何艷霞, 孔令茜, 陳鵬臻, 苗 欣, 尚富德,2,3,*

1 河南大學生命科學學院,開封 475004 2 植物逆境生物學教育部重點實驗室,開封 475004 3 河南省植物逆境生物學重點實驗室,開封 475004

自然界中,植物的性系統(tǒng)在個體和居群水平有雌雄同株、雌雄異株、雄全同株、雌全同株、雄全異株等多種形式[1]。其中,雄全異株最為罕見。形態(tài)的雄全異株其繁育本質是雌雄異株[2- 5],僅有少數物種被證實是功能的雄全異株[6- 11]。

流蘇樹(ChionanthusretususLindl. et Paxt),是木犀科(Oleaceae)流蘇樹屬植物,主要分布在中國,日本和朝鮮半島有少量分布[12]。其有綠化、觀賞、入藥和制茶等多種價值。隨著生境的退化和片斷化,野生資源毀壞嚴重。流蘇樹在日本被列為紅皮書保護物種[13],在中國也被報道面臨生存危機[14]。目前,關于流蘇樹的研究主要側重栽培應用[15]和藥用成分[16- 18]等方面,且文獻對于流蘇樹花性別的描述各異：花單性而雌雄異株或兩性花[12]、亞雌雄異株[19]、雌雄異株[20]、雄全異株[21- 22]等。本研究前期調查顯示,流蘇樹形態(tài)上是雄全異株。其傳粉生物學方面的研究尚未見報道,它究竟是形態(tài)的還是功能的雄全異株亦不明確。本文就其開花動態(tài)、花部結構、傳粉媒介和繁育系統(tǒng)等方面展開研究,揭示流蘇樹的傳粉機制,探討其雄全異株的維持策略及演化途徑。

1 材料與方法

1.1 研究材料和地點

本實驗選取4個流蘇樹居群,分別位于雞公山保護區(qū)、桐柏淮源風景區(qū)、鄭州綠博園、河南大學校園。其中,前兩者為野生居群,后兩個是人工引種。各居群的地理位置、氣候特征等見表1。

表1 研究地點的環(huán)境條件

1.2 研究方法

1.2.1 開花動態(tài)與花的形態(tài)結構觀察

2014—2016連續(xù)3 a對河南大學校園的流蘇樹跟蹤觀察,記錄其開花動態(tài)。盛花期時從各個居群中選雄株和兩性株各3,每株隨機選10朵完全盛開的花,用游標卡尺分別測量花萼、花瓣、雄蕊和雌蕊等各部分的尺寸。

本研究將流蘇樹的開花進程分為5個時期?；ɡ倨冢夯ㄐ螂S葉片展開至花瓣即將展開階段。將花期：花瓣的螺旋式折疊松開,顏色變淺。始花期：70%的花處于將花期,10%的花盛開。盛花期：70%的花盛開,花藥開始散粉。末花期：幾乎所有的花完全盛開,90%花藥開裂,部分花瓣開始萎蔫、變黃或脫落。

從花芽萌動開始,每天分別取雄株和兩性株的花芽(序),用FAA液固定,4℃保存。采用常規(guī)石蠟切片法制片,鐵礬-蘇木精染色。必要時進行體視顯微鏡或掃描電鏡拍照。

1.2.2 繁育系統(tǒng)

(1)花粉活力、柱頭可授性、花粉量和胚珠比(P/O值)和雜交指數(OCI)測定

從花蕾期開始,每天中午取10朵兩性花, 用聯(lián)苯胺-過氧化氫反應液[聯(lián)苯胺∶過氧化氫∶水=4∶11∶22 (體積比)]檢測柱頭的可授性。同時,采用離體培養(yǎng)的方法分別檢測兩性花和雄花花粉在各個時期的活力。

每居群分別選取盛開但花藥未開裂的兩種花各30朵用FAA固定,經NaOH軟化和KCl定容,統(tǒng)計單花花粉量,另取30朵兩性花在解剖鏡下統(tǒng)計胚珠數,計算P/O值。雜交指數(OCI)參照Dafni[23]的方法。

