于 波，朱 玉，袁 霖，黃麗麗，張佩霞，鄒春萍，孫映波

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境園藝研究所/農(nóng)業(yè)部華南都市農(nóng)業(yè)重點實驗室/廣東省園林花卉種質(zhì)創(chuàng)新綜合利用重點實驗室，廣東 廣州 510640；2.中華生物資源應(yīng)用協(xié)會，臺灣 宜蘭 26047；3.廣州市玉田山茶生物科技有限公司，廣東 廣州 510650）

金花茶〔Camellia chrysantha（hu）Tuyama〕，山茶科山茶屬金花茶組植物，花金黃色，為我國國寶級植物之一，被列為我國一級保護植物，主要分布于我國廣西和越南等地?！侗静菥V目》記載了金花茶藥用功能，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)金花茶具有抑制腫瘤以及降血壓、膽固醇等功效［1］。目前，金花茶產(chǎn)業(yè)化開發(fā)方興未艾。金花茶組織培養(yǎng)研究始于20世紀80年代，在體細胞胚和愈傷組織誘導(dǎo)方面取得了很多重要研究進展，由子葉、幼胚及莖段培養(yǎng)獲得了體細胞和愈傷組織［2-10］。近年來，人們研究了光源或培養(yǎng)基成分對金花茶愈傷組織中DFR（二氫黃酮醇4-還原酶）、LAR（無色花色素還原酶）與PPO（多酚氧化酶）表達及總兒茶素含量的影響［10］；同時，還建立了金花茶組織培養(yǎng)和植株快繁體系［11-12］，但仍然有待優(yōu)化完善。目前，轉(zhuǎn)基因技術(shù)已經(jīng)成為主要糧食、油料、蔬菜和花卉作物的重要育種方法。山茶屬植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)雖然已經(jīng)在茶樹（茶組植物）上獲得了突破［13-24］，但在包括金花茶在內(nèi)的茶花上還未見報道。在目前金花茶組培技術(shù)仍未完善成熟的情況下，利用金花茶愈傷組織進行轉(zhuǎn)基因的前期研究是一條可行的途徑。本研究利用金花茶幼嫩花蕾進行體外培養(yǎng)，建立了花絲愈傷組織培養(yǎng)體系，在此基礎(chǔ)上研究了卡那霉素和潮霉素對愈傷組織誘導(dǎo)和增殖培養(yǎng)的影響，為下一步開展金花茶轉(zhuǎn)基因研究提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試金花茶種植于廣東省農(nóng)科院環(huán)境園藝研究所山茶種質(zhì)資源圃。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體表面消毒 試驗于2015年1月開始進行，摘取剛剛金花茶露黃、但尚未開放的幼嫩花蕾，在超凈工作臺上用70%乙醇分別浸泡1、3、5、10、15 min，然后用滅菌水沖洗 3次，用刀片剝掉花瓣和萼片，取出雄蕊，將花絲和花藥分別接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，25（±1）℃，暗培養(yǎng)。誘導(dǎo)培養(yǎng)基成分為MS+TDZ（0.25、0.5、1.0、2.0 mg/L）+2，4-D 1.0 mg/L，附加蔗糖 30 g/L、瓊脂 5.0 g/L，pH 5.8，121℃高溫高壓滅菌20 min，冷卻至60℃時在超凈工作臺上分裝至無菌培養(yǎng)皿（直徑9 cm）中。8周后，觀察和統(tǒng)計不同消毒時間對金花茶花絲外植體污染和愈傷組織誘導(dǎo)等情況的影響，計算公式如下：

污染率（%）=（污染的外植體數(shù)÷接種的外植體總數(shù)）× 100

愈傷組織誘導(dǎo)率（%）=（誘導(dǎo)出愈傷組織的外植體數(shù)÷接種的未污染外植體總數(shù)）×100

1.2.2 愈傷組織增殖培養(yǎng) 用手術(shù)刀將金花茶花絲誘導(dǎo)獲得的愈傷組織切割破碎成直徑0.5 mm的組織塊，轉(zhuǎn)移至MS+TDZ 0.5 mg/L+2，4-D 1.0 mg/L+蔗糖30 g/L（pH 5.8）的培養(yǎng)基中進行增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為黑暗、25（±）1℃。培養(yǎng)基分裝在無菌培養(yǎng)皿（直徑9 cm）中，每皿分裝25 mL并放置5塊愈傷組織。培養(yǎng)4周后，觀察愈傷組織增殖情況。

