胡西洲，彭西甜，周有祥，趙明明，嚴(yán) 偉，龔 艷，胡定金

（湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，湖北 武漢 430064）

頂空固相微萃取-氣相色譜/質(zhì)譜法結(jié)合保留指數(shù)法測(cè)定龍井茶的香氣成分

胡西洲，彭西甜，周有祥，趙明明，嚴(yán) 偉，龔 艷，胡定金

（湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，湖北 武漢 430064）

采用頂空固相微萃?。╤eadspace solid phase micro-extraction，HS-SPME）和氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）結(jié)合保留指數(shù)法分析龍井中的揮發(fā)性成分。以茶葉香氣成分的種類和數(shù)量為參照，考察HS-SPME的最佳萃取條件；同時(shí)優(yōu)化色譜分離條件；利用優(yōu)化的HS-SPME-GC/MS條件分析龍井茶中的揮發(fā)性成分。結(jié)果表明，運(yùn)用HS-SPME-GC/MS能有效測(cè)定龍井茶中的揮發(fā)性成分，這些揮發(fā)性成分中主要含有醇類（31.14%）、酯類（15.66%）、酮類（10.42%）、雜環(huán)類化合物（15.00%）等。頂空固相微萃取-氣相色譜質(zhì)譜法結(jié)合保留指數(shù)分析是一種快速有效分析龍井茶香氣成分的方法，可提高定性分析的準(zhǔn)確性和效率，使定性結(jié)果更加可靠。該定性分析方法也為其他復(fù)雜樣品中揮發(fā)性成分分析提供參考。

頂空固相微萃?。粴庀嗌V/質(zhì)譜；保留指數(shù)法；龍井茶；香氣成分

0 引 言

茶葉香氣成分是鑒別茶葉品質(zhì)的重要指標(biāo)，受到業(yè)界的廣泛關(guān)注。茶葉香氣是茶鮮葉在制作過程中通過復(fù)雜的生化反應(yīng)而產(chǎn)生的，香氣成分的組成、含量與不同的茶樹品種、栽培環(huán)境、加工工藝、茶葉儲(chǔ)存時(shí)間、溫度等息息相關(guān)。任何一種茶葉的香氣都是由不同物質(zhì)以不同濃度組合的綜合表現(xiàn)，而呈香物質(zhì)間的相互作用也會(huì)對(duì)整體香型有顯著的影響[1]。

據(jù)統(tǒng)計(jì)，已從各類茶葉中分離出700多種香氣成分，主要包括醇類、酯類、醛類、酮類、酸類、酚類、雜環(huán)化合物、含硫化合物、含氮化合物、碳?xì)浠衔锏?0大類化合物[1-2]。茶葉香氣通常由感官技術(shù)來評(píng)價(jià)，盡管GB/T 23776——2009《茶葉感觀評(píng)審方法》已對(duì)其作了詳細(xì)規(guī)定，但評(píng)審結(jié)果容易受評(píng)審人員主觀判斷的影響。隨著現(xiàn)代儀器分析飛速發(fā)展，準(zhǔn)確分析茶葉代謝物指紋圖譜，結(jié)合各種化學(xué)計(jì)量方法，已成為茶葉香氣組分鑒定和品質(zhì)預(yù)測(cè)的重要手段[3-5]。

保留指數(shù)（retention index，RI）是由 Kovats于1958年首次提出，該指標(biāo)反映了化合物與固定相間相互作用，作為一種穩(wěn)定的色譜定性參數(shù)，具有很好的準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性，可用于化合物的鑒定[6-7]。

龍井茶作為中國(guó)十大名茶之一，有著1200多年歷史，按照傳統(tǒng)工藝在地理標(biāo)志產(chǎn)品保護(hù)范圍內(nèi)加工而成，是一種具有“色綠、香郁、味醇、形美”的扁形綠茶[8]。本研究采用頂空固相微萃取（headspace solid phase micro-extraction，HS-SPME）和氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）結(jié)合保留指數(shù)法快速分析龍井茶香氣成分的方法，通過與譜庫檢索進(jìn)行有效結(jié)合，提高了定性分析的準(zhǔn)確性和可靠性。

