決登偉，桑雪蓮，舒 波，劉麗琴，石勝友

（中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院南亞熱帶作物研究所/農(nóng)業(yè)部熱帶果樹生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524091）

番木瓜（Carica papayaL.）是一種重要的經(jīng)濟(jì)型水果，廣泛種植于熱帶和亞熱帶地區(qū)。番木瓜的果實(shí)不僅具有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，還有一定的藥用價(jià)值［1-2］。FAO數(shù)據(jù)顯示，2016年世界番木瓜總產(chǎn)量排在香蕉、柑橘、芒果和菠蘿之后，居當(dāng)年熱帶水果的第五位［3］。果實(shí)成熟是一個(gè)重要且復(fù)雜的過(guò)程，有關(guān)該過(guò)程的調(diào)控機(jī)制研究報(bào)道很多。按成熟機(jī)制不同，果實(shí)分為呼吸躍變型和非呼吸躍變型。其中，呼吸躍變型果實(shí)主要包括香蕉、梨、番木瓜、芒果和番茄等，該類型果實(shí)成熟過(guò)程中會(huì)伴隨著呼吸作用及乙烯含量的大幅上升；非呼吸躍變型果實(shí)主要包括鳳梨、楊桃和西瓜等，該類型果實(shí)成熟過(guò)程中不會(huì)出現(xiàn)呼吸作用的大幅變化，乙烯含量也維持在一個(gè)很低水平［4］。

蛋白質(zhì)作為細(xì)胞內(nèi)最重要的生物大分子，其合成及降解受到精確的時(shí)間及空間調(diào)節(jié)，并具有高度選擇性。泛素-蛋白酶體途徑（Ubiquitin-proteasome pathway，UPP）是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)選擇性降解的重要途徑。泛素分子主要通過(guò)泛素活化酶（E1）、泛素結(jié)合酶（E2）和泛素-蛋白連接酶（E3）與靶蛋白結(jié)合形成一條多泛素鏈，將底物蛋白泛素化，使靶蛋白被26S蛋白酶所識(shí)別和降解，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)多種代謝過(guò)程的調(diào)節(jié)［5］。泛素系統(tǒng)廣泛存在于真核生物中，并且在維持細(xì)胞功能以及細(xì)胞周期的運(yùn)轉(zhuǎn)、抵御環(huán)境脅迫、胚胎發(fā)育、激素響應(yīng)和衰老等方面發(fā)揮著重要作用［6-8］。擬南芥基因組估計(jì)有超過(guò)1 400個(gè)基因（約占總蛋白質(zhì)數(shù)量的5%）編碼蛋白泛素化系統(tǒng)的組分。而這其中，編碼E1基因只有兩個(gè)，其突變體是致死的。已報(bào)道的編碼E2基因有37個(gè)，還有8個(gè)編碼E2-like基因。而編碼E3的基因超過(guò)1 300個(gè)，并決定泛素化底物的特異性［9］。

目前對(duì)泛素-蛋白酶體途徑關(guān)鍵酶的研究主要集中在E2和E3上，對(duì)于E1的研究報(bào)道很少，且多集中在模式生物中。在酵母（Saccharomyces cerevisiae）［10-11］和擬南芥（Arabidopsis thaliane）［12-13］中都含有 2 個(gè)UBA基因；小麥（Triticum aestivum）中有3個(gè)UBA基因，其中UBA1和UBA2的同源性很高［14］；Li等［15］和張妮等［16］分別在龍須菜（Gracilaria lemaneiformis）和香蕉（musa acuminata）中發(fā)現(xiàn)UBA基因的存在。對(duì)UBA的功能研究表明，UBA除了具有激活泛素分子的作用外，可能還參與植株對(duì)逆境脅迫響應(yīng)［17］及果實(shí)的采后成熟過(guò)程［16］。前期研究中［18］，我們對(duì)番木瓜的泛素結(jié)合酶（Ubiquitin-conjugating enzymes，E2s）家族基因進(jìn)行了研究，34個(gè)CpUBCs中有15個(gè)基因在番木瓜果實(shí)成熟過(guò)程中呈上調(diào)或下調(diào)表達(dá)，說(shuō)明這些CpUBCs可能參與了果實(shí)成熟發(fā)育過(guò)程。而關(guān)于UBA基因在該進(jìn)程中的作用目前仍未知。

