劉景雙 劉向群

肺炎克雷伯桿菌對碳青霉烯類的耐藥機制

劉景雙1劉向群2

肺炎克雷伯桿菌(Klebsiella pneumoniae ，KP)為一種無自主能動能力、有莢膜、兼性厭氧、乳糖發(fā)酵的革蘭陰性條件致病菌[1]，常常存在于人類的口腔、皮膚、腸道、尿道等部位[2]，可引起肺炎、尿路感染、腦脊膜炎、敗血癥、菌血癥、腹瀉等相關感染性疾病[3]。在抗生素不斷選擇、抗感染治療的時間延長及抗生素選擇的劑量及手術操作等多方面因素影響下，多重耐藥肺炎克雷伯桿菌逐漸增多[4]，特別是耐碳青霉烯類肺炎克雷伯桿菌(carbapenem resistant Klebsiella pneumoniae，CRKP) 的增多，給臨床醫(yī)生帶來的極大的挑戰(zhàn)。本文主要對CRKP的耐藥機制進行總結，以對臨床醫(yī)生抗生素的合理使用、促進疾病的愈合及減少耐藥菌株的擴散提供幫助。

CRKP的耐藥機制主要有以下幾個方面：產ESBLs、減少外膜的通透性、增加外排泵的外排作用[5]等。

ESBLs

ESBLs為β-內酰胺酶的集合，可水解青霉素、頭孢菌素、單菌胺類等抗生素[6]。ESBLs的產生具有地域特性，并且與高發(fā)病率及高死亡率相關。最初的ESBLs的定義是根據其水解能力，之后發(fā)展為目前Amber分類的A、B、C、D類[7]。A類以絲氨酸殘基為活性位點，包括KPC、CTX--M、SHV1、TEM1、ROB1等；B類為金屬酶，以金屬離子為活性位點，目前最受關注的為新德里β-內酰胺酶(NDM)；C類為頭孢菌素酶(Ampc)，同樣以絲氨酸殘基為活性位點；D類為青霉素酶(OXA)。原酶活性位點的突變會使其可水解的底物擴增，這些酶在抗生素選擇的壓力下通過質粒向外傳播，擴大其耐藥的范圍[7]。其中與CRKP相關的ESBLs主要為A類中的KPC酶、B類中的NDM及D類中的OXA[8]，他們可不被β-內酰胺酶抑制劑抑制，并可產生碳青霉烯酶活性。

一、產KPC酶

產KPC酶為KP對碳青霉烯類耐藥的最為常見的機制，在2001年，產KPC酶的KP菌株在卡萊羅納的北部被發(fā)現[5]，KPC酶分為KPC1-19共19種，其中最為常見的為KPC-2和KPC-3[9]，KPC酶為A類β-內酰胺酶，在KP、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、變形桿菌、檸檬酸桿菌及沙門菌中均有發(fā)現。編碼KPC的基因由質粒介導，且其側面由可移動的基因片段填充，這就使得其可由質粒轉移至染色體，同樣可由染色體轉移至質粒[10]。國外的相關報道KPC編碼基因位于Tn4401的Tn3型轉座子上，這類轉座子可使基因插入不同的G-性細菌的不同質粒，這與KPC酶的迅速擴散相關[3，11]。在國內的原始研究中顯示與國外不同，KPC-2基因位于Tn1721的Tn3型轉座子上，到目前為止尚未發(fā)現攜帶KPC基因的Tn4401菌株[12-15]。KPC酶可使細菌對所有的β內酰胺類抗生素均可耐藥，包括：青霉素類、頭孢類、單菌胺類及碳青霉烯類[16]，給臨床藥物的選擇帶來極大的困擾。因此有效的KPC檢測方法尚需進一步去探索，提高對KPC檢測的敏感性，減少KPC基因的擴散，可有效減少多重耐藥菌株的出現。

二、新德里β-內酰胺酶(NDM-1)