1.2.3 愈傷組織誘導(dǎo)和增殖培養(yǎng)過程對抗生素敏感性測定 分別在愈傷組織誘導(dǎo)和增殖階段進行卡那霉素和潮霉素的敏感性試驗。在固體培養(yǎng)基MS+TDZ 0.5 mg/L+2，4-D 1.0 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂 8.0 g/L（pH 5.8）中加入不同濃度梯度的抗生素，具體設(shè)置為：卡那霉素0（CK）、25、50、75、100、125、150 mg/L，潮霉素 0（CK）、5、10、15、20、25、30、35、40 mg/L。將花絲外植體和愈傷組織塊接種到各種培養(yǎng)基上。愈傷組織誘導(dǎo)階段的試驗培養(yǎng)8周，記錄和統(tǒng)計各個試驗處理的外植體存活率和愈傷組織誘導(dǎo)率。愈傷組織增殖階段試驗培養(yǎng)4周，記錄和統(tǒng)計各個試驗處理的愈傷組織增殖率，計算外植體存活率和愈傷組織增殖率：

外植體存活率（%）=（存活的外植體數(shù)÷接種的外植體總數(shù)）× 100

愈傷組織增殖率（%）=（形成新愈傷組織數(shù)÷接種的愈傷組織總數(shù)）× 100

上述試驗每個處理3次重復(fù)，每個重復(fù)50個外植體或愈傷組織塊。

試驗數(shù)據(jù)方差分析使用SAS V8.0軟件，差異顯著性測驗采用鄧肯氏（1955）多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 金花茶外植體表面消毒和愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)

將花絲和花藥外植體分別接種至愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)8周后，統(tǒng)計花絲外植體在各個消毒處理中污染情況。結(jié)果表明，70%乙醇浸泡消毒1 min，外植體污染率最高、達58.7（±6.1）%；浸泡3 min時，污染率仍達35.3（±4.2）%；隨著70%乙醇浸泡時間的延長，污染率逐漸下降，當乙醇浸泡5 min時，污染率下降至14.0（±4.0）%；乙醇浸泡10 min和15 min時，污染率均為0。各處理間差異顯著。

兩種外植體暗培養(yǎng)8周過程中，花藥外植體表面全部褐化，沒有形成愈傷組織（圖1A，封二）。部分花絲外植體兩端傷口部位膨大形成突起，逐漸形成愈傷組織（圖1B，封二），這些愈傷組織呈乳白色至淺黃色、半透明狀。不同TDZ和2，4-D組合培養(yǎng)基上花絲誘導(dǎo)愈傷組織觀察結(jié)果表明，當培養(yǎng)基中2，4-D濃度固定在1.0 mg/L時，愈傷組織誘導(dǎo)率隨著TDZ濃度的變化而不同：當TDZ濃度為0.25 mg/L時，愈傷組織誘導(dǎo)率為72.7（±3.1）%；當TDZ濃度為0.5 mg/L時，愈傷組織誘導(dǎo)率最高達100%；隨著TDZ濃度的提高，愈傷組織誘導(dǎo)率逐漸下降，TDZ濃度為1.0 mg/L時誘導(dǎo)率為86.7（±4.2）%，TDZ濃度為2.0 mg/L時誘導(dǎo)率為62.0（±3.5）%。各處理間差異顯著。

2.2 金花茶愈傷組織增殖培養(yǎng)

將誘導(dǎo)獲得的愈傷組織切割破碎成直徑0.5 mm的組織塊，轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，黑暗條件下培養(yǎng)4周后，所有愈傷組織塊均明顯增殖。連續(xù)多次繼代培養(yǎng)后，愈傷組織顏色形態(tài)與初代愈傷組織保持基本相同，呈現(xiàn)乳黃色半透明狀（圖2，封二）。

