張丹丹, 莫柳張麗梅,徐星凱

1 中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心城市與區(qū)域生態(tài)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100085 2 中國(guó)科學(xué)院大學(xué), 北京 100049 3 中國(guó)科學(xué)院大氣物理研究所大氣邊界層物理和大氣化學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100029 4 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院, 武漢 430070

甲烷(CH4)是僅次于水蒸氣和二氧化碳的第三大溫室氣體,對(duì)全球氣候變暖的貢獻(xiàn)率接近20%(IPCC,2007)。由于人類活動(dòng)的加劇,大氣中的CH4濃度已大幅增長(zhǎng),造成大氣CH4濃度的升高的原因不僅是其源增加的結(jié)果,也與其匯減少有關(guān)[1]。水分不飽和的土壤作為大氣CH4重要的匯,每年可以從大氣中吸收(氧化)大約20—60Tg的CH4[2-3],其微小變化都可能影響全球的CH4平衡[4]。森林土壤更被視為其中最為有效的匯[5-6],但由于環(huán)境因素變化如降水、溫度、pH、樹種、氮沉降以及森林管理方式等的影響,森林土壤氧化大氣CH4的能力具有很高的變異性,因此,深入研究環(huán)境因素影響森林土壤CH4氧化的驅(qū)動(dòng)機(jī)制對(duì)全面評(píng)估和調(diào)控森林土壤甲烷氧化能力具有重要意義[7- 13]。

近一個(gè)半世紀(jì)以來,由于化石燃料燃燒和農(nóng)業(yè)化肥的大量投入等向大氣中排放的含氮化合物激增,導(dǎo)致大氣的氮沉降大幅增加[14]。森林生態(tài)系統(tǒng)是氮沉降大面積的直接承受者[15],據(jù)調(diào)查,溫帶森林的氮沉降量已高于15kg N hm-2a-1,有些地區(qū)甚至高于50kg N hm-2a-1[16],氮沉降因而成為森林生態(tài)系統(tǒng)備受關(guān)注的環(huán)境因子,并針對(duì)氮沉降對(duì)森林土壤甲烷氧化的影響開展了大量工作。但目前多數(shù)研究主要針對(duì)CH4氣體吸收通量或吸收動(dòng)力學(xué)這些表觀特征來揭示氮沉降對(duì)森林土壤甲烷氧化的影響,對(duì)于這一過程中起關(guān)鍵作用的土壤微生物的作用機(jī)制研究相對(duì)較少,國(guó)內(nèi)在這方面的研究更是鮮有報(bào)道。參與森林土壤甲烷氧化的微生物主要是甲烷氧化菌(Methanotroph)。甲烷氧化菌是一類以CH4為唯一碳源和能源的細(xì)菌,其通過甲烷單加氧酶(Methane monooxygenase,MMO)將CH4首先氧化為甲醇并啟動(dòng)系列酶將CH4最終代謝成二氧化碳和水[17]。根據(jù)生理生化特征以及對(duì)CH4代謝途徑的差異,可將甲烷氧化菌分為type I和type II兩種類型,其分別屬于γ-變形菌綱(γ-Proteobacteria)和α-變形菌綱(α-Proteobacteria)[18]。有關(guān)農(nóng)業(yè)、森林以及濕地土壤等中甲烷氧化菌數(shù)量和群落組成已有較多的研究報(bào)道,并發(fā)現(xiàn)土壤甲烷氧化菌的數(shù)量、群落組成及其活性會(huì)受土壤pH、濕度、溫度、大氣CH4濃度、植被類型以及施肥等環(huán)境因素的影響[19- 25]。但關(guān)于森林土壤甲烷氧化菌應(yīng)對(duì)氮沉降增加的響應(yīng)機(jī)制的研究相對(duì)較少,國(guó)內(nèi)更是缺乏相關(guān)報(bào)道。國(guó)外已有的幾篇報(bào)道也主要是通過室內(nèi)的短期施氮培養(yǎng)來研究氮素增加對(duì)森林土壤甲烷氧化菌群落組成的影響[26-27],而關(guān)于野外長(zhǎng)期氮沉降增加對(duì)森林土壤甲烷氧化菌數(shù)量和群落組成的影響仍有待進(jìn)一步研究。