NDM-1為一種新的具有碳青霉烯酶活性的金屬β-內酰胺酶，2008年在KP中首次被發(fā)現[15]。NDM-1最先在KP及大腸桿菌中發(fā)現，blaNDM-1由質粒編碼，并可轉化結合到其他菌株，這可幫助其迅速在不同的菌種間播散，且blaNDM-1基因往往與其他耐藥決定因子相結合，這可大大增加其耐藥能力。在一些菌株中基因區(qū)域可以形成連續(xù)重復的復制，從而提高其復制的數量，促進其基因的擴散[17]。blaNDM-1基因在不同的質粒中被發(fā)現，包括IncA/C、IncF、IncL/M等，IncN質粒在臨床上同時編碼其他重要的耐藥基因，包括blaCTX-M、blaIMP、blaNDM、blaKPC[18]，這是各種酶類協(xié)同發(fā)揮耐藥作用的基因基礎，攜帶耐藥基因的質粒在不同細菌間傳播，造成耐藥的流行，NDM目前發(fā)現同樣與多種亞型，如NDM-3及NDM-5等，但目前尚缺乏對其有效的檢測方法，尚需我們進一步去探索。

三、OXA

OXA為一類具有碳青霉烯酶活性的苯唑西林酶，臨床上發(fā)現的OXA變種越來越多，并具有廣譜的水解活性。在CRKP中發(fā)現的有OXA-181、OXA-48、OXA-244、OXA-1等。有研究發(fā)現ISEcp1-OXA-181轉座子的3個復制片段在染色體從始至終均存在，其中一個片段可導致mgrB基因的失活(mgrB基因為phoPQ的負調控者)，而mgrB基因的失活會導致多粘菌素耐藥[19]。ISEcp1插入片段在blaCTX-M、blaCYM、blaACC中同樣有發(fā)現，這與blaOXA-181中的插入序列相似[20]，均可提高厄他培南、亞胺培南、美羅培南的MICs，產生耐藥性。2003年OXA-48首先在土耳其的臨床KP菌株中報道[21]，目前為止已在多種菌株中被發(fā)現。blaOXA-48基因廣泛擴散在腸桿菌科中定位在64kb的結合質粒上，屬于IncL/M中的一員。這種質粒的特點是具有高轉移率及廣闊的宿主。他們的高共軛性可能是由于失活的TIR基因編碼接合性質粒轉移抑制因子，通過插入復合轉座子Tn1991 / Tn1991、2 攜帶blaOXA-48-like基因[22],基因一旦形成，便可在不同的宿主間傳播，并可在抗生素不斷選擇的壓力下產生突變，從而產生不同的亞型。有研究顯示一些OXA的變種是由于其blaOXA-48基因編碼的一些氨基酸替換而導致酶的不同[23]。例如在西班牙發(fā)現的OXA-244與OXA-48的不同之處在于一個核苷酸的替換A640G，這就導致了一個氨基酸的替換Arg214Gly[23]。OXA-1在G-桿菌的質粒及整合體中被發(fā)現，且其與CTX-M-15結合可對β-內酰胺類與酶抑制劑的復合物產生耐藥[24]。

四、其他ESBLs

除了上述三種ESBLs外，在KP中尚有其他的ESBLs參與碳青霉烯類的耐藥，如CTX-M、TEM、SHV等[5]。CTX-M尤其在KP及大腸埃希菌中流行，多種遺傳機制為其提供了異型多樣性，也是其基因決定簇快速傳播的基礎。CTX-M型往往在院外播散，而在院內則由TEM、SHV所取代[7]，而他們各亞型之間往往僅有點突變的不同。如SHV-31與SHV-1氨基酸序列的不同是由兩個點突變造成的，分別為L35Q和E240K，SHV-31與SHV-12僅有一個點突變的不同。