2.3 金花茶愈傷組織誘導(dǎo)對卡那霉素和潮霉素的敏感性

卡那霉素和潮霉素對金花茶愈傷組織誘導(dǎo)階段的影響如圖3、圖4所示。在不添加任何抗生素的對照組，金花茶外植體存活率和愈傷組織誘導(dǎo)率均達100%。添加卡那霉素或潮霉素對金花茶外植體存活和愈傷組織誘導(dǎo)均有不同程度的影響，并且隨著抗生素濃度的提高其影響也越大。當卡那霉素濃度為25 mg/L或潮霉素濃度為5 mg/L時，外植體存活率分別為64.0%和79.3%，愈傷組織誘導(dǎo)率分別為55.3%和66.0%，隨著兩種抗生素濃度的提高，金花茶外植體存活率和愈傷組織誘導(dǎo)率明顯下降，當卡那霉素濃度達75 mg/L或潮霉素濃度達20 mg/L時，花絲外植體上不再形成愈傷組織，卡那霉素100 mg/L或潮霉素30 mg/L條件下花絲外植體全部死亡。

圖3 卡那霉素和潮霉素對金花茶外植體存活率的影響

圖4 卡那霉素和潮霉素對金花茶愈傷組織誘導(dǎo)率的影響

2.4 金花茶愈傷組織增殖培養(yǎng)對卡那霉素和潮霉素的敏感性

從圖5可以看出，在不添加任何抗生素的對照組，金花茶愈傷組織增殖率均達100%。當卡那霉素濃度為25 mg/L或潮霉素濃度為5 mg/L時，愈傷組織的增殖率分別為60.7%和68.7%。隨著兩種抗生素濃度的提高，愈傷組織增殖率明顯下降。當卡那霉素濃度為100 mg/L或潮霉素濃度為25 mg/L時，金花茶愈傷組織的增殖被完全抑制，最終全部褐化死亡。

圖5 卡那霉素和潮霉素對金花茶愈傷組織增殖率的影響

3 結(jié)論與討論

目前，在山茶屬植物愈傷組織誘導(dǎo)研究中多數(shù)采用葉片、莖段和莖尖等［25-28］，本研究采用幼嫩花蕾中的花絲為外植體，高頻率的誘導(dǎo)獲得了愈傷組織。包括茶花在內(nèi)的山茶屬植物組織培養(yǎng)以往通常采用酒精和升汞配合使用進行外植體表面消毒［25-28］，步驟較繁瑣，本研究采用金花茶剛剛露黃的幼嫩花蕾進行組培研究，取得較好的效果。由于此時花序尚未打開，花蕾由花瓣和萼片緊緊包裹，故表面消毒劑只采用70%乙醇。結(jié)果表明，70%乙醇浸泡10 min即可達到理想的消毒效果。本研究不僅簡化了表面消毒操作步驟，還避免了使用氯化汞等劇毒試劑可能帶來的風(fēng)險。

山茶屬轉(zhuǎn)基因研究報道主要集中于茶樹（茶組植物）［14-25］，茶花上還未見轉(zhuǎn)基因成功的報道。已有報道中，轉(zhuǎn)基因的選擇劑多數(shù)采用卡那霉素或超霉素。在轉(zhuǎn)基因篩選階段，卡那霉素濃度一般在30～200 mg/L，潮霉素濃度一般在10～75 mg/L。本研究在金花茶花絲愈傷組織誘導(dǎo)階段，卡那霉素100 mg/L或潮霉素30 mg/L導(dǎo)致花絲外植體全部褐化死亡；卡那霉素75 mg/L或潮霉素20 mg/L能夠抑制愈傷組織從花絲外植體上產(chǎn)生。在愈傷組織增殖階段，卡那霉素100 mg/L或潮霉素25 mg/L則能夠完全抑制愈傷組織的增殖，并導(dǎo)致最終褐化死亡。金花茶的花絲外植體或愈傷組織對兩種抗生素均表現(xiàn)出一定敏感性，且無論是愈傷組織誘導(dǎo)階段還是增殖階段，金花茶對潮霉素均更加敏感，因此，今后金花茶轉(zhuǎn)基因研究中使用潮霉素時要嚴格掌握工作濃度。

綜上所述，本研究利用金花茶幼嫩花絲成功建立了愈傷組織誘導(dǎo)和增殖培養(yǎng)體系，在此基礎(chǔ)上，研究了不同培養(yǎng)階段金花茶對卡那霉素和潮霉素的敏感性，為下一步開展金花茶轉(zhuǎn)基因研究提供重要技術(shù)參考。

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