1 儀器與材料

1.1 儀器

7890N-5975型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)Agilent公司）；手持固相微萃取器，配50/30 μm CAR/ DVB/PDMS、100 μm PDMS、65 μm PDMS/DVB萃取頭 （美國(guó)Supelco公司）；PC-420D恒溫?cái)?shù)顯磁力攪拌器（美國(guó)Corning公司）。

1.2 試劑

正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)品（C8～C32，美國(guó)Supelco公司）；癸酸乙酯（98%，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

1.3 試驗(yàn)材料

龍井茶樣品采自杭州西湖龍井茶核心區(qū)。樣品經(jīng)粉碎后過20目篩，密封保存，待測(cè)。

2 方 法

2.1 GC-MS分析條件

GC條件：進(jìn)樣口溫度為230℃；載氣為高純氦氣（純度99.999%）：柱流量為1.0mL/min；不分流進(jìn)樣。

程序溫度1：首先以50℃保持5min；以3℃/min的速率升溫至125℃，保持3min；再以2℃/min的速率升溫至180℃，保持3 min；再以15℃/min的速率升溫至230℃。

程序溫度2：首先以70℃保持1min；以3℃/min的速率升溫至120℃，保持2min；再以5℃/min的速率升溫至180℃，保持20min。

程序溫度3：首先以40℃保持2min；以2℃/min的速率升溫至185℃；再以5℃/min的速率升溫至210℃，保持40min。

程序溫度4：首先以40℃保持1min；以2.5℃/min的速率升溫至130℃，保持1min；再以8℃/min的速率升溫至250℃，保持1min。

程序溫度5：首先以50℃保持5min；以3℃/min的速率升溫至125℃，保持3min；再以2℃/min的速率升溫至180℃，保持3 min；最后15℃/min的速率升溫至230℃，保持5min。

MS條件：電子電離源（EI）；離子化電壓為70eV；離子源溫度為200℃；四級(jí)桿溫度為150℃；接口溫度為280℃；質(zhì)譜掃描范圍為35～450amu。

2.2 SPME操作方法

準(zhǔn)確稱取1.0 g經(jīng)粉碎后茶葉于15 mL的頂空瓶中，加入20 μL 10 mg/L癸酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)溶液，再加入10mL沸水，密封，60℃水浴下磁力攪拌萃取，再將已經(jīng)老化的CAR/DVB/PDMS萃取頭穿透密封墊插入頂空瓶?jī)?nèi)茶湯上方，固定好SPME手柄，小心推出纖維頭開始萃取并計(jì)時(shí)，60min后取出，然后插入氣相色譜進(jìn)樣口，在230℃下熱解吸5min。

2.3 定性與定量分析方法

定性：1）各組分峰與NIST12.L譜庫中標(biāo)準(zhǔn)化合物的匹配度；2）化合物的保留指數(shù)；3）查閱香氣成分的相關(guān)文獻(xiàn)。定量：利用面積歸一法計(jì)算得到各組分的相對(duì)含量。

2.4 保留指數(shù)的測(cè)定

單一線性程序升溫的條件下保留指數(shù)計(jì)算式為

式中：RI——待測(cè)組分的保留指數(shù)；

RTunknown——待測(cè)組分的保留時(shí)間；

RTn、RTn+1——待測(cè)組分前后正構(gòu)烷烴的保留時(shí)間；

n——正構(gòu)烷烴的碳原子數(shù)。

3 結(jié) 果

3.1 固相微萃取條件的優(yōu)化

3.1.1 固相萃取涂層的選擇

比較了3種萃取頭對(duì)龍井茶中揮發(fā)性成分的萃取效果，試驗(yàn)結(jié)果表明，PDMS萃取涂層由于適用于小分子非極性揮發(fā)性化合物，萃取效果最差。PDMS/DVB萃取涂層則適用于萃取極性揮發(fā)性物質(zhì)，萃取效果較好。CAR/DVB/PDMS萃取頭結(jié)合了以上兩種萃取頭的優(yōu)點(diǎn)，具有更好的萃取效果，因此選擇萃取頭CAR/DVB/PDMS作為龍井茶香氣成分的萃取材料。