外膜孔蛋白的突變

多個研究[6，19，24-25]中顯示在CRKP中均有外膜孔蛋白的突變，從而降低外膜對抗生素的滲透性。染色體編碼的外膜孔蛋白基因的突變備受關注，其中研究較為清楚的為Ompk35、Ompk36。Ompk36發(fā)生較大變化，其氨基酸序列的改變位于L3環(huán)上，L3環(huán)組成了孔蛋白的通道小孔，L3的改變與碳青霉烯類耐藥相關。另外，Ompk35插入IS序列導致Ompk35的失活[19]。有研究顯示OmpK35發(fā)生框移突變，這些突變包括一個堿基對的插入或是一個堿基對的刪除，亦或是一個氨基酸的替換，這導致基因區(qū)間的提前出現終止密碼子，從而使轉錄的肽鏈提前結束。Ompk36的突變修飾更是多變的，在Ompk36中插入的包含插入序列(IS)的兩條鏈破壞了開放閱讀框架區(qū)域，使終止密碼子提前出現，而使肽鏈的轉錄提前結束[26]。這與Sugumar M等的研究結果相似[24]。兩種孔蛋白各自對碳青霉烯耐藥的影響尚不明確，在KP中兩種孔道蛋白對產生碳青霉烯類耐藥均有作用[27]，單純Ompk35的丟失對耐藥影響較小，而Ompk36的丟失可以顯著增加產ESBL及AmpC細菌的青霉素及碳青霉烯類的MIC，兩者同時丟失則產生對大多數青霉素及碳青霉烯類的耐藥[23]。

外排泵的改變

增加外排泵對抗生素的外排作用是細菌對多數抗生素的共同耐藥機制，在KP中參與臨床相關抗藥性的外排泵大部分屬于抗藥小結分裂區(qū)(RND)家族，RND位于內膜區(qū)，并且有廣泛的底物范圍，外排泵的內膜結合蛋白決定了底物的特異性及廣泛性，可外排不同結構的抗菌藥物。當外排泵底物的抗生素作用于菌株時，可使外排泵基因表達增加，從而形成對此抗生素的耐藥。碳青霉烯類抗生素的使用不僅可造成細菌對其耐藥，同樣可造成細菌對其他藥物耐藥，如替吉環(huán)素、米諾環(huán)素等。在對CRKP的研究中發(fā)現，外排泵基因acrA、acrB、tolC、oqxA、oqxB表達增加，及外排泵調節(jié)因子acrR、marA、soxS、rarA、ramA表達增加。其中AcrAB-TolC系統(tǒng)及OqxAB系統(tǒng)發(fā)揮重要作用[28]，AcrAB有廣泛的底物范圍，包括喹諾酮類、氯霉素、大環(huán)內酯類、β內酰胺類等，他們與Tolc相結合可增強其外排作用[29]。有研究顯示[30-32]，AcrAB-TolC系統(tǒng)的表達增加，與acrR的突變有關，acrR為AcrAB的抑制性調節(jié)因子，acrR的突變導致其失活，從而使其對外排泵的抑制作用減弱而使其表達增加。值得慶幸的是由外排泵表達增加所致的細菌耐藥可由外排泵抑制劑所逆轉[33]，這為我們臨床研究相關藥物提供契機。

總 結

值得注意的是單一的β-內酰胺酶對碳青霉烯類的抵抗作用是非常微弱的，他們需與其他的酶類或其他耐藥機制聯(lián)合作用，如產KPC酶與膜蛋白的突變相結合或外膜孔蛋白的突變與外排泵外排增加相結合，各種機制相互作用從而形成菌株對多種抗生素的耐藥，使我們在有限的抗生素面前面臨著巨大的選擇壓力，了解細菌耐藥機制的變化情況，根據細菌耐藥機制的變化選擇針對性藥物及為研制新藥提供方向，是我們接下來努力的方向。另外新的耐藥機制的產生往往是在抗生素選擇壓力下細菌為生存所做出的改變，臨床合理選擇抗生素將有效減少細菌突變及減少超級耐藥菌的產生，這就要求我們除有豐富的臨床經驗外，較為敏感的耐藥菌檢測方法也是迫切需要的，目前各種實驗方法還處在探索階段，為限制多重耐藥菌的擴散，指導臨床合理應用抗生素，在新生抗生素研發(fā)出來前，對細菌耐藥機制更為敏感的實驗室檢測方法是非常有必要的，這也值得我們去更加深入的探索。

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10.3969/j.issn.1009-6663.2017.06.044

1. 221000 江蘇 徐州，徐州醫(yī)科大學 2. 221002 江蘇 徐州，徐州市第一人民醫(yī)院

劉向群，E-mail：hxlxq68@sina.com

2016-10-20]