(2) 傳粉媒介

盛花期時,分別從各個居群選6株花量較多的植株(雄性、兩性各3),連續(xù)2 d對造訪昆蟲的訪花時間和訪花行為進行觀察和拍照, 捕捉造訪昆蟲制成標本后帶回請專家鑒定。

以重力玻片法檢測花粉在空氣中的散布。從鄭州綠博園選取4棵相對孤立的單株,盛花期時,以樹干為中心,從東南西北4個方向,距樹干1、2、4、8、16 m的地方放置涂布凡士林的載玻片。24 h后回收并統(tǒng)計流蘇樹花粉粒。

現(xiàn)惠州歷史文化名城所指范圍是惠城區(qū)內明清遺存的惠州府城、歸善縣城及周邊西湖、東江、西枝江等水域所圍成的古城區(qū)域（簡稱府縣雙城），還有惠陽的淡水老街一帶。山水城市的概念也主要來自古城、西湖、東江及古城周邊山體。按照惠州城市發(fā)展所出現(xiàn)的歷史文化聚居點，歷史文化名城應有更加廣闊的范圍，山水城市亦應有更大的格局。

(3) 交配方式

在4個居群中選擇長勢良好的兩性株,進行如下幾種處理: (1) 不去雄、不套袋, 開放式傳粉,掛牌標記為對照；(2)不去雄,套袋,檢測自發(fā)自花授粉效率；(3)去雄, 人工授同株異花花粉后套袋,檢測是否自交親和；(4)去雄, 人工授異株兩性花花粉后套袋,檢測兩性花花粉受精效率；(5)去雄, 人工授雄花花粉后套袋,檢測雄花花粉的受精效率；(6)不去雄,套100目的紗網(孔徑150 μm,限制昆蟲進入,花粉能隨風穿過),檢測風傳粉效率；(7)去雄,不套袋、不套網、不授粉,檢測是否受花粉限制；(8)去雄、不授粉套袋, 檢測是否存在無融合生殖現(xiàn)象。每個處理每個居群分別做20—30個花序,每個花序僅保留30以內的小花數。處理后10 min, 20 min, 40 min, 1 h, 2 h, 4 h, 8 h, 16 h, 32 h時分別固定若干雌蕊(卡諾液),8 mol/L NaOH 軟化,0.1%脫色苯胺藍溶液染色,甘油封片,在熒光顯微鏡下觀察花粉粒萌發(fā)及花粉管的生長情況。授粉一個月后統(tǒng)計各花序的結實率?；ㄐ蚪Y實率(%)=果實數/處理的花數×100%。

1.2.3 數據分析

利用SPSS 19.0軟件對花的形態(tài)特征數據進行兩因素方差分析,結實率數據進行反正弦轉換后采用Duncan法進行多重比較,P<0.05 表示差異顯著,用Excel 進行作圖。

2 結果

2.1 流蘇樹的開花動態(tài)及花部特征

流蘇樹花萼4裂,披針形?；ü诎咨?花冠管長約3 mm,花瓣裂片4,長條形(圖1)。剖開花冠管,雄花內部含2枚雄蕊(圖1),兩性花有2枚雄蕊和1枚雌蕊(圖1)。觀察發(fā)現(xiàn),河南大學校園流蘇樹于前1年12月至當年3月進行花芽分化,3月下旬花葉展開。受天氣影響,每年的花期有變動。2014年3月27日,花蕾與葉展開,4月4日進入將花期,5日始花期,6—12日盛花期,期間8—10日小雨。2015年4月1日花蕾露出幼葉,隨后持續(xù)多云小雨；15日進入將花期,16日始花期,連續(xù)3 d小雨；20—23日盛花期。2016年4月1日花蕾外現(xiàn), 8日將花期,10日始花期,12 —14日盛花期。

