張丹丹, 莫柳張麗梅,徐星凱

1 中國科學院生態(tài)環(huán)境研究中心城市與區(qū)域生態(tài)國家重點實驗室, 北京 100085 2 中國科學院大學, 北京 100049 3 中國科學院大氣物理研究所大氣邊界層物理和大氣化學國家重點實驗室, 北京 100029 4 華中農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境學院, 武漢 430070

甲烷(CH4)是僅次于水蒸氣和二氧化碳的第三大溫室氣體,對全球氣候變暖的貢獻率接近20%(IPCC,2007)。由于人類活動的加劇,大氣中的CH4濃度已大幅增長,造成大氣CH4濃度的升高的原因不僅是其源增加的結(jié)果,也與其匯減少有關(guān)[1]。水分不飽和的土壤作為大氣CH4重要的匯,每年可以從大氣中吸收(氧化)大約20—60Tg的CH4[2-3],其微小變化都可能影響全球的CH4平衡[4]。森林土壤更被視為其中最為有效的匯[5-6],但由于環(huán)境因素變化如降水、溫度、pH、樹種、氮沉降以及森林管理方式等的影響,森林土壤氧化大氣CH4的能力具有很高的變異性,因此,深入研究環(huán)境因素影響森林土壤CH4氧化的驅(qū)動機制對全面評估和調(diào)控森林土壤甲烷氧化能力具有重要意義[7- 13]。

近一個半世紀以來,由于化石燃料燃燒和農(nóng)業(yè)化肥的大量投入等向大氣中排放的含氮化合物激增,導致大氣的氮沉降大幅增加[14]。森林生態(tài)系統(tǒng)是氮沉降大面積的直接承受者[15],據(jù)調(diào)查,溫帶森林的氮沉降量已高于15kg N hm-2a-1,有些地區(qū)甚至高于50kg N hm-2a-1[16],氮沉降因而成為森林生態(tài)系統(tǒng)備受關(guān)注的環(huán)境因子,并針對氮沉降對森林土壤甲烷氧化的影響開展了大量工作。但目前多數(shù)研究主要針對CH4氣體吸收通量或吸收動力學這些表觀特征來揭示氮沉降對森林土壤甲烷氧化的影響,對于這一過程中起關(guān)鍵作用的土壤微生物的作用機制研究相對較少,國內(nèi)在這方面的研究更是鮮有報道。參與森林土壤甲烷氧化的微生物主要是甲烷氧化菌(Methanotroph)。甲烷氧化菌是一類以CH4為唯一碳源和能源的細菌,其通過甲烷單加氧酶(Methane monooxygenase,MMO)將CH4首先氧化為甲醇并啟動系列酶將CH4最終代謝成二氧化碳和水[17]。根據(jù)生理生化特征以及對CH4代謝途徑的差異,可將甲烷氧化菌分為type I和type II兩種類型,其分別屬于γ-變形菌綱(γ-Proteobacteria)和α-變形菌綱(α-Proteobacteria)[18]。有關(guān)農(nóng)業(yè)、森林以及濕地土壤等中甲烷氧化菌數(shù)量和群落組成已有較多的研究報道,并發(fā)現(xiàn)土壤甲烷氧化菌的數(shù)量、群落組成及其活性會受土壤pH、濕度、溫度、大氣CH4濃度、植被類型以及施肥等環(huán)境因素的影響[19- 25]。但關(guān)于森林土壤甲烷氧化菌應對氮沉降增加的響應機制的研究相對較少,國內(nèi)更是缺乏相關(guān)報道。國外已有的幾篇報道也主要是通過室內(nèi)的短期施氮培養(yǎng)來研究氮素增加對森林土壤甲烷氧化菌群落組成的影響[26-27],而關(guān)于野外長期氮沉降增加對森林土壤甲烷氧化菌數(shù)量和群落組成的影響仍有待進一步研究。

長白山闊葉紅松混交林是位于我國東北部重要的溫帶森林生態(tài)系統(tǒng)。本研究基于長白山溫帶森林長期氮沉降模擬實驗平臺,采用實時熒光定量PCR和克隆測序以及土壤屬性測定相結(jié)合方法,研究了長期施加不同形態(tài)氮肥后,森林土壤甲烷氧化菌的數(shù)量和群落組成隨季節(jié)變化的特征及其與土壤基質(zhì)屬性的關(guān)系,以期揭示長期氮沉降增加影響溫帶森林土壤甲烷氧化的微生物機制。