3.1.2 萃取溫度的優(yōu)化

萃取溫度是影響萃取速度的重要指標(biāo)，當(dāng)溫度升高時(shí)有利于提高分析物的擴(kuò)散速率，從而增加萃取速率；而萃取溫度過高會(huì)降低分析物的分配系數(shù)，因此選取40，50，60，70，80℃進(jìn)行萃取。結(jié)果如圖1所示：隨著萃取溫度增加，峰數(shù)和峰面積均逐漸增加，當(dāng)萃取溫度達(dá)到60℃時(shí)峰面積達(dá)到最大，隨著溫度進(jìn)一步增加，解吸附速率增加，總峰面積開始降低，選擇60℃作為萃取溫度。

圖1 萃取溫度對(duì)峰數(shù)和峰面積的影響

3.1.3 萃取時(shí)間的優(yōu)化

萃取時(shí)間是指達(dá)到或接近平衡所需要的時(shí)間，在萃取的初始階段，待分析組分很快富集到固相微萃取的纖維頭上，但是隨著萃取時(shí)間的延長(zhǎng)，富集速度越來越慢。比較了萃取時(shí)間分別為20，30，40，50， 60，70，80min時(shí)的萃取效果，結(jié)果如圖2所示：隨著萃取時(shí)間增加，峰數(shù)和峰面積均逐漸增加，當(dāng)萃取時(shí)間達(dá)到60min后峰面積變化很小，選擇60min作為萃取時(shí)間。

圖2 萃取時(shí)間對(duì)峰數(shù)和峰面積的影響

3.1.4 解吸附條件的優(yōu)化

萃取完成后將萃取頭置于氣質(zhì)聯(lián)用儀的進(jìn)樣口分別解吸附1，3，5，7，9min，比較不同解吸附時(shí)間下龍井茶揮發(fā)性成分的變化情況。結(jié)果表明，解吸附時(shí)間為5 min時(shí)，各揮發(fā)性物質(zhì)的峰面積達(dá)到最大，而后增加解吸附時(shí)間，峰面積不會(huì)增加且峰型變差。選擇5min作為解吸附時(shí)間。

3.2 色譜分離條件的優(yōu)化

選用一根30 m長(zhǎng)的DB-5MS毛細(xì)管柱對(duì)龍井茶揮發(fā)性成分進(jìn)行分離，探討不同的升溫程序?qū)Ψ蛛x效果的影響，同時(shí)考慮色譜分離時(shí)間的問題，分離時(shí)間過長(zhǎng)對(duì)于色譜定量和分析效率會(huì)有一定的負(fù)面影響。

按照2.1中溫度程序考察色譜分離效果。通過分析，確定溫度程序5是比較適合的溫度程序，龍井茶揮發(fā)性組分分離相對(duì)較好，如圖3所示。

3.3 龍井茶揮發(fā)性成分的測(cè)定

采用頂空固相微萃取模式，對(duì)杭州核心區(qū)的龍井樣品的香氣成分進(jìn)行分析，對(duì)各色譜峰進(jìn)行譜庫檢索，并根據(jù)混合正構(gòu)烷烴和色譜峰的保留時(shí)間計(jì)算各組分的保留指數(shù)。根據(jù)譜庫檢索結(jié)果，結(jié)合參考文獻(xiàn)的保留指數(shù)值對(duì)龍井樣品的香氣成分進(jìn)行了鑒定，共得到49種化合物，再運(yùn)用面積歸一化法得到各組分的百分含量，結(jié)果見表1。由結(jié)果分析可知，龍井樣品的香氣成分十分復(fù)雜，且相對(duì)含量差異較大，主要包括烯烴類 （5.22%）、醇類 （31.44%）、酯類（15.66%）、醛類 （6.82%）、酮類 （10.42%）、酚類（7.18%）、胺類（3.55%）、烷烴類（4.46%）、芳香烴類（0.55%）和雜環(huán)類化合物（15.00%），其中醇類、酯類、雜環(huán)類化合物含量占主導(dǎo)地位。

