detection

2016-07-25

陜西省重點產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新鏈項目(2016KTZDNY02-06)；陜西省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新與攻關(guān)項目(2016NY-092)；西北農(nóng)林科技大學(xué)試驗示范站(基地)科技成果推廣項目(TGZX2015-32)；陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程計劃項目(2016KTZDNY02-05)

何亞鵬(1990-)，男，河南內(nèi)鄉(xiāng)人，碩士，主要從事分子病原學(xué)與免疫學(xué)研究。*通訊作者

S852.659.1

A

1007-5038(2017)03-0011-05