1 材料和方法

1.1 土壤采集和理化性質(zhì)的測定

本研究土壤樣品采自長白山闊葉紅松混交林長期氮沉降模擬實驗平臺,該控制實驗始于2006年,位于長白山北坡底部(42°24′N,127°06′E),該地區(qū)屬于典型的受季風影響的溫帶大陸性山地氣候,水熱同期,夏季短暫多雨,冬季寒冷漫長,年平均溫度為2.5—5.5℃,年降水量600—900mm[28-29]。土壤類型為山地暗棕壤,冷涼淋溶土,以火山灰為成土母質(zhì),經(jīng)有機質(zhì)積累和弱酸性淋溶過程形成[30],主要植被有紅松(Pinuskoraiensis)、椴樹、蒙古櫟和水曲柳等。土壤樣品采樣時選擇野外控制實驗中長期施加高劑量(45kg N hm-2a-1)的3種不同形態(tài)氮素((NH4)2SO4、NH4Cl和KNO3)及未施用氮素的處理(對照)為研究對象,每個處理均設(shè)有4個重復小區(qū)；有關(guān)森林剖面土壤屬性和野外施氮控制實驗參見[31-32]。根據(jù)長期積累數(shù)據(jù)規(guī)律以及當?shù)氐臍夂蛱卣鞣謩e在夏季雨熱同期(8月)和秋季干旱期(10月)兩個典型時期采集土壤樣品：每個小區(qū)利用不繡鋼土鉆隨機選取3點采集0—10cm深度的土壤,充分混勻后置于冰盒帶回實驗室處理。將采集的土壤樣品分成兩份,一份隨即以液氮速凍保存于-80℃冰箱,用于分子生物學分析；另一份中存放于4℃用于pH值、銨態(tài)氮、硝態(tài)氮和可溶性有機碳測定。

土壤pH 值的測定采用去離子水以水土比2.5∶1(w/w)浸提,并用Delta 320 pH儀測定；土壤銨態(tài)氮和硝態(tài)氮采用1mol/L KCl溶液,以水土比5∶1(w/w)浸提后,采用連續(xù)流動分析儀(SAN++, SKALAR, the Netherlands)測定；土壤可溶性有機碳采用 0.5mol/L K2SO4溶液,以水土比為5∶1浸提后,通過總有機碳分析儀(Shimadzu TOC-Vcsh/TN, Kyoto, Japan)測定[33]。

1.2 土壤DNA和定量PCR分析

土壤總DNA提取采用MoBio UltracleanTMSoil DNA 試劑盒(San Diego, CA)進行,所有操作依照產(chǎn)品說明書進行,細胞破碎在FastPrep上進行,破碎強度為5.0m/s,時間為45s。所獲得的DNA樣品經(jīng)10倍稀釋后直接用于下游實驗。

以甲烷氧化菌的pmoA基因為靶基因,以pmoA基因的特異引物A189(5′-GGNGACTGGGACTTCTGG和mb661(5′-CCGGMGCAACGTCYTTACC)[34]利用實時熒光定量 PCR 對不同處理土壤中甲烷氧化菌的豐度進行定量分析。定量 PCR的擴增反應使用 SYBR? Premix Ex TaqTM試劑盒(TaKaRa),25μL定量PCR反應體系中包括2×SYBR Premix Ex TaqTM12.5μL,正反向引物(濃度為10μmol/L)各0.5μL,DNA模板2μL,其余用ddH2O補足至25μL。Real-time PCR反應在ICycler IQ 5 thermocycler (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)上運行,其擴增程序如下：94℃預變性5min；94℃變性45s,63℃退火45s,72℃延伸1min,之后每個循環(huán)退火溫度降低1℃,共5個循環(huán)； 94℃變性45s,57℃退火45s,72℃延伸1min,共30個循環(huán)；在83℃收集反應熒光信號,數(shù)據(jù)分析采用iCycler軟件[24]。