對4個居群中處于盛花期的雄花與兩性花11個特征進行比較分析發(fā)現(xiàn),小花直徑、花瓣長、花瓣寬、萼片長、萼片寬、花藥長和花藥寬等特征在居群之間有顯著性差異,總體來看,雞公山和桐柏兩個野生居群在多個花部特征上明顯數值偏低。在同一居群內部,小花直徑、花冠管長和單花花粉存在顯著的性別差異,雄株的單花花粉量要顯著多于雌株,其他特征在雄花與兩性花之間沒有顯著差異(表2和表3)。

圖1 流蘇樹花的形態(tài)、花粉萌發(fā)與傳粉昆蟲Fig.1 Morphological characteristics, pollen germination and pollination insects of Chionanthus retususA.盛花期花序；B.雄花解剖；C.兩性花解剖；D.花粉粒離體萌發(fā)；E—G.花粉管在柱頭上的生長(黑色箭頭指示花粉管,E.雄花的花粉粒,F.兩性花的花粉粒,G.自然授粉的柱頭)；H.玻片上的花粉粒(灰色箭頭指示)；I—L. 傳粉昆蟲(I—J：食蚜蠅；K—L薊馬)

花各部測量值Measurementsoffloraltraits鄭州綠博園居群桐柏淮源風景區(qū)居群雞公山居群河南大學校園居群MHMHMHMH萼片長Sepalslength/mm2．35±0．352．53±0．282．25±0．462．47±0．322．21±0．62．24±0．442．60±0．462．63±0．45萼片寬Sepalswidth/mm0．84±0．120．84±0．150．88±0．140．93±0．070．71±0．150．69±0．150．77±0．130．84±0．14小花直徑Flowerdiameter/mm27．92±5．8327．52±4．5628．98±3．2527．25±6．0125．75±6．1622．73±3．9231．35±6．8829．87±3．73花冠管長Corollatubelength/mm2．63±0．392．78±0．302．37±0．392．91±0．362．55±0．272．82±0．282．71±0．322．79±0．43花瓣長Petalslength/mm20．23±2．9419．30±2．4418．19±1．95117．96±1．8718．90±2．6118．62±1．1919．98±2．3719．51±1．85花瓣寬Petalswidth/mm2．25±0．542．47±0．462．06±0．162．15±0．252．18±0．322．05±0．182．86±0．52．83±0．37雄蕊高Stamenheight/mm2．63±0．292．67±0．342．65±0．222．68±0．292．62±0．222．67±0．322．65±0．252．68±0．25雌蕊高Pistilheight/mm—2．59±0．24—2．62±0．40—2．57±0．44—2．61±0．27花藥長Lengthofanther/mm1．59±0．251．69±0．1971．56±0．141．55±0．131．83±0．251．65±0．221．72±0．191．81±0．31花藥寬Widthofanther/mm1．13±0．091．06±0．120．97±0．190．74±0．051．00±0．120．86±0．161．17±0．141．31±0．16單花花粉量/個Numberofthepollengrains90833±746240000±288694285±667550000±5322107777±110245000±283488750±666460000±7071

M：雄性,Male；H：兩性,Hermaphrodite

表3 不同流蘇樹居群雄花與兩性花不同特征的方差分析結果

*P< 0.05, **P< 0.01

2.2 花的解剖學觀察

通過掃描電鏡和石蠟切片觀察,流蘇樹雄花與兩性花的花芽分化初期至雄蕊分化期的發(fā)育過程基本一致(圖2)。兩種花的雄蕊均正常發(fā)育,花藥開裂后,產生二細胞花粉粒(圖2)。電鏡下可見雄花和兩性花的花粉粒都是橢圓形,具3個萌發(fā)溝,表面為網狀紋飾(圖2, 兩性花粉粒圖片未提供)。