本研究采用生物信息法從番木瓜基因組中分析得到1條UBA基因序列，對(duì)該基因進(jìn)行序列分析及進(jìn)化分析，并利用熒光定量PCR技術(shù)探討了該基因在番木瓜不同組織及果實(shí)成熟進(jìn)程中的表達(dá)模式。研究結(jié)果將有助于更好了解UBA基因在果實(shí)發(fā)育和成熟過(guò)程中的作用，也為豐富UBA在不同作物中的功能研究提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試番木瓜材料品種為“日升”，組織表達(dá)分析試驗(yàn)以其成年樹的根、莖、葉、穗、雌花、雄花和果實(shí)為材料，果實(shí)成熟過(guò)程表達(dá)分析以幼果（immature green，IG）、綠熟果（mature green，MG）、轉(zhuǎn)色果（breaker，Br）和黃熟果（mature fruit，MF）為材料，由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院南亞熱帶作物研究所國(guó)家熱帶果樹種質(zhì)資源圃保存。

1.2 CpUBA1基因的獲得及分析

根據(jù)已有報(bào)道［10-13］，以擬南芥及酵母的UBA氨基酸序列在C. papayaGenomics Database（CpGDB; http：//www.plantgdb.org/CpGDB/）中搜索番木瓜的UBA同源序列。CpUBA1基因的基本信息，如ORF、氨基酸長(zhǎng)度和染色體定位等從Phytozome數(shù)據(jù)庫(kù)獲得；CpUBA1基因的外顯子、內(nèi)含子結(jié)構(gòu)通過(guò)在線軟件Gene Structure Display Server （GSDS） （http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）分析獲得。分別利用軟件SMART （http：//smart.emblheidelberg.de/）和 Plant-mPLoc（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/cgibin/ PlantmPLoc.cgi）預(yù)測(cè)CpUBA1蛋白的結(jié)構(gòu)域等電點(diǎn)和分子量；利用ExPASy （http：//expasy.org/tools/）分析CpUBA1蛋白的等電點(diǎn)和分子量；同時(shí)利用Clustal X對(duì)來(lái)自擬南芥、酵母、人類、小麥等物種的UBA氨基酸序列進(jìn)行多重序列對(duì)比，然后通過(guò)MEGA 5軟件進(jìn)行氨基酸序列同源性分析及系統(tǒng)發(fā)育分析，構(gòu)建Neighbor-Joining進(jìn)化樹，1 000 次重復(fù)，其他均為默認(rèn)設(shè)置。

1.3 植物總RNA提取及Realtime PCR分析

使用CTAB［18］法從番木瓜的根、莖、葉、穗、雌花、雄花和不同發(fā)育階段的果實(shí)中提取總RNA。cDNA第一鏈用TAKARA公司的PrimeScript RT試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成，具體操作步驟參照說(shuō)明書。根據(jù)番木瓜基因組中CpUBA1基因的CDS序列設(shè)計(jì)Realtime PCR引物，并以番木瓜的actin（FJ696416）基因作為內(nèi)參基因，具體引物序列見(jiàn)表1。

表1 定量PCR所用引物序列

通過(guò)Roche的LightCycler480熒光定量PCR儀及TAKARA公司的SYBR Green Master Mix試劑進(jìn)行定量PCR。反應(yīng)體系為20 mL，其中模板cDNA 40 ng，上、下游引物各250 nmol/L，SYBR Green Master Mix 10 μL，其余用ddH2O 補(bǔ)齊。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃10 s、59℃ 20 s、72℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)后作熔解曲線（95 → 65℃，0.1℃/s）。利用 2-ΔΔCt計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。所有樣品進(jìn)行3次重復(fù)，均設(shè)陰性對(duì)照。在分析CpUBA1基因的表達(dá)時(shí)，上調(diào)或者下調(diào)大于2倍時(shí)才認(rèn)為存在差異。所有試驗(yàn)3次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 CpUBA1基因的獲得及生物信息學(xué)分析