長(zhǎng)白山闊葉紅松混交林是位于我國(guó)東北部重要的溫帶森林生態(tài)系統(tǒng)。本研究基于長(zhǎng)白山溫帶森林長(zhǎng)期氮沉降模擬實(shí)驗(yàn)平臺(tái),采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和克隆測(cè)序以及土壤屬性測(cè)定相結(jié)合方法,研究了長(zhǎng)期施加不同形態(tài)氮肥后,森林土壤甲烷氧化菌的數(shù)量和群落組成隨季節(jié)變化的特征及其與土壤基質(zhì)屬性的關(guān)系,以期揭示長(zhǎng)期氮沉降增加影響溫帶森林土壤甲烷氧化的微生物機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 土壤采集和理化性質(zhì)的測(cè)定

本研究土壤樣品采自長(zhǎng)白山闊葉紅松混交林長(zhǎng)期氮沉降模擬實(shí)驗(yàn)平臺(tái),該控制實(shí)驗(yàn)始于2006年,位于長(zhǎng)白山北坡底部(42°24′N,127°06′E),該地區(qū)屬于典型的受季風(fēng)影響的溫帶大陸性山地氣候,水熱同期,夏季短暫多雨,冬季寒冷漫長(zhǎng),年平均溫度為2.5—5.5℃,年降水量600—900mm[28-29]。土壤類型為山地暗棕壤,冷涼淋溶土,以火山灰為成土母質(zhì),經(jīng)有機(jī)質(zhì)積累和弱酸性淋溶過程形成[30],主要植被有紅松(Pinuskoraiensis)、椴樹、蒙古櫟和水曲柳等。土壤樣品采樣時(shí)選擇野外控制實(shí)驗(yàn)中長(zhǎng)期施加高劑量(45kg N hm-2a-1)的3種不同形態(tài)氮素((NH4)2SO4、NH4Cl和KNO3)及未施用氮素的處理(對(duì)照)為研究對(duì)象,每個(gè)處理均設(shè)有4個(gè)重復(fù)小區(qū)；有關(guān)森林剖面土壤屬性和野外施氮控制實(shí)驗(yàn)參見[31-32]。根據(jù)長(zhǎng)期積累數(shù)據(jù)規(guī)律以及當(dāng)?shù)氐臍夂蛱卣鞣謩e在夏季雨熱同期(8月)和秋季干旱期(10月)兩個(gè)典型時(shí)期采集土壤樣品：每個(gè)小區(qū)利用不繡鋼土鉆隨機(jī)選取3點(diǎn)采集0—10cm深度的土壤,充分混勻后置于冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室處理。將采集的土壤樣品分成兩份,一份隨即以液氮速凍保存于-80℃冰箱,用于分子生物學(xué)分析；另一份中存放于4℃用于pH值、銨態(tài)氮、硝態(tài)氮和可溶性有機(jī)碳測(cè)定。

土壤pH 值的測(cè)定采用去離子水以水土比2.5∶1(w/w)浸提,并用Delta 320 pH儀測(cè)定；土壤銨態(tài)氮和硝態(tài)氮采用1mol/L KCl溶液,以水土比5∶1(w/w)浸提后,采用連續(xù)流動(dòng)分析儀(SAN++, SKALAR, the Netherlands)測(cè)定；土壤可溶性有機(jī)碳采用 0.5mol/L K2SO4溶液,以水土比為5∶1浸提后,通過總有機(jī)碳分析儀(Shimadzu TOC-Vcsh/TN, Kyoto, Japan)測(cè)定[33]。