1.3 甲烷氧化菌的群落組成分析

甲烷氧化菌的群落組成通過對pmoA基因進行克隆測序分析,pmoA基因普通PCR擴增引物和擴增程序同1.2中的real-time PCR。PCR產(chǎn)物經(jīng)過Wizard SV Gel & PCR Clean-Up System(Promega, USA)試劑盒切膠純化后,連接到pGEM-T Easy Vector上(Promega, Madison, WI, USA),再通過熱擊法將載體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞(TaKaRa, Japan),取轉(zhuǎn)化液涂布到含有氨芐青霉素(Ampicillin)/IPTG/X-Gal的LB (Luria-Bertani)培養(yǎng)基上,37℃下培養(yǎng)16—18h。隨機選取若干白色克隆子,采用菌體擴增方式,用pGEM-T Easy Vector通用引物T7/SP6擴增外源插入片段。通過1%濃度的瓊脂糖凝膠電泳法檢驗含有插入片段的陽性克隆子。

每個克隆文庫隨機挑選30個陽性克隆子進行測序。所獲得的目的基因序列通過ClustalX2,mouthur進行序列分析,按照93%同源劃分可操作分類單元(Operational Taxonomic Units, OTUs)[35],并把正確長度的序列提交NCBI數(shù)據(jù)庫進行Blast序列對比,下載最相似菌種序列作為系統(tǒng)發(fā)育樹的參考序列。通過Clustal W和Mega 5.0建立Neighbor-Joining系統(tǒng)發(fā)育樹,系統(tǒng)發(fā)育樹各分支置信度由自舉分析方法(Bootstrap)檢驗,重復1000次。

1.4 數(shù)據(jù)處理

本研究中的統(tǒng)計分析在SPSS 19.0軟件中進行,其中多組數(shù)據(jù)間的差異分析采用單因素方差分析與多重比較分析(Duncan,P<0.05)；相關(guān)分析采用Spearman相關(guān)分析；克隆文庫數(shù)據(jù)的分析采用Redundancy analysis(RDA)分析樣品間群落組成與不同形態(tài)氮沉降增加下土壤基質(zhì)屬性的關(guān)系,在CANOCO 4.5軟件中進行。

2 結(jié)果

2.1 土壤理化性質(zhì)

表1 土壤基本理化屬性(平均數(shù)±標準誤差)

平均數(shù)±標準誤差；同列相同小寫字母a分別表明夏季和秋季土壤性質(zhì)在不同處理之間無顯著性差異,同列大寫字母A, B表明不同處理之間土壤性質(zhì)的顯著差異性(P<0.05)

2.2 甲烷氧化菌的數(shù)量及其與土壤基質(zhì)特性之間的關(guān)系

圖1 夏季和秋季不同施肥處理間土壤甲烷氧化菌pmoA 基因豐度Fig.1 The abundance of soil methanotrophic pmoA gene under different nitrogenous compound amendments in Summer (August) and Fall (October)小寫字母a：pmoA基因豐度在夏季(8月)雨熱同期時期各處理之間差異無顯著性；大寫字母A, B：pmoA基因豐度在秋季(10月)干旱期各處理之間的有差異顯著性(P < 0.05)

2.3 甲烷氧化菌的群落組成

圖2 夏季和秋季施氮處理樣地甲烷氧化菌群落組成的變化Fig.2 The community composition of methanotroph under different nitrogenous compound amendments in Summer (August) and Fall (October)CK：對照組,未施氮處理；HS：施加硫酸銨,(NH4)2SO4處理；HCl：施加氯化銨,NH4Cl處理；HK：施加硝酸鉀,KNO3處理