利用酵母和擬南芥U B A蛋白序列在PLAZA 3.0和CpGDB進(jìn)行BLASTP搜索，我們獲得1條番木瓜泛素活化酶基因序列，其在PLAZA 3.0數(shù)據(jù)庫(kù)中的登錄號(hào)為CP00002G03640。CpUBA1基因全長(zhǎng) 5 560 bp，含有5個(gè)內(nèi)含子。其中序列開放閱讀框（ORF）為3 459 bp，編碼的蛋白具有1 152個(gè)氨基酸，其分子量為128.93 ku，理論等電點(diǎn)為5.49，染色體定位信息為supercontig_2 ：4307079- 4312638。預(yù)測(cè)表明CpUBA1定位于細(xì)胞核。將獲得的CpUBA1與酵母（Saccharomyces cerevisiae）、人類（Homo sapiens）、擬南芥（Arabidopsis thaliane）、小麥（Triticum aestivum）、葡萄（Vitis vinifera）和可可（Theobroma cacao）中已知UBA的氨基酸序列進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)CpUBA1與 AtUBA1、AtUBA2、HsUBA1、ScUBA1、ScUBA2、TaUBA1、TaUBA3、VvUBA1、TcUBA1的同源性分別為76%、84%、41%、40%、13%、70%、68%、84%、83%。同時(shí)，番木瓜的CpUBA1含有UBA蛋白特有的保守氨基酸結(jié)構(gòu)域（YRNTFANLALPLFSMAEPVPPKVIKHQDMR WTVWDRWILKNNPTLRELLRWLEDKGLNAYSIS CGSCLLYNSMFPRHRERMDKKLVDLAREVAKV DLPPYRRHLDVVVACEDEEDNDVDIPQI）、5個(gè)半胱氨酸殘基及ATP結(jié)合位點(diǎn)（圖1）。

2.2 CpUBA1基因的進(jìn)化分析

采用MEGA 6軟件將番木瓜的CpUBA1蛋白序列與酵母、人類、擬南芥、小麥、葡萄和可可中的UBA蛋白序列進(jìn)行對(duì)比分析并構(gòu)建進(jìn)化樹，結(jié)果（圖2）顯示，CpUBA1與可可的TcUBA1及葡萄的VvUBA1聚到同一分支上，親緣關(guān)系最近，而與人類及酵母的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

2.3 CpUBA1基因在番木瓜不同組織中的表達(dá)分析

用Realtime PCR技術(shù)分析CpUBA1基因在番木瓜的根、莖、葉、穗、雌花、雄花和果實(shí)中的表達(dá)情況，結(jié)果（圖3）顯示，CpUBA1基因在番木瓜的不同組織中都檢測(cè)到表達(dá)，但表達(dá)存在差異。其中，在雌花中檢測(cè)到的表達(dá)量最低，葉片中的表達(dá)量最高，約為雌花的5.48倍。在雄花、果實(shí)、根及莖中的表達(dá)量約為葉片的3.82、3.18、2.76、1.71倍。該結(jié)果說(shuō)明CpUBA1基因可能參與了番木瓜植株不同組織器官的發(fā)育，特別是葉片及花器官的發(fā)育過(guò)程。

2.3 CpUBA1基因在番木瓜果實(shí)成熟進(jìn)程中的表達(dá)分析

分別提取幼果、綠熟果、轉(zhuǎn)色果和黃熟果果肉的RNA，并以反轉(zhuǎn)錄后cDNA為模板進(jìn)行表達(dá)分析。結(jié)果（圖4）顯示，CpUBA1基因的表達(dá)在綠熟果期沒(méi)有出現(xiàn)變化，但在轉(zhuǎn)色和成熟期分別上調(diào)為幼果期的2.43、2.66倍。該結(jié)果表明，CpUBA1基因可能參與了番木瓜實(shí)成熟進(jìn)程。