在雌蕊分化的過程中,兩性花的花藥基部內側生長點逐漸產生兩個心皮原基,隨后愈合并分化形成具兩室的子房,中軸胎座,頂部伸長形成花柱和柱頭,最終發(fā)育成完整具功能的雌蕊(圖2)。雄花中也有心皮原基的產生,其愈合后于中央形成一個空室并停止發(fā)育,最后整體退化(圖2)。

圖2 流蘇樹雄花與兩性花解剖結構圖(A—C,J.掃描電鏡圖; D—N.石蠟切片圖)Fig.2 The structure of the two floral morphs of Chionanthus retusus (A—C,J. Scanning electron microscope image; D—N. Paraffin section)A.枝梗原基分化期; B. 花被分化期; C. 花序初期整體觀; D. 枝梗原基分化期；E. 花原基與枝梗原基分化期; F. 花被分化期; G. 雄蕊分化期; H. 四分體時期; I. 二細胞花粉(箭頭指示); J. 花粉粒赤道面和極面觀(雄性); K. 心皮原基分化期 (兩性花); L. 成熟兩性花; M. 心皮原基分化期(雄花); N. 心皮原基愈合(雄花, 箭頭指示空腔); O. 成熟雄花(箭頭指示退化的心皮原基)；BP:枝梗原基,Branch and stem primordium；FP:小花原基,Flower primordium；SE：萼片原基,Sepal primordium；PE：花瓣原基,Petal primordium；SP：雄蕊原基,Stamen primordium；Tap：絨氈層,Tapetum；En:藥室內壁,Endothecium；Epi：表皮,Epidermis；P：花瓣,Petal；ST：雄蕊,Stamen；CP：心皮原基,Carpel primordium；Sti：柱頭,Stigma；An：花藥,Anther；S：萼片,Sepal；CT：花冠管,Corolla tube；GT：腺毛,Glandular trichomes

2.3 繁育系統(tǒng)

2.3.1 花粉活力、柱頭可授性、花粉胚珠比(P/O)與雜交指數(OCI)測定

圖3 雄性花粉與兩性花粉萌發(fā)率比較 Fig.3 Comparison of pollen germination from two gender flowers

表4 不同時期兩性花柱頭可授性變化情況

注：+ + + +指柱頭可授性極強；+ + +指柱頭可授性較強； + +柱頭具有一定的可授性,+柱頭具有可授性,+/﹣指部分柱頭具有可授性,部分柱頭不具有可授性；﹣指所有柱頭都不具有可授性;B4—B1:開花前4天到開花前1天

圖4 重力玻片法的花粉粒個數統(tǒng)計Fig.4 Pollen grain number statistics on slides

2.3.2 傳粉媒介

通過重力玻片法檢測到空氣中有流蘇樹花粉散布(圖1)。從圖4可以看出,風能把大量流蘇樹的花粉傳播到16 m以外的地方。盛花期時,在晴朗的天氣,很少有昆蟲長時間地訪問流蘇樹的花,偶有雙翅目的食蚜蠅(Syrphidae)(圖1)會觸碰花朵,停留時間僅幾秒。同時,發(fā)現(xiàn)有薊馬(Thripidae)在花冠管內部長時間活動,而且,體視鏡下可見薊馬全身布滿流蘇樹的花粉(圖1)。食蚜蠅和薊馬可能是該樹主要的傳粉昆蟲。在控制授粉實驗結果中,自然套網與對照及自發(fā)自交的結實率均有顯著差異,說明風與昆蟲在其傳粉過程均發(fā)揮了重要作用。

圖5 人工授粉結實率比較Fig.5 Fruit setting of manipulated pollination with different treatmentsA. 不同處理的平均結實率比較,a,b,c,d,e,f,g表示各個處理間的顯著水平,柱子中的數值為各處理的均值結實率； B. 不同處理的地區(qū)間結實率比較

