林丹義，張科平，許 潔，顏黎栩，駱新蘭，劉艷輝

近年，隨著眾多與疾病診斷、預(yù)后及治療相關(guān)的分子標(biāo)志物的出現(xiàn)，以石蠟組織DNA為材料進(jìn)行分子水平的基因檢測(cè)及篩查已成為臨床診斷及相關(guān)研究的常規(guī)手段。對(duì)于各種基因分析而言，重要的是能夠獲得足夠純度和數(shù)量的DNA[1]。DNA提取是分子生物學(xué)研究的一項(xiàng)基礎(chǔ)技術(shù)，其提取的質(zhì)量好壞及數(shù)量的多少直接影響到分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的開(kāi)展[2]。目前病理科所使用的DNA大部分為人工提取，使用全自動(dòng)核酸提取儀提取DNA者占極少數(shù)。因此，本實(shí)驗(yàn)由兩名分子實(shí)驗(yàn)室技術(shù)員獨(dú)立完成對(duì)全自動(dòng)核酸提取儀與手動(dòng)提取核酸進(jìn)行提取DNA效率的驗(yàn)證比較。

1 材料與方法

1.1材料隨機(jī)選取廣東省人民醫(yī)院病理科存檔的10例具有代表性的福爾馬林固定石蠟包埋組織標(biāo)本，包括手術(shù)標(biāo)5例，小標(biāo)本5例；腫瘤組織8例，非腫瘤組織2例。

1.2試劑與儀器石蠟標(biāo)本DNA提取試劑盒QIAamp DNA FFPE Tissue Kit購(gòu)于德國(guó)Qiagen公司，水浴鍋(上海一恒科技公司)，低溫離心機(jī)(Thermo Fisher Scientific)，QIAcube全自動(dòng)核酸提取儀(Qiagen公司)，Nanodrop 2000超微量分光光度計(jì)(Thermo Fisher Scientific)。

1.3方法每例連續(xù)切片21張，5 μm厚，編號(hào)1～21，其中編號(hào)為雙號(hào)切片用于手動(dòng)DNA提取，單號(hào)切片用于全自動(dòng)核酸提取儀提取。編號(hào)21玻片要求HE染色質(zhì)控。切片貼于干凈的載玻片上，置于75 ℃烤箱烤30 min。二甲苯脫蠟至水后，按照HE染色所選取的腫瘤區(qū)域，小心地用無(wú)菌刀片將組織刮入1.5 mL EP管中。加入200 μL Buffer ATL和20 μL蛋白酶K，吹打混勻，置于56 ℃的水浴鍋中消化過(guò)夜。

1.3.1手動(dòng)DNA提取 將過(guò)夜消化的組織從水浴鍋中取出，加入200 μL Buffer AL震蕩混勻，置于70 ℃水浴鍋孵育10 min，再加入200 μL無(wú)水乙醇充分吹打混勻，小心地轉(zhuǎn)移至2 mL吸附柱中，8 000 r/min離心1 min，棄去廢液，更換收集管；加入500 μL Buffer AW1，8 000 r/min離心1 min，棄去廢液，更換收集管；加入500 μL Buffer AW2，8 000 r/min離心1 min，棄去廢液，更換收集管；將吸附柱轉(zhuǎn)移至干凈的收集管中，真空離心12 000 r/min×3 min；將柱子轉(zhuǎn)移至干凈的1.5 mL EP管中，加入30 μL RNase Free H2O于膜中央，室溫孵育3 min，8 000 r/min離心1 min，收集產(chǎn)物。

1.3.2全自動(dòng)核酸提取儀DNA提取 首先選擇所需要的程序，根據(jù)程序的指引放置相應(yīng)的tip槍頭，放好DNA提取試劑，根據(jù)提示spin column和收集管置于適配器上，將前面所述的過(guò)夜裂解物放置在樣本架上，確認(rèn)每一步操作均無(wú)誤后，關(guān)閉QIADcube門(mén)，運(yùn)行程序。運(yùn)行結(jié)束時(shí)，在觸摸屏上會(huì)顯示一個(gè)信息，確認(rèn)樣品已被處理，從轉(zhuǎn)子適配器中取出含已純化核酸的離心管。

1.4DNA濃度及純度測(cè)定使用Nanodrop 2000超微量分光光度計(jì)檢測(cè)DNA的濃度及純度，分別記錄濃度及OD260/OD280。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析全部數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)用單因素方差分析。

2 結(jié)果

本組實(shí)驗(yàn)由兩名操作者進(jìn)行驗(yàn)證，操作者1手動(dòng)提取DNA的總量為13 628.5±4 902.7，使用全自動(dòng)核酸提取儀提取DNA的總量為9 121±3 264.3；操作者2手動(dòng)提取DNA的總量為8 073.5±2 743.6，使用全自動(dòng)核酸提取儀提取DNA的總量為6 181.5±2 135。上述結(jié)果提示，與手動(dòng)提取DNA相比，全自動(dòng)核酸提取儀提取DNA總量均較低，兩者相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P1=0.037，P2=0.030)。不同人員操作的全自動(dòng)核酸提取儀提取的DNA總量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.061)。不同人員手動(dòng)提取的DNA總量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.032)。OD260/OD280的比值波動(dòng)范圍保持在1.7～2.2。