通過克隆測序技術(shù),對甲烷氧化菌的群落組成進行了分析。對兩個季節(jié)所采集的樣品一共構(gòu)建了32個pmoA基因克隆文庫,每個克隆文庫隨機挑取約30個克隆子進行測序,共獲得742條有效序列。在93%的序列相似水平上,甲烷氧化菌pmoA基因序列一共被劃分為112個OTU,在系統(tǒng)發(fā)育樹上形成2個主要分支,分別對應Type I型(磷酸核酮糖氧化途徑)和Type Ⅱ型(絲氨酸氧化途徑)甲烷氧化菌,如圖3所示。其中,屬于Type I型的序列可進一步形成4個分支,參考Kolb等人[36]的分類經(jīng)驗,研究將這4個分支命名為：Methylobacter-group (Type I)、Methylococcus-group (Type I)、Methylohalobius-group (Type I)和upland soil cluster γ(Type I)。其中,upland soil cluster γ(Type I) 序列主要來自于旱地土壤和森林土壤[19,36],但本研究的供試樣品只檢測到Methylobacter-group (Type I)和Methylococcus-group (Type I),未檢測到upland soil cluster γ(Type I)和Methylohalobius-group (Type I)的序列,可能由引物的偏差所致(圖3)。屬于Type II的序列也形成兩個小分支,即Methylosinus-group (Type II)和Methylocapsaspp. (Type II)(圖3),于供試土壤樣品中均被檢測到。

圖3 甲烷氧化菌pomA 基因系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of methanotroph pomA gene sequences CK8(10)：8(10)月份對照,CK土壤樣品；HS8(10)：8(10)月份施加硫酸銨,(NH4)2SO4處理土壤樣品；HCl8(10)：8(10)月份施加氯化銨,NH4Cl處理土壤樣品；HK8(10)：8(10)月份施加硝酸鉀,KNO3處理土壤樣品；分號后的數(shù)字：OTU的序號；括號里的數(shù)字：該處理代表OTU的序列條數(shù)

對pmoA基因為代表的甲烷氧化菌微生物群落組成和土壤基本屬性進行冗余分析(Redundancy analysis, RDA),結(jié)果顯示甲烷氧化菌群落組成與鹽浸提有機碳/礦質(zhì)氮比值呈顯著正相關(guān)關(guān)系(r=0.49,P<0.05),與土壤濕度和pH值無相關(guān)性(圖4)。此外,RDA分析結(jié)果顯示夏季(8月)樣品和秋季(10月)樣品被RDA Axis 1軸分開,表明采樣時間即季節(jié)變化對甲烷氧化菌的群落組成有顯著影響(PerMANOVA,P< 0.1, 圖4)。

圖4 甲烷氧化菌群落組成與環(huán)境因子的RDA分析Fig.4 Redundancy analysis (RDA) between methanotroph community and environmental variables 空心圖標：8月份土壤樣品；實心圖標：10月份土壤樣品；○：8月份對照,CK土壤樣品；□：8月份施加硫酸銨,(NH4)2SO4處理土壤樣品；△：8月份施加氯化銨,NH4Cl處理土壤樣品；▽：8月份施加硝酸鉀,KNO3處理土壤樣品；●：10月份對照,CK樣品；■：10月份施加硫酸銨,(NH4)2SO4處理土壤樣品；▲：10月份施加氯化銨,NH4Cl處理土壤樣品；▼：10月份施加硝酸鉀,KNO3處理土壤樣品

3 討論

3.1 甲烷氧化菌的數(shù)量對不同形態(tài)氮沉降增加的響應

3.2 甲烷氧化菌的組成對不同形態(tài)氮沉降增加的響應

根據(jù)甲烷氧化菌的生理生化特征以及對CH4代謝途徑和親和力的差異,可將甲烷氧化菌分為Type I型和Type II型兩種類型,分別屬于γ-Preoteobacteria和α-Preoteobacteria綱；Type I型甲烷氧化菌通過磷酸核酮糖途徑氧化CH4,對CH4親和力低,但具有較強的繁殖能力,屬于r-策略者[44],其常見類群包括：甲基單胞菌屬(Methylomonas)、甲基球菌屬(Methylococcs)等；而Type Ⅱ型利用絲氨酸途徑氧化CH4,對CH4的親和力高,屬于k-策略者,包括甲基彎曲菌(Methylosinus)和甲基孢囊菌屬(Methylocystis)等；此外,人們將類似于Type I型莢膜甲基球菌(Methylococcuscapsulatus)的甲烷氧化菌定義為X型,其代謝途徑與Type I型相同[17-18,45]。本研究中檢測到的pmoA基因序列分為Type I型和Type Ⅱ型兩類甲烷氧化菌,主要以Type I型甲烷氧化菌為主,其相對比例大于70%(圖2),造成這種現(xiàn)象的原因可能是：Type I型甲烷氧化菌在低CH4高氧氣環(huán)境中為優(yōu)勢種群,而Type Ⅱ型甲烷氧化菌則在高CH4低氧氣環(huán)境中起主導作用[46]。此外,已有的研究發(fā)現(xiàn)Type I型甲烷氧化菌對土壤環(huán)境要求較苛刻,而Type Ⅱ型甲烷氧化菌有較強的生存能力,因此施氮過程會較大程度影響Type I型甲烷氧化菌的活性和群落組成,而對Type Ⅱ型甲烷氧化菌的群落組成無顯著影響[2,47]。