2.3.3 人工控制授粉

在人工控制授粉實驗中,兩性花去雄不授粉套袋后均不能結實,表明流蘇樹不存在無融合生殖現(xiàn)象。其他處理的結實率經方差分析,各處理間有顯著差異(F=374.808,P<0.01)。圖5顯示同株異花授粉與自發(fā)自交的結實率分別是36.94%和10.70%,有顯著差異,說明其自交親和,傳粉者對結實率有重要影響。雄株兩性株雜交和兩性異株雜交的結實率分別是41.11%和49.49%,說明流蘇樹異交親和,且異交結實率要顯著高于自交(同株異花)。對照的結實率(34.36%)顯著高于自然套網(24.67%),表明昆蟲與風在流蘇樹的傳粉過程中都發(fā)揮了重要作用。去雄不處理和自發(fā)自交的結實率最低,均顯著低于對照；人工授粉的結實率均顯著高于對照；顯然,在自然授粉的過程中,流蘇樹受到花粉限制或者傳粉者限制造成花粉不足。就4個居群分析,桐柏的結實率顯著低于其他3個居群(F=10.001,P<0.01)。圖5顯示桐柏居群自然套網和自然對照的結實率明顯低于其他3個居群,去雄不處理和自發(fā)自交兩個處理中,桐柏的結實率略低于其他居群但并沒有顯著差異；同時,在3個人工授粉的處理中,桐柏居群的結實率均最高?？梢?桐柏居群結實率的降低受到傳粉媒介的影響。

3 討論

3.1 流蘇樹的性系統(tǒng)和傳粉機制

通過對多個流蘇樹居群的調查,發(fā)現(xiàn)只存在雄株和兩性株,沒有文獻中提到的“花單性而雌雄異株”的雌株,未發(fā)現(xiàn)雌花,亦未發(fā)現(xiàn)雄花與兩性花同株現(xiàn)象。本調查結果與Soejima等[21]、馬紅[24]及Song等[22]的研究報道一致。結合本文控制授粉結果,流蘇樹的性系統(tǒng)應描述為雄全異株。

諸多研究表明,被子植物性別表型受植株大小和年齡[25- 27]、環(huán)境[28-29]及遺傳等多種因素的影響[30]。作為反映性表達特征的花部特征,不僅受到遺傳的控制,同時會受到生境條件的影響[31]。本研究所調查的居群中均同時存在兩性株和雄株,且每個個體的性別在3 a中沒有發(fā)生變化,說明流蘇樹的性表達系統(tǒng)具有相對穩(wěn)定的遺傳基礎。流蘇樹花的萼片、花瓣與花藥等特征在4個居群間有顯著差異,說明受環(huán)境的影響較大,該發(fā)現(xiàn)Song等[22]對韓國4個居群的觀察是一致的。但是,本研究發(fā)現(xiàn)花部特征的性別差異沒有Song等[22]的結果明顯。這種差異可能由實驗材料的年齡、居群大小、生境等因素造成的,后續(xù)研究應該增加跨區(qū)域的比較。

流蘇樹雄株和兩性株的花量和花粉量均較大, 萼片上具腺毛結構,這是植物適應風媒和蟲媒的特征[32- 33]。從測定的P/O值看,按照Cruden[34]標準,流蘇樹應是專性異交。但OCI值顯示流蘇樹的繁育系統(tǒng)卻是自交親和,有時需要傳粉者,而這與人工授粉的實驗結果一致。這一現(xiàn)象符合Preston[35]的結論：P/O不是評判繁育系統(tǒng)的唯一指標。那么,高的P/O值可能是對有效傳粉者收集花粉的過程中所造成絕大部分花粉損失的補償[36]。雄花與兩性花中均未觀察到蜜腺結構,與Song等[22]的報道一致。沒有蜜汁為傳粉動物提供報酬,因而,在花期內未吸引到大量的傳粉昆蟲。薊馬繁殖能力極強,可隨風力飛行,其隱匿于花中吸食花粉,食蚜蠅捕食薊馬,它們的行為完成被動傳粉。人工授粉實驗中,桐柏居群自然傳粉的3個處理(對照、套網和去雄不處理)的結實率顯著低于其他居群,但人工傳粉處理的結實率在地區(qū)間沒有差異。顯然,自然界的傳粉媒介在桐柏居群受到影響。本實驗在桐柏居群具體的實施地點位于一個山凹的石崖下,剛好是一個“避風港”,雞公山的實驗點在緊鄰最高峰的次峰上,基本是一個風口,另兩個栽培地都是平原地帶,均不避風?？梢?風在流蘇樹的傳粉過程中起著重要的作用。空氣中有花粉散布, 兩性花經套網后結實率比套袋結實率高,比對照的結實率低,且差異顯著,說明流蘇樹為風媒和蟲媒混合傳粉類型。