1.2 土壤DNA和定量PCR分析

土壤總DNA提取采用MoBio UltracleanTMSoil DNA 試劑盒(San Diego, CA)進(jìn)行,所有操作依照產(chǎn)品說明書進(jìn)行,細(xì)胞破碎在FastPrep上進(jìn)行,破碎強(qiáng)度為5.0m/s,時(shí)間為45s。所獲得的DNA樣品經(jīng)10倍稀釋后直接用于下游實(shí)驗(yàn)。

以甲烷氧化菌的pmoA基因?yàn)榘谢?以pmoA基因的特異引物A189(5′-GGNGACTGGGACTTCTGG和mb661(5′-CCGGMGCAACGTCYTTACC)[34]利用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 對(duì)不同處理土壤中甲烷氧化菌的豐度進(jìn)行定量分析。定量 PCR的擴(kuò)增反應(yīng)使用 SYBR? Premix Ex TaqTM試劑盒(TaKaRa),25μL定量PCR反應(yīng)體系中包括2×SYBR Premix Ex TaqTM12.5μL,正反向引物(濃度為10μmol/L)各0.5μL,DNA模板2μL,其余用ddH2O補(bǔ)足至25μL。Real-time PCR反應(yīng)在ICycler IQ 5 thermocycler (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)上運(yùn)行,其擴(kuò)增程序如下：94℃預(yù)變性5min；94℃變性45s,63℃退火45s,72℃延伸1min,之后每個(gè)循環(huán)退火溫度降低1℃,共5個(gè)循環(huán)； 94℃變性45s,57℃退火45s,72℃延伸1min,共30個(gè)循環(huán)；在83℃收集反應(yīng)熒光信號(hào),數(shù)據(jù)分析采用iCycler軟件[24]。

1.3 甲烷氧化菌的群落組成分析

甲烷氧化菌的群落組成通過對(duì)pmoA基因進(jìn)行克隆測(cè)序分析,pmoA基因普通PCR擴(kuò)增引物和擴(kuò)增程序同1.2中的real-time PCR。PCR產(chǎn)物經(jīng)過Wizard SV Gel & PCR Clean-Up System(Promega, USA)試劑盒切膠純化后,連接到pGEM-T Easy Vector上(Promega, Madison, WI, USA),再通過熱擊法將載體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞(TaKaRa, Japan),取轉(zhuǎn)化液涂布到含有氨芐青霉素(Ampicillin)/IPTG/X-Gal的LB (Luria-Bertani)培養(yǎng)基上,37℃下培養(yǎng)16—18h。隨機(jī)選取若干白色克隆子,采用菌體擴(kuò)增方式,用pGEM-T Easy Vector通用引物T7/SP6擴(kuò)增外源插入片段。通過1%濃度的瓊脂糖凝膠電泳法檢驗(yàn)含有插入片段的陽(yáng)性克隆子。

每個(gè)克隆文庫(kù)隨機(jī)挑選30個(gè)陽(yáng)性克隆子進(jìn)行測(cè)序。所獲得的目的基因序列通過ClustalX2,mouthur進(jìn)行序列分析,按照93%同源劃分可操作分類單元(Operational Taxonomic Units, OTUs)[35],并把正確長(zhǎng)度的序列提交NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blast序列對(duì)比,下載最相似菌種序列作為系統(tǒng)發(fā)育樹的參考序列。通過Clustal W和Mega 5.0建立Neighbor-Joining系統(tǒng)發(fā)育樹,系統(tǒng)發(fā)育樹各分支置信度由自舉分析方法(Bootstrap)檢驗(yàn),重復(fù)1000次。

1.4 數(shù)據(jù)處理

本研究中的統(tǒng)計(jì)分析在SPSS 19.0軟件中進(jìn)行,其中多組數(shù)據(jù)間的差異分析采用單因素方差分析與多重比較分析(Duncan,P<0.05)；相關(guān)分析采用Spearman相關(guān)分析；克隆文庫(kù)數(shù)據(jù)的分析采用Redundancy analysis(RDA)分析樣品間群落組成與不同形態(tài)氮沉降增加下土壤基質(zhì)屬性的關(guān)系,在CANOCO 4.5軟件中進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 土壤理化性質(zhì)