圖1 CpUBA1氨基酸結(jié)構(gòu)（A）及基因結(jié)構(gòu)（B）

圖2 番木瓜CpUBA1蛋白與其他物種UBA蛋白的進(jìn)化關(guān)系

圖3 CpUBA1基因在番木瓜不同組織中的表達(dá)水平

圖4 果實(shí)果實(shí)進(jìn)程中CpUBA1基因的表達(dá)

3 討論

泛素化途徑在很多生物途徑中起重要作用，泛素活化酶作為泛素化途徑的第一個(gè)參與酶，在識(shí)別靶蛋白泛素化過(guò)程中起關(guān)鍵作用［19］。目前關(guān)于植物UBA基因研究報(bào)道很少，多集中在擬南芥和小麥等模式植物或作物上。本研究首次從番木瓜基因組中得到1個(gè)UBA基因（CpUBA1），并對(duì)該基因的序列特征、進(jìn)化關(guān)系及表達(dá)進(jìn)行了分析。序列分析表明，CpUBA1含有C末端保守結(jié)構(gòu)域、ATP結(jié)合位點(diǎn)及5個(gè)半胱氨酸殘基，屬于典型的UBA蛋白。這和擬南芥［12-13］、小麥［14］等植物的研究結(jié)果一致。Hatfield等［14］對(duì)小麥的5個(gè)半胱氨酸殘基進(jìn)行了點(diǎn)突變研究，大腸桿菌表達(dá)分析表明只有第626位的半胱氨酸參與形成硫酯鍵，對(duì)應(yīng)于CpUBA1即為728位的半胱氨酸，但是否只有該位點(diǎn)半胱氨酸殘基參與形成硫酯鍵，還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。進(jìn)化分析結(jié)果顯示，CpUBA1與擬南芥、小麥、葡萄和可可的UBA蛋白序列聚到同一分支，其中與可可的TcUBA1及葡萄的VvUBA1同源性最高，而與人類及酵母的UBA親緣性較遠(yuǎn)。

目前關(guān)于植物E1的研究報(bào)道顯示，E1參與了植物生長(zhǎng)發(fā)育和逆境脅迫響應(yīng)［16-17］。張妮等［16］采用酵母雙雜交的方法得到了泛素活化酶E1的基因片段，命名為MuUBA。熒光實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果表明，MuUBA在莖中的表達(dá)量很低，在香蕉的花和子房發(fā)育第4個(gè)階段的表達(dá)量最高。推測(cè)MuUBA在香蕉不同組織及果實(shí)的采后成熟過(guò)程中具有很重要作用。與該研究類似，本研究中，CpUBA1在番木瓜不同組織中的表達(dá)呈葉片＞雄花＞果實(shí)＞根＞莖＞雌花的趨勢(shì)。說(shuō)明該基因可能在番木瓜植株不同組織器官的發(fā)育中發(fā)揮不同作用，特別是葉片及花器官的發(fā)育過(guò)程。同時(shí)CpUBA1基因的表達(dá)在轉(zhuǎn)色期出現(xiàn)顯著性上升，也就是番木瓜成熟的決定階段，但在綠熟果期未出現(xiàn)變化。香蕉的UBA表達(dá)分別受外源乙烯和1-MCP的強(qiáng)烈誘導(dǎo)和抑制［16］，與香蕉類似，番木瓜也是一種呼吸躍變型果實(shí)。雖然本研究結(jié)果表明CpUBA1可能參與了番木瓜果實(shí)成熟進(jìn)程，但該基因具體是通過(guò)怎樣的通路發(fā)揮該作用，還需要進(jìn)一步試驗(yàn)分析。綜上，本研究首次對(duì)番木瓜的泛素活化酶基因CpUBA1進(jìn)行了系統(tǒng)性的生物信息學(xué)及表達(dá)分析，該結(jié)果將為進(jìn)一步探討泛素-蛋白酶體系在番木瓜果實(shí)成熟進(jìn)程的作用奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也將豐富植物UBA基因的研究。

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