3 討論

近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，分子病理學(xué)應(yīng)運(yùn)而生，現(xiàn)已成為病理學(xué)科發(fā)展的重要方向。隨著現(xiàn)代醫(yī)療模式進(jìn)入個(gè)體化時(shí)代，許多遺傳病、傳染病及腫瘤的治療已采用這一模式，如腫瘤的分子靶向治療就是個(gè)體化醫(yī)療最好的體現(xiàn)。目前能進(jìn)行靶向治療的腫瘤種類越來(lái)越多，如淋巴瘤、乳腺癌、結(jié)直腸癌、肺癌、胃癌、胃腸間質(zhì)瘤、惡性黑色素瘤等，其基礎(chǔ)就是建立在準(zhǔn)確的腫瘤分子病理診斷上。影響分子病理診斷質(zhì)量的因素有很多，歸納起來(lái)主要有標(biāo)本質(zhì)量、分子病理實(shí)驗(yàn)室建設(shè)、實(shí)驗(yàn)室技術(shù)員、病理醫(yī)師的培訓(xùn)和分子病理診斷的規(guī)范化等。提取高濃度和高質(zhì)量的DNA是臨床分子病理檢測(cè)的基本保證，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，對(duì)福爾馬林固定石蠟包埋組DNA提取的也要求越來(lái)越高，要求所提取的DNA濃度及純度都要滿足快速發(fā)展的分子病理檢測(cè)[3]。

目前，國(guó)內(nèi)有許多文獻(xiàn)報(bào)道關(guān)于DNA提取方法的改進(jìn)，如一步消化法、脫蠟消化法、試劑盒法等[4-5]。這些方法的改進(jìn)僅限于手動(dòng)提取DNA，而對(duì)于全自動(dòng)核酸提取儀提取DNA的效率驗(yàn)證則極少有相關(guān)報(bào)道。本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，人工提取的DNA質(zhì)量要高于全自動(dòng)核酸提取儀提取的DNA質(zhì)量，而不同人員操作全自動(dòng)核酸提取儀所得到的DNA質(zhì)量無(wú)明顯差異，不同人員手動(dòng)提取的DNA質(zhì)量差異明顯，原因可能是手動(dòng)提取的DNA由于每個(gè)人的操作習(xí)慣及熟練程度不同，導(dǎo)致誤差較大，使得提取的DNA質(zhì)量差別較大，而全自動(dòng)核酸提取儀由于人為因素參與較少，客觀性較強(qiáng)，所以每次提取的DNA質(zhì)量較穩(wěn)定，差異不明顯。但是，無(wú)論是手動(dòng)提取的DNA還是全自動(dòng)核酸提取儀提取的DNA，其OD260/OD280均保持在1.7～2.2之間，符合石蠟標(biāo)本PCR檢測(cè)的要求。全自動(dòng)核酸提取儀提取DNA的優(yōu)勢(shì)在于即使不同人員操作儀器，提取的DNA質(zhì)量及純度都比較穩(wěn)定，且避免了手工提取過(guò)程中人為的失誤及人力投入；缺點(diǎn)則在于提取的DNA質(zhì)量比手動(dòng)提取的效率低，小標(biāo)本組織的DNA含量本身就低，經(jīng)全自動(dòng)核酸提取儀提取后DNA質(zhì)量過(guò)低，可能會(huì)造成標(biāo)本無(wú)法用于分子病理檢測(cè)；而手動(dòng)提取DNA的優(yōu)勢(shì)則在于提取的DNA質(zhì)量高，用時(shí)短，對(duì)于DNA含量低的標(biāo)本可以人為地調(diào)節(jié)純化體積，從而提高DNA的質(zhì)量，更利于臨床小標(biāo)本的分子病理檢測(cè)；缺點(diǎn)在于不同人員提取的DNA質(zhì)量差異明顯，不確定性比較大。手工操作與每個(gè)操作者的熟練程度和細(xì)心程度密切相關(guān)。儀器檢測(cè)更客觀、一致，更易標(biāo)準(zhǔn)化[6]。

全自動(dòng)核酸提取儀和手動(dòng)核酸提取均有各自的優(yōu)缺點(diǎn)，每個(gè)病理科分子實(shí)驗(yàn)室應(yīng)該根據(jù)自身實(shí)驗(yàn)室的實(shí)際條件進(jìn)行選擇最合適的方式，提取符合PCR要求的DNA，確保各項(xiàng)分子病理檢測(cè)順利進(jìn)行。

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