表1 土壤基本理化屬性(平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差)

平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差；同列相同小寫字母a分別表明夏季和秋季土壤性質(zhì)在不同處理之間無(wú)顯著性差異,同列大寫字母A, B表明不同處理之間土壤性質(zhì)的顯著差異性(P<0.05)

2.2 甲烷氧化菌的數(shù)量及其與土壤基質(zhì)特性之間的關(guān)系

圖1 夏季和秋季不同施肥處理間土壤甲烷氧化菌pmoA 基因豐度Fig.1 The abundance of soil methanotrophic pmoA gene under different nitrogenous compound amendments in Summer (August) and Fall (October)小寫字母a：pmoA基因豐度在夏季(8月)雨熱同期時(shí)期各處理之間差異無(wú)顯著性；大寫字母A, B：pmoA基因豐度在秋季(10月)干旱期各處理之間的有差異顯著性(P < 0.05)

2.3 甲烷氧化菌的群落組成

圖2 夏季和秋季施氮處理樣地甲烷氧化菌群落組成的變化Fig.2 The community composition of methanotroph under different nitrogenous compound amendments in Summer (August) and Fall (October)CK：對(duì)照組,未施氮處理；HS：施加硫酸銨,(NH4)2SO4處理；HCl：施加氯化銨,NH4Cl處理；HK：施加硝酸鉀,KNO3處理

通過克隆測(cè)序技術(shù),對(duì)甲烷氧化菌的群落組成進(jìn)行了分析。對(duì)兩個(gè)季節(jié)所采集的樣品一共構(gòu)建了32個(gè)pmoA基因克隆文庫(kù),每個(gè)克隆文庫(kù)隨機(jī)挑取約30個(gè)克隆子進(jìn)行測(cè)序,共獲得742條有效序列。在93%的序列相似水平上,甲烷氧化菌pmoA基因序列一共被劃分為112個(gè)OTU,在系統(tǒng)發(fā)育樹上形成2個(gè)主要分支,分別對(duì)應(yīng)Type I型(磷酸核酮糖氧化途徑)和Type Ⅱ型(絲氨酸氧化途徑)甲烷氧化菌,如圖3所示。其中,屬于Type I型的序列可進(jìn)一步形成4個(gè)分支,參考Kolb等人[36]的分類經(jīng)驗(yàn),研究將這4個(gè)分支命名為：Methylobacter-group (Type I)、Methylococcus-group (Type I)、Methylohalobius-group (Type I)和upland soil cluster γ(Type I)。其中,upland soil cluster γ(Type I) 序列主要來自于旱地土壤和森林土壤[19,36],但本研究的供試樣品只檢測(cè)到Methylobacter-group (Type I)和Methylococcus-group (Type I),未檢測(cè)到upland soil cluster γ(Type I)和Methylohalobius-group (Type I)的序列,可能由引物的偏差所致(圖3)。屬于Type II的序列也形成兩個(gè)小分支,即Methylosinus-group (Type II)和Methylocapsaspp. (Type II)(圖3),于供試土壤樣品中均被檢測(cè)到。

圖3 甲烷氧化菌pomA 基因系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of methanotroph pomA gene sequences CK8(10)：8(10)月份對(duì)照,CK土壤樣品；HS8(10)：8(10)月份施加硫酸銨,(NH4)2SO4處理土壤樣品；HCl8(10)：8(10)月份施加氯化銨,NH4Cl處理土壤樣品；HK8(10)：8(10)月份施加硝酸鉀,KNO3處理土壤樣品；分號(hào)后的數(shù)字：OTU的序號(hào)；括號(hào)里的數(shù)字：該處理代表OTU的序列條數(shù)