表1 龍井茶香氣成分分析結(jié)果1）

圖3 程序升溫5測(cè)得龍井茶香氣成分總離子流圖

在已鑒定的香氣組分中排名前5位的分別為：芳樟醇（13.68%）、甲氧基苯基肟（11.14%）、(Z)-3-己烯醇己酸酯（7.19%）、4-氨基-2-甲基苯酚（6.27%）、3,5-辛二烯-2-酮（5.23%）。芳樟醇及其氧化物是所有組分中含量最高，總量達(dá)到17.23%。芳樟醇、2-乙基己醇、1-辛烯-3-醇、香葉醇是主要醇類化合物，相對(duì)含量分別為13.68%、4.41%、3.89%、3.03%。順-3-己烯醇-己酸酯、順-3-己烯醇-丁酸酯、順-3-己烯醇-乙酸酯為酯類化合物中主要呈香物質(zhì)，含量分別為7.19%、2.67%和2.37%。順-3-己烯醇-己酸酯具有強(qiáng)烈彌散性梨香。另外，含量較高的有帶有紫羅蘭香氣的β-紫羅酮（1.09%）、茉莉花香型的茉莉酮（2.44%）。此外，如檸檬烯（0.10%）、α-松油醇（0.40%）、α-紫羅酮（0.13%）、己酸-（E）-2-己醇酯（0.20%）含量相對(duì)較少，但含量少的物質(zhì)未必對(duì)其香氣的貢獻(xiàn)一定小，任何香氣都是由不同組成和含量的化合物及其相互間作用共同體現(xiàn)[1-3，9]。

4 結(jié)束語

本文以西湖核心區(qū)域的龍井茶為研究對(duì)象，利用HS-SPME和GC/MS結(jié)合保留指數(shù)法快速準(zhǔn)確分析其揮發(fā)性香氣成分，分析結(jié)果具有較高的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性，顯示出較大的優(yōu)越性。該方法彌補(bǔ)了常規(guī)GC-MS譜庫檢索定性或者通過保留指數(shù)定性方法的不足，將譜庫檢索與保留指數(shù)結(jié)合，提高了復(fù)雜化合物定性分析的準(zhǔn)確性和效率，使定性結(jié)果更加可靠。該分析方法也為其他復(fù)雜樣品中揮發(fā)性成分分析提供參考。由于茶葉香氣組分的組成和含量與茶樹品種、栽培環(huán)境、加工工藝、茶葉儲(chǔ)存時(shí)間、溫度等密切相關(guān)，下一步將利用此分析方法結(jié)合統(tǒng)計(jì)學(xué)手段圍繞不同區(qū)域、不同保存條件、時(shí)間和摻偽開展茶葉香氣成分的指紋圖譜研究。

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（編輯：莫婕）

Determination of aroma components from Longjing tea by headspace solid phase micro-extraction and GC-MS combined with retention index

HU Xizhou，PENG Xitian，ZHOU Youxiang，ZHAO Mingming，YAN Wei，GONG Yan，HU Dingjin
（Institute of Agricultural Quality Standards and Testing Technology Research，Hubei Academy of Agricultural Sciences，Wuhan 430064，China）

A headspace solid phase microextraction-gas chromatography/mass spectrometry（HSSPME-GC/MS）method combined with retention index was used to analyze aroma components from Longjing tea.The optimal extract conditions were evaluated according to the kinds and amounts of aroma compounds from Longjing tea，and the chromatographic separation conditions were also investigated.Under the optimal conditions，aroma components from Longjing tea were identified by mass spectral library searching combined with retention index comparison.The results showed that the HS-SPME-GC/MS method could identify aroma components from Longjing tea effectively，mainly including alcohols(31.14%)，esters(15.66%)，ketones(10.42%)，and heterocyclic compounds(15.00%). This method is a fast，accurate，effective way to obtain aroma components from Longjing tea，which will facilitate qualitative analysis，and provide reference for analysis of volatile components from other complex samples.

HS-SPME；GC-MS；retention index；Longjing tea；aroma components

A

：1674-5124（2017）02-0055-05

10.11857/j.issn.1674-5124.2017.02.011

2016-07-29；

：2016-09-28

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（S201203046）；湖北農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心項(xiàng)目（2016-620-000-001-037）

胡西洲（1979-），男，湖北監(jiān)利縣人，副研究員，博士，主要從事農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估工作。

胡定金（1964-），男，湖北團(tuán)風(fēng)縣人，研究員，主要從事農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估研究。