3.3 季節(jié)變化對甲烷氧化菌響應氮素輸入的影響

RDA分析結(jié)果表明森林土壤鹽浸提有機碳/礦質(zhì)氮比值與甲烷氧化菌群落組成呈顯著相關(guān)性,再次印證不同施氮處理是導致甲烷氧化菌群落組成差異的主要因素。此外,RDA結(jié)果顯示夏季(8月)樣品和秋季(10月)樣品被RDA Axis 1軸分開,表明甲烷氧化菌的群落組成在不同季節(jié)有明顯變化,與該樣地中甲烷通量隨季節(jié)變化的趨勢和之前有關(guān)季節(jié)和溫度變化顯著影響甲烷氧化菌的群落組成和甲烷的產(chǎn)生與氧化能力的研究報道一致[8,20,32]。但本研究中施氮處理對甲烷氧化菌的豐度和群落組成的影響在夏季不顯著,而在秋季均表現(xiàn)出明顯影響。長白山闊葉紅松混交林地屬于溫帶大陸季風型氣候,夏季平均溫度保持在25℃左右,而秋季平均溫度在5—15℃范圍內(nèi)[32]。雖然嗜熱性甲烷氧化菌相繼被發(fā)現(xiàn)[48-49],但多數(shù)甲烷氧化菌生長的適宜溫度在20—30℃之間。長白山地區(qū)夏季較適宜的溫度更有利于甲烷氧化菌的生長和活性,該影響可能超過施氮本身的影響,從而使得其對長期施氮的響應不顯著。此外,也有不少研究表明,氮肥施用可通過促進植物生長促進根系分泌更多碳源供給甲烷氧化菌從而促進甲烷氧化能力[50-51]；夏季植物生長旺盛對氮肥的吸收利用較快,從而減弱了氮肥對土壤中甲烷氧化菌的抑制作用。

4 結(jié)論

本研究對長期施加不同形態(tài)氮素模擬沉降增加條件下溫帶森林土壤中甲烷氧化菌的數(shù)量和群落組成的季節(jié)性演變特征及其與土壤基質(zhì)屬性的耦合關(guān)系進行研究,結(jié)果表明,夏季不同施氮處理對甲烷氧化菌pmoA基因豐度無顯著性差異,而秋季施加NH4Cl和(NH4)2SO4處理降低甲烷氧化菌的豐度。無論夏季和秋季,施加不同形態(tài)氮的土壤中甲烷氧化菌均以適應低CH4但有氧環(huán)境的Type I型為主(相對豐度在70.6%—85.4%之間),作為I型甲烷氧化菌的優(yōu)勢類群,Methylobacter-group (Type I)占Type I型的55.1%—91.7%,在夏季不同形態(tài)氮處理間無顯著差異,但在秋季施加(NH4)2SO4和NH4Cl處理中顯著低于對照處理。長白山地區(qū)夏季較適宜的溫度更有利于甲烷氧化菌的生長,以及夏季植物生長旺盛為甲烷氧化菌提供更多碳源,從而使得施氮對甲烷氧化菌的影響不如秋季顯著。這些結(jié)果解釋了以往觀測到的施銨態(tài)氮肥顯著降低秋季林地甲烷凈吸收通量,而在夏季無顯著影響的觀測結(jié)果,一定程度上揭示了氮沉降影響森林土壤甲烷氧化季節(jié)性差異的潛在的微生物機制。

致謝：中國科學院大氣物理研究所王迎紅博士、吳浩浩同學幫助樣品采集和土壤性質(zhì)分析測定,中國科學院微生物研究所鄭勇博士和中國科學院生態(tài)環(huán)境研究中心王雅琪同學幫助微生物分析，特此致謝。

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