對(duì)pmoA基因?yàn)榇淼募淄檠趸⑸锶郝浣M成和土壤基本屬性進(jìn)行冗余分析(Redundancy analysis, RDA),結(jié)果顯示甲烷氧化菌群落組成與鹽浸提有機(jī)碳/礦質(zhì)氮比值呈顯著正相關(guān)關(guān)系(r=0.49,P<0.05),與土壤濕度和pH值無(wú)相關(guān)性(圖4)。此外,RDA分析結(jié)果顯示夏季(8月)樣品和秋季(10月)樣品被RDA Axis 1軸分開,表明采樣時(shí)間即季節(jié)變化對(duì)甲烷氧化菌的群落組成有顯著影響(PerMANOVA,P< 0.1, 圖4)。

圖4 甲烷氧化菌群落組成與環(huán)境因子的RDA分析Fig.4 Redundancy analysis (RDA) between methanotroph community and environmental variables 空心圖標(biāo)：8月份土壤樣品；實(shí)心圖標(biāo)：10月份土壤樣品；○：8月份對(duì)照,CK土壤樣品；□：8月份施加硫酸銨,(NH4)2SO4處理土壤樣品；△：8月份施加氯化銨,NH4Cl處理土壤樣品；▽：8月份施加硝酸鉀,KNO3處理土壤樣品；●：10月份對(duì)照,CK樣品；■：10月份施加硫酸銨,(NH4)2SO4處理土壤樣品；▲：10月份施加氯化銨,NH4Cl處理土壤樣品；▼：10月份施加硝酸鉀,KNO3處理土壤樣品

3 討論

3.1 甲烷氧化菌的數(shù)量對(duì)不同形態(tài)氮沉降增加的響應(yīng)

3.2 甲烷氧化菌的組成對(duì)不同形態(tài)氮沉降增加的響應(yīng)

根據(jù)甲烷氧化菌的生理生化特征以及對(duì)CH4代謝途徑和親和力的差異,可將甲烷氧化菌分為Type I型和Type II型兩種類型,分別屬于γ-Preoteobacteria和α-Preoteobacteria綱；Type I型甲烷氧化菌通過磷酸核酮糖途徑氧化CH4,對(duì)CH4親和力低,但具有較強(qiáng)的繁殖能力,屬于r-策略者[44],其常見類群包括：甲基單胞菌屬(Methylomonas)、甲基球菌屬(Methylococcs)等；而Type Ⅱ型利用絲氨酸途徑氧化CH4,對(duì)CH4的親和力高,屬于k-策略者,包括甲基彎曲菌(Methylosinus)和甲基孢囊菌屬(Methylocystis)等；此外,人們將類似于Type I型莢膜甲基球菌(Methylococcuscapsulatus)的甲烷氧化菌定義為X型,其代謝途徑與Type I型相同[17-18,45]。本研究中檢測(cè)到的pmoA基因序列分為Type I型和Type Ⅱ型兩類甲烷氧化菌,主要以Type I型甲烷氧化菌為主,其相對(duì)比例大于70%(圖2),造成這種現(xiàn)象的原因可能是：Type I型甲烷氧化菌在低CH4高氧氣環(huán)境中為優(yōu)勢(shì)種群,而Type Ⅱ型甲烷氧化菌則在高CH4低氧氣環(huán)境中起主導(dǎo)作用[46]。此外,已有的研究發(fā)現(xiàn)Type I型甲烷氧化菌對(duì)土壤環(huán)境要求較苛刻,而Type Ⅱ型甲烷氧化菌有較強(qiáng)的生存能力,因此施氮過程會(huì)較大程度影響Type I型甲烷氧化菌的活性和群落組成,而對(duì)Type Ⅱ型甲烷氧化菌的群落組成無(wú)顯著影響[2,47]。