流蘇樹雄花與兩性花花粉的形態(tài)結構、離體萌發(fā)率均無差異,人工授粉均能結實說明雄株與兩性株都具有雄性功能,是典型的功能性雄全異株。流蘇樹自交與異交都親和,而且異交的結實率顯著高于自交。一方面,異交有利于子代產生新的遺傳變異,增加物種的遺傳多樣性,避免自交衰退,更有利于物種的延續(xù)；另一方面,流蘇樹的雌蕊與雄蕊的外部有花冠管的包被,直接接受外來花粉的概率很小,同時花期多雨,傳粉者種類單一且活動易受到氣溫與風速等天氣狀況的影響,自交親和在缺少有效傳粉者時為其提供一定的生殖保障[37]。當然,流蘇樹自身的生存策略是雜交還是自交占優(yōu)勢,尚需要“父本分析”數據才能進一步說明,這部分實驗是我們下一步正進行的工作。

3.2 流蘇樹雄全異株的維持與演化

作為一種罕見的繁育系統(tǒng),雄全異株植物在進化過程中要得以維持,必須是完全雜交或自交率很低,且伴隨著很強的自交衰退[38- 39]。理論上要求雄全異株群體中雄株的適合度比兩性株在授粉上存在2倍以上的優(yōu)勢[40- 41]。就我們研究的居群來看,流蘇樹雄株在不同群體中的比例變化較大(39.5%—57.6%),并不符合雄全異株群體中雄株比例低于0.5的理論要求,這一現(xiàn)象在木犀科其他的雄全異株物種中同樣存在[42- 43]。另外,流蘇樹野生資源破壞非常嚴重,尤其在種子價格炒至50—150元/kg的情況下,“伐木取種”嚴重破壞了性別比例。同時我們調查的都是成年流蘇樹,在人為干擾的情況下,這個數據可能并不能完全反映流蘇樹自然群體的狀況。但是,就單花花粉量來看,流蘇樹雄株凸顯出大的資源優(yōu)勢。

雄全異株與雌雄異株的演化關系已經成為目前研究的焦點[41]。傳統(tǒng)觀點認為,雌雄異株種群中的雌株突變獲得微弱的雄性功能,這種突變體進而得到保留, 即雄全異株起源于雌雄異株[44]。另一種觀點認為,雌雄同株(雌雄同花或雌雄同株)種群中產生了雌性不育突變體并得以保留, 即雄全異株來源于兩性個體。木犀科植物的雄全異株現(xiàn)象已報道多例,并從不同的角度為第二種觀點提供證據[45- 46]。分子系統(tǒng)學證實白蠟樹雄全異株群體是由兩性株向雌雄異株的過渡狀態(tài),而且其傳粉媒介由蟲媒向風媒傳粉進化[47]。本研究比較了流蘇樹雄株和兩性株花芽分化過程,兩性花的雌蕊發(fā)育正常,而雄花的雌蕊在發(fā)育早期有心皮原基的產生,隨后愈合形成一個空腔并最終退化。顯然,流蘇樹的雄花存在雌蕊退化的痕跡。同時,本研究結果表明,流蘇樹是由昆蟲和風共同傳粉,結合Wallander[47]的結論,流蘇樹的雄全異株同樣也是由兩性株群體向雌雄異株群體進化的過渡類型。

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