3.3 季節(jié)變化對(duì)甲烷氧化菌響應(yīng)氮素輸入的影響

RDA分析結(jié)果表明森林土壤鹽浸提有機(jī)碳/礦質(zhì)氮比值與甲烷氧化菌群落組成呈顯著相關(guān)性,再次印證不同施氮處理是導(dǎo)致甲烷氧化菌群落組成差異的主要因素。此外,RDA結(jié)果顯示夏季(8月)樣品和秋季(10月)樣品被RDA Axis 1軸分開,表明甲烷氧化菌的群落組成在不同季節(jié)有明顯變化,與該樣地中甲烷通量隨季節(jié)變化的趨勢(shì)和之前有關(guān)季節(jié)和溫度變化顯著影響甲烷氧化菌的群落組成和甲烷的產(chǎn)生與氧化能力的研究報(bào)道一致[8,20,32]。但本研究中施氮處理對(duì)甲烷氧化菌的豐度和群落組成的影響在夏季不顯著,而在秋季均表現(xiàn)出明顯影響。長(zhǎng)白山闊葉紅松混交林地屬于溫帶大陸季風(fēng)型氣候,夏季平均溫度保持在25℃左右,而秋季平均溫度在5—15℃范圍內(nèi)[32]。雖然嗜熱性甲烷氧化菌相繼被發(fā)現(xiàn)[48-49],但多數(shù)甲烷氧化菌生長(zhǎng)的適宜溫度在20—30℃之間。長(zhǎng)白山地區(qū)夏季較適宜的溫度更有利于甲烷氧化菌的生長(zhǎng)和活性,該影響可能超過施氮本身的影響,從而使得其對(duì)長(zhǎng)期施氮的響應(yīng)不顯著。此外,也有不少研究表明,氮肥施用可通過促進(jìn)植物生長(zhǎng)促進(jìn)根系分泌更多碳源供給甲烷氧化菌從而促進(jìn)甲烷氧化能力[50-51]；夏季植物生長(zhǎng)旺盛對(duì)氮肥的吸收利用較快,從而減弱了氮肥對(duì)土壤中甲烷氧化菌的抑制作用。

4 結(jié)論

本研究對(duì)長(zhǎng)期施加不同形態(tài)氮素模擬沉降增加條件下溫帶森林土壤中甲烷氧化菌的數(shù)量和群落組成的季節(jié)性演變特征及其與土壤基質(zhì)屬性的耦合關(guān)系進(jìn)行研究,結(jié)果表明,夏季不同施氮處理對(duì)甲烷氧化菌pmoA基因豐度無(wú)顯著性差異,而秋季施加NH4Cl和(NH4)2SO4處理降低甲烷氧化菌的豐度。無(wú)論夏季和秋季,施加不同形態(tài)氮的土壤中甲烷氧化菌均以適應(yīng)低CH4但有氧環(huán)境的Type I型為主(相對(duì)豐度在70.6%—85.4%之間),作為I型甲烷氧化菌的優(yōu)勢(shì)類群,Methylobacter-group (Type I)占Type I型的55.1%—91.7%,在夏季不同形態(tài)氮處理間無(wú)顯著差異,但在秋季施加(NH4)2SO4和NH4Cl處理中顯著低于對(duì)照處理。長(zhǎng)白山地區(qū)夏季較適宜的溫度更有利于甲烷氧化菌的生長(zhǎng),以及夏季植物生長(zhǎng)旺盛為甲烷氧化菌提供更多碳源,從而使得施氮對(duì)甲烷氧化菌的影響不如秋季顯著。這些結(jié)果解釋了以往觀測(cè)到的施銨態(tài)氮肥顯著降低秋季林地甲烷凈吸收通量,而在夏季無(wú)顯著影響的觀測(cè)結(jié)果,一定程度上揭示了氮沉降影響森林土壤甲烷氧化季節(jié)性差異的潛在的微生物機(jī)制。

致謝：中國(guó)科學(xué)院大氣物理研究所王迎紅博士、吳浩浩同學(xué)幫助樣品采集和土壤性質(zhì)分析測(cè)定,中國(guó)科學(xué)院微生物研究所鄭勇博士和中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心王雅琪同學(xué)幫助微生物分析，特此致謝。

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